Name: 成长型测定和遗传需求生化确认的蛋白质降解酿酒酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 了解酿酒酵母中蛋白质降解的遗传需求测定方法，通过生长型测定和Western blot生化验证技术，快速评估不稳定蛋白的稳定性并确认基因功能。该方法适用于高通量筛选蛋白质降解调控因子。

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感谢Rubenstein实验室现任和前任成员，为我们提供了支持性强且充满热情的研究环境。感谢Ryan T. Gibson在实验方案优化方面的协助。感谢Mark Hochstrasser（耶鲁大学）和Dieter Wolf（斯图加特大学）提供酵母菌株和质粒。感谢匿名审稿人帮助我们提高本文的清晰度和实用性。本研究得到了Sigma Xi巴尔州立大学分会授予S.G.W.的研究奖项、美国国立卫生研究院资助（R15 GM111713）授予E.M.R.、巴尔州立大学ASPiRE研究奖授予E.M.R.，以及巴尔州立大学教务长办公室和生物系资金的支持。

1. 酵母生长实验用于鉴定蛋白质降解缺陷的候选突变体
<ol>
	<li>将编码不稳定的蛋白与报告代谢酶融合（同框）的质粒转化至野生型和突变型酵母细胞中。</li>
	<li>将转化子接种于5 ml选择性合成定义（SD）最低培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。30 °C下过夜培养 30 °C，旋转。</li>
	<li>在600 nm处测定光密度（OD）600每种过夜培养物的) 
	注意：经过过夜培养后，培养物中的细胞可能处于对数生长期或稳定期，但应已达到最低OD值600 0.2。生长极为缓慢的酵母菌株可能需要超过一晚的培养时间，或接种更多的细胞数量，具体条件需通过实验确定。</li>
	<li>在无菌96孔板中制备转化酵母细胞的六倍系列稀释液，起始浓度为OD600 0.2。将每种待检测的酵母转化子分别接种于96孔板的不同行中。
	<ol>
		<li>对于每个转化子，计算获得所需稀释细胞浓度的过夜培养物体积600 0.2 的终体积 200 µl. 将此体积的过夜培养物加入第1列对应的孔中。加入适量无菌水，使总体积达到 200 µl.</li>
		<li>为每一行酵母加入 125 µl 向第2、3、4列的孔中加入无菌水。 
		注意：单独包装的无菌96孔板可能附带无菌盖。这些盖子可用作本步骤中分配的无菌水的储液槽，从而允许使用多通道移液器将无菌水同时转移至某一列的所有孔中。</li>
		<li>混合第一列中的内容（酵母稀释至 OD600 用多通道移液器上下吹打混匀至 OD600 为 0.2。</li>
		<li>转移 25 µl 使用多通道移液器将酵母从第1列转移至第2列，通过上下吹打混匀。转移 25 µl 从第2列到第3列，以及 25 µl 从第3列转移到第4列（每步均充分混匀）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用多通道移液器混合每个样品。按照从最稀释到最不稀释的酵母列顺序，进行移液操作 4 µl 将每个样品分别点样到两块含有相应选择性培养基的平板上。使用一块维持质粒选择的压力培养基平板（该平板作为酵母点样和生长对照）。使用第二块选择性培养基平板，用于筛选质粒的维持及其上不稳定蛋白与报告酶融合蛋白的表达。由于酵母细胞沉降迅速，需定期通过移液器反复吹打混匀细胞。 
	注意：与新制备的平板相比，较干燥的平板更易吸收液体，因此推荐在这些实验中使用。潮湿的平板可通过在低湿度室温条件下孵育1–2天，或在层流罩中进行较短时间的孵育来干燥。如果层流空气流动方向与实验台平行，可能导致平板干燥不均匀。使用模板有助于以固定间距点样酵母细胞。文中提供了两种示例模板。 图1这些可以打印出来，剪下后贴在培养皿盖的内侧。</li>
	<li>让培养板在实验台面上晾干。</li>
	<li>将培养板置于 30 °C 2 – 6 天</li>
	<li>孵育后对每块平板进行拍照。</li>
</ol>
<img alt="展示数学变换概念的球面投影示意图 A 和 B。" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在 100-mm 琼脂平板上点样酵母细胞的模板。 这些模板可用于借助多通道移液器将酵母以规则间距点样。模板可打印、剪下，并粘贴至培养皿盖内侧。将含有生长培养基的培养皿放入贴有模板的皿盖中。模板上标有缺口以标记方向。建议用于生长实验的平板也用缺口标记方向以保持取向一致。本图提供了用于点样四组 (A) 或五组 (B) 酵母细胞连续稀释液的模板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126%20Fig%201.pdf" target="_blank">请点击此处查看此图的可打印版本（含 100-mm 模板）。</a>
2. 酵母生长实验的生化验证
<ol>
	<li>酵母细胞培养及碱性蛋白提取后处理（改良自 31)
	<ol>
		<li>将编码不稳定蛋白的质粒转化至野生型和突变型酵母细胞中。</li>
		<li>将转化子接种于5 ml选择性SD培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。30°C过夜培养 30 °C，旋转。</li>
		<li>测量OD600 每种过夜培养物 
		注意：经过过夜培养后，细胞可能处于对数生长期或稳定期，但应已达到指定的OD值600 可允许稀释至 OD600 在10 ml新鲜选择性培养基中稀释至0.2（步骤2.1.4）。生长极为缓慢的酵母菌株可能需要超过一夜的培养时间，或接种更多数量的细胞，具体条件需根据实验经验确定。</li>
		<li>将酵母细胞稀释至 OD600 在10 ml新鲜选择性培养基中，OD值为0.2。</li>
		<li>继续在相同条件下孵育细胞 30 °C，旋转或振荡，直至培养物达到 OD600 介于 0.8 和 1.2 之间（即 处于对数生长中期。 
