Name: 对源自液体和固体肿瘤癌症细胞定量蛋白质组质谱剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习使用Super-SILAC质谱技术对液体和实体肿瘤癌细胞进行定量蛋白质组学分析。该方法通过细胞富集和激光捕获显微切割技术，帮助研究人员识别药物靶点和诊断生物标志物。

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作者感谢 Uwe Plessmann、Monika Raabe 和 Silvia Münch 提供的技术支持。

所有涉及人体组织或血液样本的实验必须经过伦理委员会批准，并依照伦理审查意见中的各项规定进行。
1. 细胞富集
<ol>
	<li>液体肿瘤/荧光激活细胞分选
	<ol>
		<li>通过使用氯化铵裂解红细胞或采用Ficoll密度梯度离心法，从骨髓或血液样本中分离单个核细胞。
		<ol>
			<li>为裂解红细胞，将1 ml样本与4 ml氯化铵溶液混合。冰上孵育5–10分钟。加入40 ml含2%胎牛血清（FCS）的磷酸盐缓冲液（PBS），在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。</li>
			<li>采用Ficoll梯度离心法时，将10 ml样品小心地叠加于15 ml Ficoll-Hypaque上，形成两个清晰的液层（注意勿搅动液层）。在室温（15 - 25 °C）下以400 × g离心30分钟，小心收集位于两相界面处的单个核细胞。</li>
			<li>离心细胞并用含2% FCS的PBS重悬。以400 × g离心5分钟，再用1 ml含2% FCS的PBS重悬。取一份作为阴性对照，其余每份用于最终染色中的每种荧光染料。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在冰上按照制造商说明书推荐的稀释比例，加入荧光标记抗体孵育30分钟，以用于分离白血病细胞群体。同时，分别使用每种抗体单独染色用于补偿调节的 aliquot 样品。用 PBS + 2% FCS 洗涤两次。 
		注：所用抗体为针对人源的鼠源单克隆抗体，分别为 CD117-PE（克隆号 95C3）、CD34-FITC（克隆号 8G12）和 CD33-PE（克隆号 P67.6）。</li>
		<li>使用35 µm细胞滤网过滤细胞，最好采用带有整合式细胞滤网的离心管。</li>
		<li>加入细胞活力染料（例如， 7-AAD）。使用合适的细胞分选仪对细胞进行分选11 (图2用含10% FCS的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）收集细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实体瘤/激光捕获显微切割
	<ol>
		<li>在所述实验中，使用了肺癌标本的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。为此，肺癌组织在手术切除后立即用4%缓冲福尔马林固定，并将约3 x 2 x 1 cm大小的组织块包埋于石蜡中，以供进一步分析。</li>
		<li>使用切片机从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中切下5–10 µm厚的切片。将切片置于覆膜载玻片上，37 °C下干燥1小时。依次在二甲苯、无水乙醇、70%乙醇和水中孵育，每步1分钟，以脱蜡并复水。</li>
		<li>用苏木精对切片染色20秒，然后用自来水冲洗。利用激光捕获显微切割系统收集目标细胞群体（另见 12).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质提取
<ol>
	<li>液体肿瘤。
	<ol>
