Name: 使用Cell-基板阻抗和活细胞成像，以衡量矩阵修改诱导实时变化的细胞粘附和去粘附 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习使用细胞-基质阻抗和活细胞成像技术实时量化内皮细胞的细胞粘附与去粘附动态变化。该方法可无标记、高时间分辨率地监测基质修饰诱导的快速细胞行为改变。

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本工作由国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助 568721（SRT）以及新南威尔士大学医学院研究基金（MDR）部分资助。

1. 内皮细胞常规培养
<ol>
	<li>在明胶包被的组织培养瓶（用含0.1% w/v明胶的PBS在室温下孵育15分钟）中，使用EGM-2培养基（含EGM-2 BulletKit提供的5%胎牛血清、生长因子及厂家提供的所有补充成分，但不含氢化可的松）培养牛主动脉内皮细胞（第4–9代）。</li>
	<li>当细胞接近汇合（以1:4比例传代后约3天）时，使用含0.05%（w/v）胰蛋白酶和0.02%（w/v）EDTA的PBS溶液在37 °C处理细胞以收集。待大部分细胞脱落后，加入完全EGM-2培养基以终止胰蛋白酶消化，随后离心（100 × g，5分钟）。</li>
	<li>为研究准备细胞 从头合成 内皮细胞在纤连蛋白上的黏附（实验1：第2节），以及已在此基质上形成稳定黏附的内皮细胞的去黏附过程（实验2：第3节）。
	<ol>
		<li>用含1% w/v牛血清白蛋白（BSA）的无血清Medium 199洗涤收获的细胞一次，重新离心（100 × g，5 min）。</li>
		<li>在含1%（w/v）BSA的无血清Medium 199培养基中重悬细胞，细胞密度为2.5 × 10⁶5 细胞/ml（细胞-基质阻抗测量）或 5 × 105 细胞/ml（活细胞成像分析），使用前于37 °C培养。 
		注意：细胞的黏附反应对温度差异极为敏感（例如， 由于对流效应，以下实验步骤中用于处理和培养细胞的所有设备和溶液均应保持在恒定的37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验1：定量分析 从头合成 内皮细胞在天然及MPO氧化纤连蛋白上的黏附（细胞-基质阻抗）
注意：实验1旨在研究髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化在多大程度上损害其支持悬浮内皮细胞从头黏附的能力。
<ol>
	<li>将纤连蛋白包被到96孔金质细胞-基质阻抗微电极阵列上。每孔加入80 μl含5 μg/ml纯化牛纤连蛋白的PBS溶液，在37 °C孵育2小时后移除溶液。</li>
	<li>将包被有纤连蛋白的表面与MPO孵育，以使MPO结合至表面固定的纤连蛋白。每孔加入80 μl含20 nM纯化人中性粒细胞MPO的Hank’s平衡盐溶液（HBSS），在37 °C孵育0.5小时。</li>
	<li>用HBSS洗涤表面两次，以去除未结合的MPO。</li>
	<li>向每孔微电极阵列板中加入H2O2（终浓度0–10 μM），每孔含80 μl HBSS，以启动MPO催化、HOCl依赖性的纤连蛋白氧化反应，并在37 °C继续孵育0.5小时。</li>
	<li>如需考察相关抑制剂或调节剂对MPO催化反应的影响（例如，替代性MPO酶底物、酶抑制剂或抗氧化剂；详见9），请在加入H2O2前立即将其加入HBSS中。</li>
	<li>孵育0.5小时后，用甲硫氨酸处理表面，以淬灭残留的表面结合氧化性物质；即具有潜在干扰细胞活性的活性蛋白结合型次氯胺。每孔加入含10 mM甲硫氨酸的80 μl HBSS，于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>用BSA封闭表面。每孔加入80 μl含0.2% w/v BSA的PBS溶液，在37 °C孵育2小时后移除溶液。 
	注：残留未包被的表面区域可能支持细胞黏附，使用非黏附性蛋白（即，BSA）封闭这些区域可确保细胞黏附反应严格依赖于所使用的纯化细胞黏附基质（本实验中为纤连蛋白）。</li>
	<li>用HBSS洗涤表面两次。 
	注：前述所有表面处理均不会显著影响细胞-基质阻抗读数。</li>
