基于生长的蛋白质降解遗传需求的测定及生化验证方法在Saccharomyces cerevisiae中的应用

以下实验的总体目标是快速确定降解 Croce Visier 中不稳定蛋白所需的遗传条件。该目标通过将一种在特定选择性条件下生长所必需的报告酶与目标不稳定蛋白融合来实现。随后，将表达该融合蛋白的野生型或突变型细胞培养在选择性培养基琼脂平板上。

平板检测法通过酵母细胞生长情况提供了一个便捷的蛋白质稳定性指标，从而在生化水平上验证融合蛋白在突变细胞中表达量的差异；同时，利用快速但效率较低的蛋白质提取方法裂解细胞，用于后续的蛋白质印迹分析。结果显示，在降解相关基因发生突变的细胞中，不稳定蛋白的丰度增加；而在具有正常降解功能的野生型菌株中，该蛋白丰度则相反。

与现有的脉冲追踪（pulse chase）和环肽追踪（Cycl heide chase）分析方法相比，该技术的主要优势在于其劳动强度更低、耗时更短，能够快速、高通量地确定蛋白质降解所需的遗传条件。尽管该方法可用于研究多种不稳定蛋白质的降解需求，还可用于鉴定基因表达其他方面的调控因子，例如转录和翻译过程的调控因子。

演示实验操作的是 Sheldon Watts 和 Justin Crowder。我实验室的学生在进行检测之前，会将编码融合蛋白的质粒转入一种突变型酵母菌株中，该融合蛋白由一种不稳定蛋白和一种代谢报告酶组成。作为对照，还将相同的质粒转入野生型酵母菌株中，该菌株疑似存在与蛋白质降解调控相关的遗传缺陷。

将转化子接种于5毫升选择性最低培养基中，该培养基用于筛选含有质粒分子的细胞。将试管置于倾斜旋转仪中，于30摄氏度下振荡培养过夜，次日进行后续操作。测定过夜培养物的光密度，然后用新鲜培养基将各培养物稀释至OD 600为0.2，调整所有细胞的浓度一致，并分装至无菌的1.5毫升离心管中。

开始主实验时，首先将各预稀释菌株从 OD 600 为 0.2 的起始浓度开始，用多通道移液器将 200 微升分别转移至无菌 96 孔板第一列指定孔中，以准备后续稀释。接着，在第二、三、四列的空孔中各加入 125 微升无菌水。然后，从第一列取 25 微升酵母转移至第二列，上下吹打数次以充分混匀细胞，再从第二列取 25 微升细胞转移至第三列。重复此梯度稀释步骤，直至第四列各孔细胞充分混匀，以便后续进行细胞点样观察。

打印出网格模板，并将其粘贴在培养皿盖内侧，从连续稀释矩阵中浓度最低的列开始。从每列中转移4 µL细胞至96孔板上的对照最小培养基琼脂平板中，该平板用于筛选细胞内质粒的维持。再从每列中另取4 µL细胞，点样到另一块独立的最小培养基琼脂平板上，该平板用于筛选细胞内质粒的存在。

不稳定融合蛋白的维持与表达。将两个培养皿在实验台上干燥5到10分钟。用封口膜密封皿盖以防止脱水，并将细胞在30摄氏度条件下培养2至6天。

当在某一平板上最稀释的点位处，生长最快的培养物首次出现可见菌落时，立即将该平板从培养箱中取出，并记录生长范围。可通过拍照记录，可能需要在不同日期对不同的平板进行拍照，或在多个日期对同一平板进行拍照。对于生长速率差异较大的不同酵母菌株，若经生化验证表明生长实验中鉴定出的基因可调控蛋白质丰度，则首先将编码上述融合蛋白的质粒分别转化至野生型和突变型酵母菌株中，随后将转化子接种于5 mL选择性维持质粒的最小培养基中，并在30°C条件下于倾斜摇床中过夜培养。

第二天，测定每种过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。当所有菌株的OD600达到0.4或以上时，用新鲜培养基将各培养物稀释至OD600为0.2，使每种菌株的终体积为10毫升。将细胞置于30°C的摇床中培养，直至所有培养物进入对数中期生长阶段，OD600介于0.8至1.2之间。

将总共2.5个OD单位的细胞转移至一个新的15毫升锥形管中以收获细胞。在室温下离心5分钟，去除上清液S。然后加入1毫升蒸馏水，通过涡旋或反复吹打重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至一个新的1.5毫升离心管中。

将细胞进行第二次离心，离心时间为30秒，室温条件下。去除上清液，并将细胞重悬于100微升蒸馏水中。向细胞悬液中加入100微升0.2摩尔的氢氧化钠，上下吹打数次以混匀，然后在室温下孵育5分钟。为避免细胞过早裂解，请勿涡旋振荡细胞。

再次通过第三次离心（30秒）分离细胞。在室温下，弃去细胞上清液，并通过将沉淀重悬于50至100 µL的1×Lamby样品缓冲液中来裂解细胞；将悬液在95°C孵育5分钟以使所有蛋白质变性，然后将全细胞裂解液置于冰上冷却5分钟。在检测易聚集蛋白（如含有多个跨膜片段的蛋白）的丰度时，可通过经验确定最佳变性孵育条件：起始条件可采用70°C孵育10分钟，而非95°C孵育5分钟。

最后，将裂解液在室温下离心一分钟，分离可溶性组分，将上清液转移至新的离心管中，并弃去不溶性沉淀部分。可溶性组分可直接上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳分析，或在-20 °C条件下保存，用于后续基于酵母生长的蛋白质降解实验。一种不稳定的三联融合蛋白与一个额外的代谢酶相融合，该代谢酶能够互补缺乏相应代谢基因的酵母菌株背景。

当融合蛋白在酵母中表达时，容易在内质网膜上发生无效的转运事件。这种异常转运会引发泛素介导的整个蛋白（包括代谢酶）的降解，从而阻止细胞增殖。然而，在缺乏泛素连接酶的酵母菌株中，即使发生正常的转运，融合蛋白也能免于降解，从而使细胞得以增殖。

因此，在存在泛素连接酶的情况下，细胞内蛋白质降解与酵母细胞在代谢物耗尽的琼脂平板上无法增殖之间存在对应关系。另一方面，当泛素连接酶有缺陷或缺失时，细胞增殖表明融合蛋白免于降解，从而降低了背景信号或非特异性生长，提高了该检测方法的严谨性。可在培养基中添加代谢酶的竞争性抑制剂，以验证酵母生长实验中观察到的结果。

融合蛋白降解的直接证据也可通过蛋白质印迹（Western blot）进行确认。在存在或不存在泛素连接酶的情况下，融合蛋白将分别被降解或免于被破坏。需要牢记的是，这些实验步骤最直接反映的是目标蛋白的稳态丰度。

在完成这些操作后，可进行脉冲或环己酰亚胺追踪分析，以直接研究蛋白质降解动力学以及检测发现可提高稳态蛋白质水平的突变。