		注意：如果目标不稳定蛋白由可调控启动子控制，则蛋白表达诱导及细胞收获的最佳时间可能因先前研究或经验观察而异。</li>
		<li>收集 2.5 OD600 在15 ml锥形管中，以5,000 × g离心5分钟（室温），收集培养物菌体。用移液或抽吸方式去除上清液。 
		注意：1 OD600 单位定义为在 OD 值下每毫升培养液中存在的酵母数量600 为收获 2.5 OD 所需的培养物体积（单位：ml）600 电压（V）可使用以下公式确定：V = 2.5 OD600 单位 / 测定 OD600</li>
		<li>在1 ml蒸馏水中重悬细胞，将重悬的细胞转移至微量离心管中。</li>
		<li>离心6,500 × g，室温30秒，沉淀细胞。用移液器或抽吸法去除上清液。</li>
		<li>重悬细胞于 100 µl 用移液器反复吹打或涡旋振荡，将蒸馏水混匀，然后加入 100 µl 0.2 M NaOH。用移液器上下吹打混匀。室温孵育5分钟。</li>
		<li>离心收集细胞沉淀（大部分细胞尚未释放蛋白且仍具活性），18,000 × g 离心 5 分钟。用移液器或抽吸法去除上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于 50 – 100 µl 1× Laemmli 上样缓冲液，通过移液吹打或涡旋振荡使细胞裂解。 
		注意：离心后去除碱性上清液，随后将细胞重悬于Laemmli样品缓冲液中，可在pH值上兼容使用Tris-甘氨酸电泳缓冲系统进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及蛋白质印迹（western blotting）。</li>
		<li>为充分变性蛋白质，将裂解液在指定温度下孵育 95 °C 5 分钟。 
		注意：易聚集蛋白（例如 具有多个跨膜区段的蛋白质在孵育时可能变得不溶 95 °C因此，裂解液应在较低温度下孵育（例如 37 °C – 70 °C）10 – 30 分钟，具体时间根据经验确定，用于此类蛋白质的分析。</li>
		<li>将裂解液置于冰上冷却5分钟。</li>
		<li>在室温下以 18,000 x g 离心裂解物 1 分钟，使不溶性物质沉淀。取上清液（溶解的提取蛋白）进行 SDS-PAGE 分离，随后进行后续的蛋白质印迹分析（第 2.2 节）。或者，将裂解物在 -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代表性蛋白质印迹实验方案
	<ol>
		<li>加入经实验确定体积的裂解液至SDS-PAGE凝胶中。</li>
		<li>以200 V电压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，采用湿转法，20 V 转移 60 – 90 分钟， 4 °C.</li>
		<li>在室温下轻轻摇动孵育1小时，或在4℃过夜，使用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水（TBS）封闭膜 4 °C.</li>
		<li>弃去封闭液。</li>
		<li>在含1%脱脂奶粉、0.1% Tween-20的TBS缓冲液（TBS/T）中，室温摇床上孵育膜1小时，所用一抗针对目标蛋白（或其表位标签）。</li>
		<li>弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下，将膜与含1%脱脂奶粉的TBS/T中的适当荧光染料标记的二抗共同孵育1小时，摇动。 
		注意：由于荧光染料对光敏感，荧光染料标记抗体的稀释液应在避光条件下配制。此外，膜与荧光染料标记抗体的孵育应在避光容器中进行。可通过用铝箔包裹孵育托盘来实现避光。</li>
		<li>弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下振荡洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>使用 Li-Cor Odyssey CLx 成像系统及 Image Studio 软件（或性能相当的成像设备和软件），按照制造商推荐的方法获取膜的图像。</li>
		<li>成像膜后，将膜在含1%脱脂奶粉的TBS/T中，与针对上样对照蛋白的一抗在室温下孵育1小时，同时轻轻振荡。</li>
		<li>弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下，将膜与适当荧光染料标记的二抗在含1%脱脂奶粉的TBS/T中孵育1小时，同时轻轻摇动。</li>
		<li>弃去抗体溶液，用 TBS/T 在室温下摇动洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>使用 Li-Cor Odyssey CLx 和 Image Studio 软件（或性能相当的成像设备和软件），按照制造商推荐的方法获取膜的图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可用于快速确定并生化验证酵母细胞中蛋白质降解所需的遗传条件。这些实验突显了酵母作为一种模式真核生物的实用性和强大优势（有关酵母生物学的多篇优秀综述以及酵母细胞操作、保存和处理的实验方案汇编例如 41-44) 适用于刚接触该生物体的研究人员）。这些技术可轻松应用于研究多种类型蛋白质的降解及其丰度。例如，已有研究者采用该策略来表征不稳定的胞质、细胞核以及内质网腔内和跨膜蛋白质的降解机制。45-49.
在选择与不稳定蛋白融合的代谢酶时，需考虑若干因素。首先，宿主基因组中必须不存在该酶编码基因的功能性版本。为最大限度减少假阳性结果（即 在选择性条件下培养时，若不稳定蛋白确实被降解，则建议使用携带报告基因非回复性突变等位基因（最好为完整的基因缺失）的菌株进行实验50另一个选择报告酶时需要考虑的因素是是否存在竞争性抑制剂，这些抑制剂可被添加至选择性培养基中，以减少背景生长并提高检测的严谨性。在即使存在完整功能的降解机制时底物蛋白周转率仍相对较低的情况下，这一策略尤为有用。在本文展示...