	<li>将悬浮的内皮细胞接种至原生或经MPO氧化的纤连蛋白包被表面（每孔加入约2.5 × 105 个细胞/ml的细胞悬液200 μl，使用含1% BSA的无血清Medium 199配制；见1.3节）。</li>
	<li>接种细胞后立即（即在细胞发生任何黏附和铺展之前）将微电极阵列板安装至培养箱端口（置于含5% CO2的37 °C培养箱内）。
	<ol>
		<li>使用仪器软件立即采集一次“空白”读数，以便将后续的细胞-基质阻抗（“细胞指数”）数值归一化为无细胞黏附时获得的初始背景值。</li>
		<li>开始连续采集细胞指数数据（至少每分钟采集一次细胞指数读数）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C和5% CO2条件下孵育细胞2小时，此时间段内细胞可达到最大黏附与铺展程度；该过程表现为细胞指数值趋于平稳（见图3A）。 
	注：前述实验（实验1）旨在研究初始阶段MPO介导的纤连蛋白氧化如何限制内皮细胞在该基质上建立黏附的能力。以下实验（实验2）则研究在已建立黏附的内皮细胞中，MPO介导的纤连蛋白氧化如何促进细胞-基质黏附减弱（即去黏附）。这两个实验的处理基本相同，唯一区别在于MPO介导纤连蛋白氧化的时机（即细胞黏附前——实验1；细胞黏附后——实验2）。</li>
</ol>
实验2：通过细胞-基质阻抗和活细胞成像定量测定髓过氧化物酶介导的纤连蛋白氧化对内皮细胞从纤连蛋白上脱附的影响
<ol>
	<li>将纤连蛋白包被到用于细胞-基质阻抗测量的96孔金微电极阵列上（在PBS中加入浓度为5 μg/ml的纤连蛋白，每孔80 μl，于37 °C孵育2小时），或包被到用于活细胞成像分析的35 mm玻璃底细胞培养皿上（在PBS中加入浓度为5 μg/ml的纤连蛋白，每皿2 ml，于37 °C孵育2小时）。</li>
	<li>用BSA封闭表面。在PBS中加入终浓度为0.2% w/v的BSA，体积按步骤3.1中所述，于37 °C孵育2小时。</li>
	<li>将表面与MPO孵育，以使MPO结合至纤连蛋白。在HBSS中加入终浓度为20 nM的纯化人MPO，体积按步骤3.1中所述，于37 °C孵育0.5小时。</li>
	<li>用HBSS洗涤表面两次，以去除未结合的MPO。</li>
	<li>将悬浮的内皮细胞（用含1% w/v BSA的无血清Medium 199制备；见步骤1.3）接种至天然或携带MPO的纤连蛋白包被的表面。
	<ol>
		<li>向96孔细胞-基质阻抗微电极阵列中每孔加入200 μl细胞悬液，细胞密度为2.5 × 105 个细胞/ml。</li>
		<li>向35 mm玻璃底细胞培养皿中每皿加入2 ml细胞悬液，细胞密度为5 × 105 个细胞/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种后立即进行以下操作（即，在细胞尚未贴附和铺展之前）：
	<ol>
		<li>将96孔微电极阵列板安装至细胞-基质阻抗孵育端口（置于含5% CO2的37 °C培养箱内），并采集“空白”读数，以启动细胞指数数据的连续采集（参见第2.10节）。</li>
		<li>将35 mm玻璃底细胞培养皿转移至含5% CO2的37 °C培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>于37 °C孵育细胞2小时，以实现细胞最大程度的贴附和铺展（参见第2.11节）。</li>
	<li>短暂地从37 °C培养箱中取出96孔微电极阵列板（此时暂停细胞指数读数）或35 mm玻璃底细胞培养皿，弃去细胞上清液，并加入预热至37 °C的HBSS（体积同步骤3.1）。 
	注意：在研究MPO催化的氧化反应时使用HBSS而非完全培养基，因为后者含有可被氧化的物质，会干扰氧化反应。</li>
	<li>若需考察MPO催化反应的抑制剂/调节剂（替代性酶底物、酶抑制剂或抗氧化剂）或细胞信号通路抑制剂（例如，40 μM blebbistatin以抑制肌球蛋白收缩力），此时可加入上述试剂。</li>
	<li>立即将微电极阵列板放回37 °C孵育端口（此时重新开始细胞指数读数），或将35 mm玻璃底细胞培养皿放回37 °C培养箱，使细胞在HBSS中平衡0.5小时。 
