成长型测定和遗传需求生化确认的蛋白质降解酿酒酵母
February 16th, 2015
本文介绍了一种基于酵母生长的测定方法，用于确定蛋白质降解的遗传需求。它还展示了一种快速提取酵母蛋白的方法，适用于蛋白质印迹以生化确认降解要求。这些技术可用于监测各种蛋白质的降解。
以下实验的总体目标是快速确定 Croce Visier 中不稳定蛋白质降解的遗传要求。这是通过在特定选择性条件下生长所需的报告酶与目标不稳定蛋白融合来实现的。接下来，将表达融合蛋白的野生型或突变型细胞在选择性培养基琼脂平板上培养。
铺板测定在酵母细胞生长的基础上提供了蛋白质稳定的便捷指标，以便通过快速低效的蛋白质提取方法裂解含有融合蛋白的突变细胞类型，从而对蛋白质丰度进行生化确认差异，以进行蛋白质印迹分析。结果表明，在降解所需基因发生突变的细胞中，不稳定蛋白质的丰度增加。对于具有降解能力的野生型菌株，情况正好相反。
与脉冲追踪和 Cycl heide 追踪分析等现有方法相比，该技术的主要优点是劳动强度和时间消耗更少，可以快速、高通量地测定蛋白质降解的遗传需求。尽管这种方法可以深入了解一系列不稳定蛋白质的降解要求。它还可用于鉴定基因表达其他方面的调节因子，例如转录和翻译。
演示这些程序的是 Sheldon Watts 和 Justin Crowder。我实验室的学生在测定之前，将编码由不稳定蛋白质和代谢报告酶组成的融合蛋白的质粒转化为突变酵母菌株。怀疑具有与蛋白质降解调控有关的遗传缺陷作为对照，也将相同的质粒转化到野生型酵母菌株中。
将转化体接种在 5 mL 选择细胞的最小培养基中，其中含有质粒分子。将试管放入倾斜的旋转器中，第二天在 30 摄氏度下孵育过夜。测量过夜培养物的光密度，然后用新鲜培养基和无菌单个 1.5 毫升离心管将每种培养物稀释至 OD 600 为 0.2，以均衡所有细胞的细胞浓度。
要开始主要分析，首先将 200 微升每种预稀释菌株（从 0.2 的 OD 600 开始）转移到无菌 96 孔板第一列的指定孔中，以准备后续稀释，设置六倍稀释系列基质，使用多通道移液器将 125 微升无菌水加入第二列的空孔中， 三和四。接下来，将 25 微升酵母从第一列转移到第二列，上下移液几次以均匀混合细胞，然后继续将 25 微升细胞从第二列转移到第三列。重复连续稀释步骤，直到第 4 列中的孔充分混合，作为细胞点样的视觉辅助。
打印出网格模板并将其贴在培养皿盖的内侧，从连续稀释基质中浓度最低的色谱柱开始。从每根柱子中转移 4 μL 细胞。在 96 孔板上，将选择用于细胞内质粒维持的对照最小培养基琼脂板上 将每根柱中的另外 4 微升细胞点到单独的最小培养基琼脂板上，该培养基培养基为两种细胞内质粒选择。
不稳定融合蛋白的维持和表达。让两块板在工作台上晾干 5 到 10 分钟。用 param 密封盖子以防止脱水，并将细胞在 30 摄氏度下孵育 2 到 6 天。
当来自生长最快的培养物的菌落首次在给定板上最稀释的位置可见时，从培养箱中取出板并记录生长程度。拍摄照片时，可能需要在不同日期拍摄不同车牌的照片，或在多天拍摄同一车牌的照片。在表现出广泛生长速率的不同酵母菌株的情况下，因此生化证实在生长测定中鉴定的基因调节蛋白质丰度首先用编码上述融合蛋白的质粒转化野生型和突变型酵母菌株，将转化体接种在 5 毫升选择用于细胞内质粒维持的最低培养基中，并将试管在 30 摄氏度倾斜的旋转器中孵育过夜。
第二天，测量每种过夜培养物在 600 的光密度。一旦所有菌株的 OD 600 达到 0.4 或更高，用新鲜培养基将所有培养物稀释回 0.2，使每个菌株的最终体积为 10 毫升。在 30 摄氏度平台摇床上孵育细胞，直到所有培养物达到 OD 600 的对数中期生长，介于 0.8 和 1.2 之间。
通过将 2.5 个总 OD 单位的细胞转移到新鲜的 15 毫升锥形管中来收获细胞。在室温下离心细胞 5 分钟，并去除 S 上清液。然后加入 1 毫升蒸馏水涡旋或上下移液以重悬上颚，并将细胞悬液转移到新鲜的 1.5 毫升试管中。
通过第二次离心分离细胞 30 秒 在室温下，去除 snat 并将细胞重悬于 100 μL 蒸馏水中。向细胞悬液中加入 100 μL 0.2 摩尔氢氧化钠，上下移液数次以混合并在室温下孵育样品 5 分钟，以避免细胞过早裂解。不要涡旋细胞。
再次离心 30 秒，离心细胞。在室温下，从细胞中去除上清液，并将沉淀悬浮在 50 至 100 μL 的 1 x Lamby 样品缓冲液中，通过在 95 摄氏度下孵育 5 分钟来使所有蛋白质变性，然后将整个细胞裂解物在冰上冷却 5 分钟。为了测定易聚集蛋白质（例如具有多个跨膜段的蛋白质）的丰度，通过在 70 摄氏度下开始 10 分钟而不是在 95 摄氏度下启动 5 分钟，凭经验确定最佳变性孵育、温度和时间。
最后，通过在室温下离心裂解物 1 分钟来分离可溶性组分，将 snat 转移到新试管中，并丢弃不溶性沉淀组分。可溶性组分现在可以直接加载到 SDS 页面上，凝胶或储存在负 20 摄氏度下，以设置基于酵母生长的蛋白质降解分析。不稳定的三重融合蛋白与额外的代谢酶融合，该代谢酶补充了缺乏相同代谢基因的酵母菌株背景。
当融合蛋白在酵母中表达时，它容易在内质网膜上发生贫瘠易位事件。这种异常易位触发泛素介导的整个蛋白质（包括代谢酶）的降解，从而阻止细胞增殖。然而，在缺乏泛素连接酶的酵母菌株中，融合蛋白受到保护，不会降解，即使在平均易位时，细胞也能增殖。
因此，在泛素连接酶存在的情况下，细胞内发生的蛋白质降解与酵母细胞在代谢物耗尽的琼脂平板上无法增殖之间存在对应关系。另一方面，在泛素连接酶缺陷或缺失的情况下，细胞增殖表明融合蛋白受到保护，免受降解，以减少背景或虚假生长，并提高该测定的严格性。可以将代谢酶的竞争性抑制剂添加到生长培养基中，以确认在酵母生长测定中观察到的结果。
融合蛋白降解的直接证据也可以通过 western blot 确定。在存在或不存在泛素连接酶的情况下，融合蛋白将分别被降解或免于破坏。重要的是要记住，这些程序最直接地报告了目标蛋白质的稳态丰度。
在进行这些程序后，可以进行脉冲或放线菌酮追踪分析，以便直接分析蛋白质降解动力学和发现的增加研究状态蛋白质水平的突变的存在。
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概述
本文介绍了一种基于酵母生长的检测方法，用于确定蛋白质降解的遗传要求。它还演示了一种快速提取酵母蛋白质的方法，适用于通过西方印迹法生物化学地确认降解要求。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 理解蛋白质降解对细胞调节至关重要。
- 酵母是研究遗传功能的模式生物。
- 蛋白质稳定性可以通过生长测定法评估。
- 西方印迹法是蛋白质分析的标准技术。
研究目的
- 确定不稳定蛋白质降解的遗传要求。
- 开发从酵母中快速提取蛋白质的方法。
- 使用生物化学方法确认蛋白质丰度的差异。
使用的方法
- 将报告酶融合到感兴趣的不稳定蛋白质上。
- 在选择性培养基上培养野生型和突变型酵母细胞。
- 使用平板测定法通过细胞生长指示蛋白质稳定性。
- 快速提取蛋白质用于西方印迹分析。
主要结果
- 缺乏降解基因的突变细胞中不稳定蛋白质的丰度增加。
- 野生型菌株显示蛋白质水平降低，表明有效降解。
- 该测定法提供了一种评估蛋白质稳定性的可靠方法。
- 结果支持特定基因在蛋白质降解途径中的作用。
结论
- 该研究成功识别了影响蛋白质降解的遗传因素。
- 开发的方法可以适用于各种蛋白质。