选择性蛋白质降解对真核生物的生命活动至关重要，而蛋白质降解的异常与多种疾病相关，包括多种癌症、神经退行性疾病、心血管疾病以及囊性纤维化1-5。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是介导选择性蛋白质降解的关键通路，目前正成为治疗上述疾病的重要靶点6-10。泛素连接酶可将由76个氨基酸组成的泛素分子共价连接成多聚泛素链并修饰靶蛋白11。带有聚泛素链标记的蛋白质会被约2.5兆道尔顿的26S蛋白酶体识别并降解12。在模式真核生物Saccharomyces cerevisiae（芽殖酵母）中开展的研究，为阐明真核细胞中蛋白质降解机制奠定了基础。首个被证实的UPS生理底物是酵母转录抑制因子MATα213,14，而许多高度保守的UPS组分最初也是在酵母中被发现或鉴定的（例如15-26）。在这个遗传操作便捷、功能多样的模式生物中所取得的研究发现，将继续为理解泛素介导的蛋白质降解保守机制提供重要见解。
大多数泛素-蛋白酶体系统（UPS）底物的识别与降解需要多种蛋白质的协同作用。因此，表征特定不稳定蛋白受调控降解过程的一个重要目标是确定其降解所需的遗传因素。在哺乳动物或酵母细胞中监测蛋白质降解的经典方法（例如脉冲-追踪和环己酰亚胺-追踪实验27）费时且劳动强度大。尽管这类方法能够高度灵敏地检测蛋白质降解，但并不适用于对蛋白质降解进行快速分析，或大规模筛选阻止蛋白质降解的突变。本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，可用于快速鉴定不稳定蛋白降解所需的遗传条件。
在基于酵母生长的蛋白质降解分析方法中，将目标不稳定蛋白质（或降解信号）以正确的阅读框与一种在特定条件下支持酵母生长所必需的蛋白质相融合。由此产生的融合蛋白可作为人工底物，成为研究目标不稳定蛋白质降解过程所需遗传条件的有力工具。通常情况下，实验室常用的酵母菌株携带一系列基因突变，这些基因编码参与特定氨基酸或含氮碱基生物合成的代谢酶（例如e.g. 20,28-30）。在缺乏外源提供这些酶所参与合成的代谢物时，这些酶对细胞增殖至关重要。因此，这些代谢酶可作为基于生长的报告系统，用于检测其融合的不稳定蛋白质是否发生降解。由于阻止蛋白水解的突变会使携带该降解报告系统的细胞在选择性条件下获得生长能力，因此可方便地揭示蛋白质降解所需的遗传因素。
生长优势是某种特定突变可增加目的蛋白丰度的间接证据。然而，必须通过直接的生物化学分析来确认该突变是否确实通过提高蛋白水平促进生长，而非由间接或人为假象因素所致。可通过蛋白质印迹法（western blot）检测携带或不携带该特定突变的细胞中稳态蛋白水平，以验证突变对蛋白丰度的影响。本文还介绍了一种快速高效提取酵母蛋白的方法（依次用氢氧化钠和上样缓冲液孵育酵母细胞），所获得的蛋白样品适用于后续的蛋白质印迹分析31。上述实验方法共同促进了蛋白降解候选调控因子的快速鉴定。