	注意：在HBSS中平衡0.5小时后，细胞指数值会稳定在略低的水平；若预先用酶底物、酶抑制剂、细胞信号通路抑制剂或抗氧化剂处理细胞，应首先确认这些试剂不会显著影响平衡后的细胞指数值。</li>
	<li>启动MPO催化、HOCl依赖性的纤连蛋白氧化及去黏附过程。
	<ol>
		<li>对于使用96孔微电极阵列板进行的细胞阻抗研究：
		<ol>
			<li>将微电极阵列板从培养箱中取出，并暂停细胞指数测量。</li>
			<li>向HBSS中加入H2O2（终浓度为0–10 μM），并通过反复吹打轻轻混匀。</li>
			<li>立即重新将微电极阵列板安装至37 °C孵育端口，并恢复细胞指数数据的采集。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于使用35 mm玻璃底细胞培养皿进行的活细胞成像研究：
		<ol>
			<li>将培养皿从培养箱中取出，并置于配备63X水镜、具有合适DIC光学系统的倒置共聚焦显微镜的37 °C加热载物台上，用于记录活细胞影像。</li>
			<li>对细胞进行调焦，并优化DIC光学参数（科勒照明、偏置延迟以及相机的偏移/增益；具体细节参见13）。</li>
			<li>启动DIC录像，记录未处理细胞的基线数据1分钟。</li>
			<li>加入H2O2（终浓度为0–10 μM），并通过反复吹打轻轻混匀。必要时重新调焦，并继续记录处理后细胞的DIC影像，持续所需时间。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析与展示
<ol>
	<li>细胞-基底阻抗数据
	<ol>
		<li>将原始数据（细胞指数相对于时间）导出至电子表格中。</li>
		<li>对于细胞去黏附研究（实验2：第3节），通过将髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化开始前立即记录的数值设定为1（即，在3.11.1.1步骤中加入H2O2前的瞬间）对数据进行归一化处理。 
		注意：此操作可确保MPO介导的纤连蛋白氧化所引起的细胞指数相对变化不会因各孔之间初始绝对细胞指数值的微小差异而被掩盖。
		<ol>
			<li>以归一化的细胞指数（y轴）相对于时间（x轴）作图展示数据。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞成像数据（实验2中的细胞去黏附研究：第3节）
	<ol>
		<li>在标准图像分析软件（例如，ImageJ软件）中打开在MPO介导的纤连蛋白氧化开始前及开始后立即记录的明场（DIC）活细胞成像视频。</li>
		<li>在至少两个独立的DIC视频中随机选择多个细胞，并通过手动勾画其膜边缘并量化所包围的像素数量，在连续帧中（例如，每1分钟）测量其投影面积。</li>
		<li>将原始数据（投影细胞面积相对于时间）导出至Excel电子表格中，并通过将MPO介导的纤连蛋白氧化开始前立即记录的数值设定为1（即，在3.11.2.3步骤中加入H2O2前的瞬间）对细胞面积数据进行归一化处理。</li>
		<li>以归一化的细胞面积（y轴）相对于时间（x轴）作图展示数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞-基质黏附与去黏附过程可通过细胞-基底阻抗和活细胞成像分析在实时条件下以高时间分辨率进行精确量化。相较于终点法黏附分析（其时间分辨率较差），这些实时分析方法具有显著优势。通过高时间分辨率精确量化快速去黏附反应，此类分析可提供关键信息，揭示细胞对基质修饰的形态学响应的调控机制，以及这些响应如何影响黏附依赖性细胞信号转导过程，后者可通过相关的生物化学检测方法并行测定。例如，蛋白质印迹法）
在最近的研究中，这些方法被用于揭示髓过氧化物酶（MPO）介导的亚内皮基质氧化在触发内皮细胞去黏附过程中的新作用，并表明：（i）去黏附速率关键依赖于预先存在的肌动球蛋白收缩力（参见图3B和3C）；（ii）细胞-基质黏附的丧失驱动了多种重要黏附依赖性细胞信号通路的变化，包括Src依赖性的paxillin磷酸化和肌球蛋白轻链II的磷酸化9（见图1）。这些数据对于理解炎症反应过程中内皮功能和屏障完整性的调控具有重要意义，因为在这些病理条件下，亚内皮细胞外基质被认为是基质结合型MPO或其他活性氧化物来...