		<li>将步骤 1.1.5 得到的细胞悬液在 400 × g、4 °C 条件下离心 4 分钟，弃上清。用 500 µl 冷 PBS 洗涤两次，每次在 400 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>每 106 个细胞加入 40 µl 裂解缓冲液，冰上孵育 15 分钟（细胞数量应不少于 105 个细胞，约含总蛋白 10 µg）。将裂解液在 14,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，将上清（澄清的细胞裂解液）转移至新的反应管中，弃沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实体肿瘤。
	<ol>
		<li>向显微解剖的组织中加入 60 µl 组织裂解缓冲液，冰上孵育 15 分钟，短暂离心收集液体，将悬液转移至新的反应管中。在冰上超声裂解 3 分钟。</li>
		<li>加入 15 µl 20% 十二烷基硫酸钠（SDS），使 SDS 的终浓度为 4%。将显微解剖的组织在加热模块中于 99 °C 孵育 1 小时，并以 600&#160;rpm 振荡。将裂解液在 16,000 × g、18 °C 条件下离心 10 分钟，将上清转移至新的离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 建立SILAC内标定量标准（超级SILAC标准）
注意：定量标准品由来源于4至6种细胞系的SILAC标记蛋白质混合物组成，这些细胞系应与目标肿瘤类型相匹配。为了使SILAC标记的参考蛋白质组与肿瘤来源的蛋白质组之间实现最大程度的覆盖，在选择用于定量标准品的细胞系之前，需要进行主成分分析14。
<ol>
	<li>主成分分析（PCA）。
	<ol>
		<li>为确定细胞系的蛋白质表达模式，使用适当的细胞培养基培养约十种不同的细胞系。按照步骤 2.1 所述方法裂解细胞。按照步骤 6.1 所述方法制备细胞裂解液用于质谱分析。</li>
		<li>在高分辨率的液相色谱-质谱联用仪（nanoLC-MS/MS）上分析每个细胞系的蛋白质表达模式。</li>
		<li>使用免费软件 MaxQuant 分析获得的原始数据，并利用相关软件（如 Perseus16,17）进行主成分分析。</li>
		<li>选择在蛋白质表达谱上表现出最大差异的 4 至 6 个细胞系，用于生成 Super-SILAC 内标标准品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SILAC 标记及标记效率检测。
	<ol>
		<li>将选定的细胞系在适当的 SILAC 细胞培养基中培养至少五个细胞周期，其中精氨酸和赖氨酸被碳和氮的稳定同位素标记（SILAC 培养基）4。</li>
		<li>按照步骤 3.1 所述方法裂解细胞，并按照步骤 6.1 所述方法制备细胞裂解液用于质谱分析。通过 nanoLC-MS/MS 检测 SILAC 标记的掺入效率。使用 MaxQuant 分析所得的原始质谱数据，并确定 SILAC 标记效率。该过程通过统计被鉴定肽段的标记形式（重链）和内源形式（轻链）的数量，并计算其比值（重链）/（重链 + 轻链）来实现。标记效率应超过 98%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SILAC 蛋白质组的混合与验证。
	<ol>
		<li>根据生产商说明书，在适当的 SILAC 培养基中培养并扩增选定的细胞系。按照步骤 2.1 所述方法裂解液体肿瘤细胞，或按照步骤 3.2 所述方法裂解实体肿瘤细胞，并测定每种细胞裂解液的蛋白浓度。</li>
		<li>将各细胞系的蛋白以等摩尔量混合，并将混合物分装成若干 aliquot。迅速冷冻分装样品并储存在 -80°C 直至使用。每次实验需要 20 - 50 µg 的 Super-SILAC 内标标准品。请注意应过量制备该标准品，以避免在同一系列实验中更换标准品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质浓度测定与内参添加
<ol>
	<li>液体肿瘤。
	<ol>
		<li>使用蛋白质定量分析法测定相应细胞裂解液和Super-SILAC标准品的蛋白质浓度。</li>
		<li>将等量的澄清细胞裂解液与Super-SILAC标准品混合，随后加入十二烷基硫酸锂（LDS）缓冲液（占样品体积的25%）和还原剂（占样品体积的10%）。</li>