<table><tbody><tr><td>所需的酵母菌株、质粒、标准培养基和缓冲液成分</td><td></td><td></td><td>研究人员可在实验室中构建具有特定突变的酵母菌株。野生型酵母及多种突变体也可从商业途径获得（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 来自 GE Healthcare）。编码融合蛋白的质粒可在研究人员的实验室中构建。</td></tr><tr><td>3-氨基-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-三唑</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>His3酶的竞争性抑制剂。可在培养基中添加，以提高使用His3报告构建体的生长实验的严谨性。</td></tr><tr><td>内切糖苷酶 H（源自重组形式） &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>罗氏</td><td>11088726001</td><td>可用于评估蛋白质的N-糖基化；与1x Laemmli上样缓冲液中的SDS和β-巯基乙醇浓度相容。</td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>温度可控培养箱（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Heratherm 培养箱型号 IMH180</td><td>点科学</td><td>51028068</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>New Brunswick 可互换式 18 mm 试管滚轴瓶（试管滚筒）</td><td>新不伦瑞克</td><td>M1053-0450</td><td>建议使用试管滚轴仪以保持酵母初始培养物在悬浮状态下过夜培养。可使用平台摇床或试管滚轴仪维持较大体积的酵母培养物处于悬浮状态。</td></tr><tr><td>新不伦瑞克 TC-7 滚筒式摇床 120V 50/60 Hz</td><td>新不伦瑞克</td><td>M1053-4004</td><td>适用于试管滚轴混合器</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度计</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>无菌96孔平底微量检测板，带盖，单独包装</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N，2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>可从多家制造商处获得&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[标题]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N，20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>单通道和多通道移液器在本实验方案的各个阶段均有使用。尽管多通道移液器可在多个步骤中减轻移液操作负担，但整个实验流程亦可全程使用单通道移液器。上述设备可从多家制造商处获得。</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>随设备提供的转子可容纳1.5 ml和2.0 ml微量离心管。该转子可更换为可容纳15 ml和50 ml锥形管的转子。</td></tr><tr><td>平板成像系统（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>可使用多种系统对平板进行成像，包括精密成像系统、计算机扫描仪和手机摄像头。</td></tr><tr><td>固定角转子 F-35-6-30，带盖及适配器，适用于离心机型号 5430/R，15/50 ml 锥形管，6 位</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 丝网印刷螺旋盖管，17 x 20 mm 锥形，聚丙烯</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>1.5 ml 柔性管，PCR 级洁净，天然微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>可从多家制造商处获得</td></tr><tr><td>模拟 Dri-Bath 加热器</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>也可使用带加热板的沸水浴使蛋白质变性</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 电泳及转膜装置、电源、成像设备或用于 SDS-PAGE 及膜转移的暗室</td><td></td><td></td><td>将因实验室和应用而异</td></tr><tr><td>Western blot 成像系统&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx 扫描仪和 Image Studio 软件</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>将因实验室和应用而异</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF 转印膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>将因实验室和应用而异</td></tr><tr><td>一抗（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 磷酸甘油酸激酶（Pgk1）单克隆抗体，小鼠（克隆 22C5D8）</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>将根据实验室和应用情况而异</td></tr><tr><td>二抗（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Alexa Fluor 680 标记的兔抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>将因实验室和应用而异</td></tr></tbody></table>