细胞与其周围细胞外基质之间稳定的黏附连接对于维持组织稳态至关重要。例如，血管中内皮细胞与内皮下基质的黏附在维持内皮层完整性及其作为调控性、半通透性血管屏障的稳态功能中起着关键作用1。肌动蛋白细胞骨架在细胞-基质黏附位点处与黏附性基质分子发生机械耦联，细胞-基质界面的黏附连接通过抵抗向心性的肌球蛋白张力，对细胞膜的位置起着重要的决定作用。能够改变细胞-基质黏附的胞外刺激必然改变细胞-基质界面处的力学平衡，这一变化会迅速被力学敏感的信号蛋白“感知”，从而引发“由外向内”的信号转导。细胞与其周围细胞外基质之间的这种相互作用在调控细胞形态、运动性、功能、增殖和存活中发挥关键作用2。
多种病理生理过程（胚胎发育、炎症、伤口修复和癌症转移）的特征是基质降解性氧化物和/或酶对黏附性基质底物进行动态重塑3,4。例如，在人类炎症性疾病中，血管内皮下黏附性基质蛋白（例如，纤连蛋白）被认为是被修饰或降解的主要靶标，这是由于白细胞来源的髓过氧化物酶（MPO）在炎症性血管疾病期间于内皮下层积聚，并局部产生活性氧化物（例如，次氯酸，HOCl）所致（图1）5-9。由MPO来源的氧化物及其他基质修饰性刺激所诱导的细胞-基质黏附变化，可能在多种病理过程中改变血管稳态方面发挥重要作用；例如，通过改变内皮细胞的信号传导、形态和存活能力，进而扰乱内皮功能和屏障完整性。然而，黏附细胞对细胞外基质修饰所产生的形态学及细胞信号响应目前尚处于初步研究阶段。
为了理解基质修饰如何驱动细胞黏附动态变化以及依赖黏附的细胞信号通路的改变，需要具备高时间分辨率、能够实时准确量化细胞-基质黏附变化的技术。本文介绍了互补的细胞-基底阻抗检测与活细胞成像技术，这些方法满足上述要求，提供了一种非侵入性定量分析细胞黏附与去黏附过程的平台。
我们展示了如何轻松采用这些细胞-基质阻抗和活细胞成像方法，以（i）监测细胞贴附与铺展的动态过程即, 从头合成 细胞粘附）到天然及修饰的基质底物上，以及（ii）测量细胞-基质脱离的动力学过程（即，去黏附）过程中，贴壁细胞在基质修饰刺激下的反应。xCELLigence细胞-基质阻抗生物传感器系统通过量化96孔板金微电极阵列表面的电学阻抗，连续测量细胞与基质接触面积，并将这些阻抗测量值表示为“细胞指数”（cell index），该无量纲数值在很大程度上与细胞-基底接触面积成正比10 (图2），同时对（绝缘的）细胞膜与电极表面之间的平均距离变化具有敏感性11当形成紧密的细胞间连接，限制了旁细胞电流流动时，细胞指数值也会进一步升高，11 本研究中所描述的实验条件下并不存在的情况。通过对延时微分干涉差（DIC）影像进行图像分析，测量单个细胞随时间变化的投影面积，可作为细胞-基质接触面积变化的补充性评估方法，并为进一步了解由细胞-基质阻抗法所量化的形态学变化的具体特征与动态过程提供额外信息。
具体而言，我们描述了如何应用这些方法来监测 MPO 介导的黏附性亚内皮基质蛋白（例如，纤连蛋白）的氧化作用：（i）降低悬浮内皮细胞在纯化纤连蛋白上的从头黏附；（ii）触发已牢固黏附于纤连蛋白上的内皮细胞发生细胞-基质去黏附。通过在不同时间点平行进行相关的生物化学检测（例如，Western 印迹）以分析细胞信号传导，可确定黏附/去黏附过程与黏附依赖性细胞信号事件相关变化之间的时间顺序和因果关系。
最近的研究采用这些方法证明，由内皮下沉积的髓过氧化物酶（MPO）催化的细胞外基质氧化会引发内皮细胞与基质间黏附的快速丧失，这一过程由预先存在的肌动球蛋白收缩力驱动9。重要的是，这些方法能够确定细胞黏附变化与黏附依赖性细胞信号传导变化之间的时间关系，从而发现MPO诱导的基质修饰及细胞去黏附会触发关键的黏附依赖性细胞信号通路的改变，包括Src激酶依赖性的paxillin磷酸化和肌球蛋白轻链II的磷酸化（图1）9。这种氧化还原依赖性信号传导模式，即通过破坏细胞-基质黏附的胞外氧化反应激活胞内信号事件，代表了一种新型的细胞信号传导机制，称为“由外向内的氧化还原信号传导”（“outside-in redox signaling”）（图1）9。
总体而言，这些互补的细胞-基质阻抗生物传感器与活细胞成像方法在揭示不同基质修饰刺激或因子如何驱动多种黏附细胞类型在各种实验条件下细胞黏附动力学、形态及信号转导的变化方面具有重要价值。
以下实验方案描述了如何定量评估髓过氧化物酶（MPO）介导的基质氧化对内皮细胞从头黏附（实验 1）以及内皮细胞去黏附（实验 2）过程的影响。MPO 能强烈结合纤连蛋白及其他黏附性亚内皮细胞外基质蛋白，并利用过氧化氢（H2O2）将氯离子（Cl–）转化为高反应性的氯化氧化剂次氯酸（HOCl）。次氯酸在局部与这些基质蛋白发生反应，破坏其细胞黏附特性（图 1）8,9,12。

