利用细胞-基质阻抗与活细胞成像技术实时测量基质修饰诱导的细胞黏附与去黏附动态变化

以下实验的总体目标是利用细胞基质阻抗和活细胞成像技术，实时定量测定内皮细胞在暴露于基质修饰剂时细胞-基质黏附的快速变化。在本实验中，采用血红素酶髓过氧化物酶作为具有病理生理学意义的基质修饰剂。实验首先用纤连蛋白包被表面，以提供黏附性基质底物。

随后让髓过氧化物酶（MPO）与纤连蛋白结合。接着将悬浮的内皮细胞接种到表面，并进行孵育，以实现细胞在纤连蛋白上的最大附着和铺展。然后用过氧化氢处理细胞，以启动MPO介导的纤连蛋白氧化。

随后，利用细胞基底阻抗和活细胞成像分析，实时定量细胞基质黏附的快速变化。结果表明，由NPO介导的纤连蛋白氧化所引发的内皮细胞基质黏附的快速丧失，可通过细胞基底阻抗和活细胞成像技术以高时间分辨率、免标记的方式实现实时定量。这些技术的优势在于能够连续、高时间分辨率地量化细胞基质黏附的变化，从而有助于深入理解基质修饰如何驱动细胞形态及依赖黏附的信号转导过程的下游变化。

这些方案具有更广泛的意义，因为可以通过将MPO替换为其他基质修饰剂（如基质门控蛋白酶）或使用内皮细胞以外的其他贴壁细胞类型（如上皮细胞），轻松地对方案进行调整。首先，在96孔金微电极阵列的每个孔中加入80微升纤连蛋白，用于细胞基底阻抗检测；或者在玻璃底细胞培养皿中加入两毫升纤连蛋白，用于活细胞成像分析。将阵列和/或培养皿在37摄氏度下孵育两小时。

然后，加入0.2% BSA以封闭表面，并在37°C下额外孵育两小时。接着，加入溶于HBSS中的纯化人髓过氧化物酶（myeloperoxidase），孵育30分钟。随后用HBSS洗涤表面两次，以去除未结合的MPO。

接下来，按照文本方案制备内皮细胞悬液，以每毫升250,000个细胞的密度接种于96孔细胞基底阻抗微电极阵列板上，该阵列板表面包被有天然型或含髓过氧化物酶（MPO）的纤维连接蛋白。对于35毫米玻璃底细胞培养皿，加入2毫升浓度为每毫升500,000个细胞的悬液。细胞接种后，立即将其接种有细胞的微电极阵列板置于细胞基底阻抗培养箱的孵育端口内，于37°C及5%二氧化碳条件下培养。

读取空白值以开始连续采集细胞指数数据。将35毫米玻璃底细胞培养皿转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，孵育2小时，以确保细胞充分贴壁和铺展。

孵育结束后，暂停细胞指数读数，短暂取出微电极阵列板或将玻璃底培养皿从培养箱中取出，吸除上清液，加入预热的HBSS，以检测抑制剂、MPO调节剂、催化反应或细胞信号通路抑制剂的作用。将这些试剂加入培养物中。此时，立即将阵列板放回培养箱端口，或将玻璃底培养皿放回培养箱，使细胞平衡30分钟。

为了启动由NPO催化的次氯酸依赖性纤连蛋白氧化及细胞去黏附实验，以进行细胞阻抗研究，首先将微电极阵列板从培养箱中取出，并暂停细胞指数的测量。向HBSS中加入过氧化氢，并通过反复吹打轻轻混匀，随后立即将微电极阵列板重新放回培养箱的接口中，恢复细胞指数读数，以用于活细胞成像研究。对于使用35毫米玻璃底培养皿的实验，在将培养皿从培养箱中取出后，将其安装至配备有63倍水镜物镜的倒置共聚焦显微镜的37摄氏度加热载物台上。

对于记录活细胞影像，需聚焦于细胞，并根据此处引用的指南优化微分干涉差（DIC）光学系统。启动DIC影像记录，对未经处理的细胞进行一分钟的基础状态记录，随后加入过氧化氢，并通过反复移液轻轻混匀，重新对显微镜进行聚焦，继续记录经处理细胞所需时长的DIC影像。为分析细胞基质阻抗数据，首先将数据导出至电子表格，用于细胞黏附分析。

研究通过将髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化开始前立即记录的数值设为1，将数据归一化，并以归一化的细胞指数对时间作图，以分析活细胞成像数据。在图像分析软件（如Image J）中打开至少两个独立的相差干涉差（DIC）活细胞成像视频，分别记录MPO介导的纤连蛋白氧化开始前和开始后的动态过程，随机选择多个细胞，通过手动勾勒其膜边缘，测量连续帧中细胞的投影面积，并量化所包围的像素数量。最后，以归一化的细胞面积对时间作图。内皮细胞悬液在纤连蛋白或携带MPO的纤连蛋白上接种后，细胞附着和铺展在两小时内达到最大，这可通过细胞指数值趋于平稳（平台期）来判断。

在天然纤维连接蛋白或含NPO的纤维连接蛋白上细胞达到最大黏附后，通过NPO催化产生的次氯酸介导的靶向纤维连接蛋白氧化，并由加入NPO的共底物过氧化氢启动，会导致细胞-基质接触表面积迅速减小，该现象可通过细胞基质阻抗测量和活细胞成像检测到。如图所示，内皮细胞在结合含NPO的纤维连接蛋白后，经过氧化氢处理会迅速发生细胞去黏附，而单独使用过氧化氢处理的细胞则未出现此现象。使用BLE的他汀类药物抑制肌球蛋白II的马达功能，可抑制通过细胞基质阻抗和活细胞成像所测量的内皮细胞去黏附速率，表明在MPO催化亚细胞基质氧化的响应中，细胞去黏附和收缩是由肌动蛋白-肌球蛋白张力驱动的。由于这些方法能够精确测量细胞黏附的快速变化，因此可为黏附改变与下游黏附依赖性信号通路变化（如SARK磷酸化或黏着斑信号通路）之间的因果关系提供关键见解，后者可通过随时间进行的平行实验结合Western印迹法轻松检测。