基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在saccharomyces cerevisiae中的应用

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

受调控的蛋白质降解几乎对所有细胞功能都至关重要。关于真核生物蛋白质降解的分子机制和遗传需求的大部分知识，最初是在Saccharomyces cerevisiae中建立的。经典的蛋白质降解分析依赖于生物化学的脉冲-追踪（pulse-chase）和环己酰亚胺追踪（cycloheximide-chase）方法。尽管这些技术为观察蛋白质降解提供了灵敏的手段，但它们费时费力，通量较低，不适合快速或大规模筛选阻止蛋白质降解的突变。本文描述了一种基于酵母生长的简便检测方法，可用于快速鉴定蛋白质降解所需的遗传因素。在此检测中，一种在特定选择性条件下生长所必需的报告酶与一种不稳定的蛋白质融合。缺乏内源报告酶但表达融合蛋白的细胞，只有在融合蛋白被稳定时（即蛋白质降解受损时）才能在选择性条件下生长。在本研究所描述的生长检测中，将含有编码融合蛋白质粒的野生型和突变型酵母细胞进行系列稀释后，点样于选择性与非选择性培养基上。在选择性条件下生长表明特定突变导致了蛋白质降解功能的受损。蛋白质丰度的增加应通过生物化学方法进一步验证。本文还展示了一种快速提取适合电泳和蛋白质印迹（western blotting）分析的酵母蛋白的方法。基于生长的蛋白质稳定性读数，结合简便的蛋白质提取流程，有助于快速鉴定蛋白质降解所需的遗传因素。这些技术可被改造用于监测多种短寿命蛋白质的降解。在本文示例中，组氨酸生物合成所必需的His3酶与Deg1-Sec62融合。Deg1-Sec62在异常结合内质网转运子后会被靶向降解。当该融合蛋白Deg1-Sec62-His3被稳定时，携带该蛋白的细胞能够在选择性条件下生长。