<table><tbody><tr><td>96孔金质细胞-基底阻抗微电极阵列</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>在xCELLigence系统上进行基于细胞检测的一次性使用板</td></tr><tr><td>blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>非肌肉肌球蛋白II的选择性抑制剂</td></tr><tr><td>Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>内皮细胞生长培养基试剂盒</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白，冻干粉末</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>来源于牛血浆</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm玻璃底细胞培养皿</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>带光学质量玻璃底的细胞培养皿，适用于成像</td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>细胞培养基质</td></tr><tr><td>Hank's平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>无血清细胞培养基</td></tr><tr><td>甲硫氨酸</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>淬灭髓过氧化物酶生成的氯化性氧化剂</td></tr><tr><td>人多形核白细胞髓过氧化物酶</td><td>Millipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP仪器 / xCELLigence细胞基底阻抗系统</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>由RTCA分析仪、RTCA（多板）MP站和RTCA控制单元组成</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%）</td><td>Gibco</td><td>15400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞-基质阻抗与活细胞成像技术实时测量基质修饰诱导的细胞黏附与去黏附动态变化

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

细胞-基质黏附在调控细胞形态和信号传导中起着关键作用。在多种疾病中，一些破坏细胞-基质黏附的刺激因素（例如，炎症过程中释放的髓过氧化物酶及其他基质修饰性氧化剂/酶）被认为可引发细胞功能、表型和存活能力的病理性改变。本文描述了如何利用细胞-基底阻抗技术和活细胞成像方法，以高时间分辨率、非侵入性的方式，准确量化由基质修饰（以内皮细胞和髓过氧化物酶作为病理生理性基质修饰刺激）所诱导的细胞黏附与去黏附的实时变化。xCELLigence细胞-基底阻抗系统通过测量生长于金微电极阵列上的细胞在细胞-基底界面处的电学阻抗，连续量化细胞-基质黏附面积。对时间延时微分干涉差（DIC）图像序列进行图像分析，可量化单个细胞投影面积随时间的变化，从而反映细胞-基质接触面积的动态改变。这两种技术均可准确量化细胞黏附与去黏附过程中的快速变化。基于微电极生物传感器阵列的细胞-基底阻抗检测为稳定、高通量的测量提供了平台。活细胞成像分析则进一步提供了细胞-基底阻抗测量所量化形态变化的本质与动态特征的额外细节。这些互补性方法为深入了解髓过氧化物酶催化的亚细胞水平细胞外基质成分的氧化修饰如何触发内皮细胞中细胞黏附、形态和信号传导的快速变化提供了宝贵的新视角。这些方法也可用于研究其他基质修饰性刺激以及相关黏附细胞（例如，上皮细胞）中细胞黏附动力学的响应。