- 这种方法增强了对细胞中蛋白质调节的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid identification of genetic requirements for protein degradation is critical for de-risking early discovery and validating mechanistic hypotheses in eukaryotic systems. This growth-based yeast assay enables high-throughput interrogation of protein stability, supporting predictive confidence in target validation and functional genomics. The approach streamlines portfolio triage by linking genetic perturbations to protein fate, informing risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of genetic dependencies underlying protein degradation pathways.
- Supports functional target validation by linking genotype to protein stability phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking through rapid identification of degradation regulators.
- Improves predictive confidence for advancing targets with defined degradation control.
Screening & Assay Development
- Provides a scalable, growth-based readout for screening genetic mutants affecting protein turnover.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis across strains.
- Prepares validated biological systems for downstream biochemical confirmation via western blotting.
- Enables efficient triage of candidate regulators for further mechanistic study.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant pathways where protein degradation is implicated in pathology.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical model validation of degradation mechanisms.
- Reduces translational risk by confirming genetic control over protein fate in a model eukaryote.
- Facilitates biomarker alignment when protein stability is a translational endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
This assay positions within the early discovery continuum, bridging genetic perturbation to functional protein outcomes and informing lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on genetic control of protein degradation and pathway mapping.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative growth outputs for mutant comparison and triage.
- Analytics: Enables biochemical confirmation of protein abundance via rapid extraction and western blotting.
- Translational Research: Provides a foundation for extending findings to disease-relevant systems where protein turnover is critical.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse unstable proteins and genetic backgrounds for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with high-throughput, standardized, and reproducible assays.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and protein biochemistry for assay setup and interpretation.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and western blotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across different unstable proteins and genetic backgrounds with protocol optimization.
- Assay stringency and background growth must be empirically controlled for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:44
Protein Degradation Mutant Identification Using a Yeast Growth Assay
5:06
Biochemical Confirmation of Protein Degradation Defects
8:29
Results: Ubiquitin Ligase-dependent Degradation of an Unstable Protein Fused to a Metabolic Reporter
10:18
Conclusion