为了说明该方法，已将 His3 酶融合至内质网（ER）相关降解（ERAD）模式底物 Deg1-Sec62 的羧基末端（图 2A），从而构建出 Deg1-Sec62-His3（图 3）。Deg1-Sec62 是一类新型 ERAD 底物的代表性成员，这类底物在持续异常结合易位子（translocon）后被靶向降解；易位子是介导蛋白质跨内质网膜转运的主要通道32-34。此类不稳定的蛋白质暂被称为 ERAD-T（即易位子相关）底物。先前研究表明，当 Deg1-Sec62 异常结合易位子后，会被 Hrd1 泛素连接酶靶向降解（图 2B-D）32,34,35。其他 Hrd1 底物降解所必需的因子在 Deg1-Sec62 的降解过程中似乎并非必需，提示其具有独特的降解机制32。在脂质结合受损且易位子结合时间延长...

本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解所需的遗传条件。同时展示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于蛋白质印迹（western blotting）以生化手段验证降解所需的条件。这些技术可被调整用于监测多种蛋白质的降解过程。

基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

受调控的蛋白质降解几乎对所有细胞功能都至关重要。目前关于分子机制和遗传学方面的许多认识……

以下实验的总体目标是快速确定降解 Croce Visier 中不稳定蛋白所需的遗传条件。该目标通过将一种在特定选择性条件下生长所必需的报告酶与目标不稳定蛋白融合来实现。随后，将表达该融合蛋白的野生型或突变型细胞培养在选择性培养基琼脂平板上。平板检测法通过酵母细胞生长情况提供了一个便捷的蛋白质稳定性指标，从而在生化水平上验证融合蛋白在突变细胞中表达量的差异；同时，利用快速但效率较低的蛋白质提取方法裂解细胞，用于后续的蛋白质印迹分析。结果显示，在降解相关基因发生突变的细胞中，不稳定蛋白的丰度增加；而在具有正常降解功能的野生型菌株中，该蛋白丰度则相反。 与现有的脉冲追踪（pulse chase）和环肽追踪（Cycl heide chase）分析方法相比，该技术的主要优势在于其劳动强度更低、耗时更短，能够快速、高通量地确定蛋白质降解所需的遗传条件。尽管该方法可用于研究多种不稳定蛋白质的降解需求，还可用于鉴定基因表达其他方面的调控因子，例如转录和翻译过程的调控因子。演示实验操作的是 Sheldon Watts 和 Justin Crowder。我实验室的学生在进行检测之前，会将编码融合蛋白的质粒转入一种突变型酵母菌株中，该融合蛋白由一种不稳定蛋白和一种代谢报告酶组成。作为对照，还将相同的质粒转入野生型酵母菌株中，该菌株疑似存在与蛋白质降解调控相关的遗传缺陷。将转化子接种于5毫升选择性最低培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。将试管置于倾斜旋转仪中，于30摄氏度下振荡培养过夜，次日进行后续操作。测定过夜培养物的光密度，然后用新鲜培养基将各培养物稀释至OD 600为0.2，调整所有细胞的浓度一致，并分装至无菌的1.5毫升离心管中。开始主实验时，首先将各预稀释菌株从 OD 600 为 0.2 的起始浓度开始，用多通道移液器将 200 微升分别转移至无菌 96 孔板第一列指定孔中，以准备后续稀释。接着，在第二、三、四列的空孔中各加入 125 微升无菌水。然后，从第一列取 25 微升酵母转移至第二列，上下吹打数次以充分混匀细胞，再从第二列取 25 微升细胞转移至第三列。重复此梯度稀释步骤，直至第四列各孔细胞充分混匀，以便后续进行细胞点样观察。打印出网格模板，并将其粘贴在培养皿盖内侧，从连续稀释矩阵中浓度最低的列开始。从每列中转移4 µL细胞至96孔板上的对照最小培养基琼脂平板中，该平板用于筛选细胞内质粒的维持。