内皮细胞在髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化作用下从纤连蛋白上解离的实时定量分析（实验2）。 将内皮细胞悬液接种至天然（无MPO）纤连蛋白或含MPO的纤连蛋白表面后，细胞在2小时内达到最大附着和铺展，表现为细胞基质阻抗测量中的细胞指数值趋于平稳（图3A）。在按照实验1所述方案进行的实验中，若在细胞接种前已启动MPO介导的纤连蛋白氧化，则该初始附着与铺展阶段显著减弱（数据未显示；详见9）。一旦细胞在天然或含MPO的纤连蛋白上实现最大程度的黏附，通过MPO催化生成次氯酸（HOCl）所介导的靶向纤连蛋白氧化（由添加MPO共底物H2O2启动），会导致细胞-基质接触表面积迅速减少，这一现象可通过细胞基质阻抗检测（图3A,B）和活细胞成像（图3C；代表性微分干涉相差视频见Movie 1）观察到；而在无MPO存在时，加入H2O2后细胞指数或细胞面积的减少极小9...

本文介绍一种非侵入性方法，通过细胞-基质阻抗和活细胞成像分析，以高时间分辨率连续量化细胞黏附与去黏附过程。这些方法可揭示由基质修饰引发的细胞黏附/去黏附过程的动力学特征，以及其与黏附依赖性信号事件之间的时间关系。

细胞-基质黏附在调控细胞形态和信号转导中起关键作用。可破坏细胞-基质黏附的刺激物（如髓过氧化物酶和……）

以下实验的总体目标是利用细胞基质阻抗和活细胞成像技术，实时定量测定内皮细胞在暴露于基质修饰剂时细胞-基质黏附的快速变化。在本实验中，采用血红素酶髓过氧化物酶作为具有病理生理学意义的基质修饰剂。实验首先用纤连蛋白包被表面，以提供黏附性基质底物。随后让髓过氧化物酶（MPO）与纤连蛋白结合。接着将悬浮的内皮细胞接种到表面，并进行孵育，以实现细胞在纤连蛋白上的最大附着和铺展。然后用过氧化氢处理细胞，以启动MPO介导的纤连蛋白氧化。随后，利用细胞基底阻抗和活细胞成像分析，实时定量细胞基质黏附的快速变化。结果表明，由NPO介导的纤连蛋白氧化所引发的内皮细胞基质黏附的快速丧失，可通过细胞基底阻抗和活细胞成像技术以高时间分辨率、免标记的方式实现实时定量。这些技术的优势在于能够连续、高时间分辨率地量化细胞基质黏附的变化，从而有助于深入理解基质修饰如何驱动细胞形态及依赖黏附的信号转导过程的下游变化。这些方案具有更广泛的意义，因为可以通过将MPO替换为其他基质修饰剂（如基质门控蛋白酶）或使用内皮细胞以外的其他贴壁细胞类型（如上皮细胞），轻松地对方案进行调整。首先，在96孔金微电极阵列的每个孔中加入80微升纤连蛋白，用于细胞基底阻抗检测；或者在玻璃底细胞培养皿中加入两毫升纤连蛋白，用于活细胞成像分析。将阵列和/或培养皿在37摄氏度下孵育两小时。然后，加入0.2% BSA以封闭表面，并在37°C下额外孵育两小时。接着，加入溶于HBSS中的纯化人髓过氧化物酶（myeloperoxidase），孵育30分钟。随后用HBSS洗涤表面两次，以去除未结合的MPO。接下来，按照文本方案制备内皮细胞悬液，以每毫升250,000个细胞的密度接种于96孔细胞基底阻抗微电极阵列板上，该阵列板表面包被有天然型或含髓过氧化物酶（MPO）的纤维连接蛋白。对于35毫米玻璃底细胞培养皿，加入2毫升浓度为每毫升500,000个细胞的悬液。细胞接种后，立即将其接种有细胞的微电极阵列板置于细胞基底阻抗培养箱的孵育端口内，于37°C及5%二氧化碳条件下培养。读取空白值以开始连续采集细胞指数数据。将35毫米玻璃底细胞培养皿转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，孵育2小时，以确保细胞充分贴壁和铺展。孵育结束后，暂停细胞指数读数，短暂取出微电极阵列板或将玻璃底培养皿从培养箱中取出，吸除上清液，加入预热的HBSS，以检测抑制剂、MPO调节剂、催化反应或细胞信号通路抑制剂的作用。将这些试剂加入培养物中。此时，立即将阵列板放回培养箱端口，或将玻璃底培养皿放回培养箱，使细胞平衡30分钟。为了启动由NPO催化的次氯酸依赖性纤连蛋白氧化及细胞去黏附实验，以进行细胞阻抗研究，首先将微电极阵列板从培养箱中取出，并暂停细胞指数的测量。向HBSS中加入过氧化氢，并通过反复吹打轻轻混匀，随后立即将微电极阵列板重新放回培养箱的接口中，恢复细胞指数读数，以用于活细胞成像研究。对于使用35毫米玻璃底培养皿的实验，在将培养皿从培养箱中取出后，将其安装至配备有63倍水镜物镜的倒置共聚焦显微镜的37摄氏度加热载物台上。对于记录活细胞影像，需聚焦于细胞，并根据此处引用的指南优化微分干涉差（DIC）光学系统。启动DIC影像记录，对未经处理的细胞进行一分钟的基础状态记录，随后加入过氧化氢，并通过反复移液轻轻混匀，重新对显微镜进行聚焦，继续记录经处理细胞所需时长的DIC影像。为分析细胞基质阻抗数据，首先将数据导出至电子表格，用于细胞黏附分析。研究通过将髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化开始前立即记录的数值设为1，将数据归一化，并以归一化的细胞指数对时间作图，以分析活细胞成像数据。在图像分析软件（如Image J）中打开至少两个独立的相差干涉差（DIC）活细胞成像视频，分别记录MPO介导的纤连蛋白氧化开始前和开始后的动态过程，随机选择多个细胞，通过手动勾勒其膜边缘，测量连续帧中细胞的投影面积，并量化所包围的像素数量。最后，以归一化的细胞面积对时间作图。内皮细胞悬液在纤连蛋白或携带MPO的纤连蛋白上接种后，细胞附着和铺展在两小时内达到最大，这可通过细胞指数值趋于平稳（平台期）来判断。在天然纤维连接蛋白或含NPO的纤维连接蛋白上细胞达到最大黏附后，通过NPO催化产生的次氯酸介导的靶向纤维连接蛋白氧化，并由加入NPO的共底物过氧化氢启动，会导致细胞-基质接触表面积迅速减小，该现象可通过细胞基质阻抗测量和活细胞成像检测到。如图所示，内皮细胞在结合含NPO的纤维连接蛋白后，经过氧化氢处理会迅速发生细胞去黏附，而单独使用过氧化氢处理的细胞则未出现此现象。使用BLE的他汀类药物抑制肌球蛋白II的马达功能，可抑制通过细胞基质阻抗和活细胞成像所测量的内皮细胞去黏附速率，表明在MPO催化亚细胞基质氧化的响应中，细胞去黏附和收缩是由肌动蛋白-肌球蛋白张力驱动的。由于这些方法能够精确测量细胞黏附的快速变化，因此可为黏附改变与下游黏附依赖性信号通路变化（如SARK磷酸化或黏着斑信号通路）之间的因果关系提供关键见解，后者可通过随时间进行的平行实验结合Western印迹法轻松检测。

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使用Cell-基板阻抗和活细胞成像，以衡量矩阵修改诱导实时变化的细胞粘附和去粘附

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利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

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