再从每列中另取4 µL细胞，点样到另一块独立的最小培养基琼脂平板上，该平板用于筛选细胞内质粒的存在。不稳定融合蛋白的维持与表达。将两个培养皿在实验台上干燥5到10分钟。用封口膜密封皿盖以防止脱水，并将细胞在30摄氏度条件下培养2至6天。当在某一平板上最稀释的点位处，生长最快的培养物首次出现可见菌落时，立即将该平板从培养箱中取出，并记录生长范围。可通过拍照记录，可能需要在不同日期对不同的平板进行拍照，或在多个日期对同一平板进行拍照。对于生长速率差异较大的不同酵母菌株，若经生化验证表明生长实验中鉴定出的基因可调控蛋白质丰度，则首先将编码上述融合蛋白的质粒分别转化至野生型和突变型酵母菌株中，随后将转化子接种于5 mL选择性维持质粒的最小培养基中，并在30°C条件下于倾斜摇床中过夜培养。第二天，测定每种过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。当所有菌株的OD600达到0.4或以上时，用新鲜培养基将各培养物稀释至OD600为0.2，使每种菌株的终体积为10毫升。将细胞置于30°C的摇床中培养，直至所有培养物进入对数中期生长阶段，OD600介于0.8至1.2之间。将总共2.5个OD单位的细胞转移至一个新的15毫升锥形管中以收获细胞。在室温下离心5分钟，去除上清液S。然后加入1毫升蒸馏水，通过涡旋或反复吹打重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至一个新的1.5毫升离心管中。将细胞进行第二次离心，离心时间为30秒，室温条件下。去除上清液，并将细胞重悬于100微升蒸馏水中。向细胞悬液中加入100微升0.2摩尔的氢氧化钠，上下吹打数次以混匀，然后在室温下孵育5分钟。为避免细胞过早裂解，请勿涡旋振荡细胞。再次通过第三次离心（30秒）分离细胞。在室温下，弃去细胞上清液，并通过将沉淀重悬于50至100 µL的1×Lamby样品缓冲液中来裂解细胞；将悬液在95°C孵育5分钟以使所有蛋白质变性，然后将全细胞裂解液置于冰上冷却5分钟。在检测易聚集蛋白（如含有多个跨膜片段的蛋白）的丰度时，可通过经验确定最佳变性孵育条件：起始条件可采用70°C孵育10分钟，而非95°C孵育5分钟。最后，将裂解液在室温下离心一分钟，分离可溶性组分，将上清液转移至新的离心管中，并弃去不溶性沉淀部分。可溶性组分可直接上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳分析，或在-20 °C条件下保存，用于后续基于酵母生长的蛋白质降解实验。一种不稳定的三联融合蛋白与一个额外的代谢酶相融合，该代谢酶能够互补缺乏相应代谢基因的酵母菌株背景。当融合蛋白在酵母中表达时，容易在内质网膜上发生无效的转运事件。这种异常转运会引发泛素介导的整个蛋白（包括代谢酶）的降解，从而阻止细胞增殖。然而，在缺乏泛素连接酶的酵母菌株中，即使发生正常的转运，融合蛋白也能免于降解，从而使细胞得以增殖。因此，在存在泛素连接酶的情况下，细胞内蛋白质降解与酵母细胞在代谢物耗尽的琼脂平板上无法增殖之间存在对应关系。另一方面，当泛素连接酶有缺陷或缺失时，细胞增殖表明融合蛋白免于降解，从而降低了背景信号或非特异性生长，提高了该检测方法的严谨性。可在培养基中添加代谢酶的竞争性抑制剂，以验证酵母生长实验中观察到的结果。融合蛋白降解的直接证据也可通过蛋白质印迹（Western blot）进行确认。在存在或不存在泛素连接酶的情况下，融合蛋白将分别被降解或免于被破坏。需要牢记的是，这些实验步骤最直接反映的是目标蛋白的稳态丰度。在完成这些操作后，可进行脉冲或环己酰亚胺追踪分析，以直接研究蛋白质降解动力学以及检测发现可提高稳态蛋白质水平的突变。

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生物学

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