		<li>将所得溶液置于加热块中，在72 °C下加热10分钟。可选步骤：将变性后的蛋白质在-80 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实体肿瘤。
	<ol>
		<li>在酶标仪上进行蛋白质浓度测定前，将标准牛血清白蛋白（BSA）稀释液系列、裂解液以及相应的Super-SILAC标准品与市售蛋白质检测试剂在96孔板中混合，振荡1分钟，按制造商说明孵育指定时间并测定吸光度。 
		注意：裂解液中高浓度的SDS和二硫苏糖醇（DTT）会对大多数现有的蛋白质浓度测定方法造成干扰。</li>
		<li>在滤膜装置中，将等量的澄清裂解液和Super-SILAC标准品与200 μl尿素混合，在20 °C下以14,000 × g离心30分钟。澄清裂解液和Super-SILAC标准品的总体积不得超过50 µl。避免温度低于15 °C，以防尿素析出结晶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 样品分离与蛋白质消化
<ol>
	<li>液体肿瘤
	<ol>
		<li>在4–12%的梯度SDS-PAGE凝胶中，每泳道上样30–100 µg总蛋白。用考马斯亮蓝染色过夜。用去离子水洗涤两次，去除多余的考马斯亮蓝染料。</li>
		<li>将凝胶的每条泳道切下，并无论染色模式如何，均切成23个大小相等的胶片。将各胶片分别放入0.6 ml聚丙烯管中独立处理。</li>
		<li>用清水和甲醇/水（50:50，v/v）洗涤胶块，加入10 mM DTT，在56 °C孵育30 min进行还原。在避光条件下，室温下用55 mM碘乙酰胺（IAA）孵育60 min，对胶块进行烷基化。</li>
		<li>在样品处理步骤之间，用乙腈洗涤切片15分钟，并在 a 使用SpeedVac去除过量溶剂，以提高试剂溶液的吸收效率。</li>
		<li>用胰蛋白酶溶液（12.5 ng/µl 溶于 0.025 M 碳酸氢铵水溶液）重新水化干燥的凝胶切片，于 37°C 孵育 16 小时，进行蛋白酶消化。</li>
		<li>加入10 µl水至凝胶切片中，在37 °C孵育15分钟。加入80 µl乙腈，在37 °C孵育15分钟。在15,800 x g离心1分钟。收集上清液，储存于另一个0.6 ml离心管中。</li>
		<li>加入65 µl 5%甲酸溶液，涡旋混匀，37 °C孵育15分钟。加入65 µl乙腈，37 °C孵育15分钟。以15,800 x g离心1分钟。收集上清液，并与前一步骤的上清液合并。在真空浓缩仪中将合并后的上清液完全蒸发至干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实体瘤。
	<ol>
		<li>为从组织裂解液中去除SDS，请使用以下FASP方案，该方案亦如参考文献所述15.</li>
		<li>在步骤5.2.3所述的第一次离心后，向滤膜上再加入200 μl的8 M尿素，然后在20 °C下以14,000 × g离心20分钟。弃去穿滤液.</li>
		<li>加入100 μl IAA，在恒温混匀仪中以600 rpm混匀1分钟。将滤膜于20 °C避光孵育20分钟。在20 °C下以14,000 x g离心10分钟。</li>
		<li>加入100 μl尿素至滤膜中，在20 °C下以14,000 × g离心15 min。重复此步骤一次。</li>
		<li>加入 100 μl NH4HCO3 将滤液加入离心管，于20 °C、14,000 x g条件下离心10分钟。重复此步骤两次。</li>
		<li>加入40 μl NH4HCO3 加入1 µl（= 0.4 µg）胰蛋白酶，在20 °C、600 rpm条件下于恒温混匀仪中混匀1分钟。将滤膜置于湿盒中，37 °C过夜孵育。将滤膜转移至新的收集管中。</li>
		<li>在20 °C下以14,000 × g离心滤器10分钟。加入50 μl NH4HCO3 以14,000 g离心滤器10分钟，温度为20°C。将获得的肽段于-20°C保存，直至进行质谱检测。</li>
		<li>为测定肽浓度，取50 µl收集的穿流液及一系列未稀释的色氨酸适当稀释液，加入96孔板中。检测色氨酸荧光信号。将测得的色氨酸浓度换算为肽浓度，其中0.1 μg色氨酸相当于9 μg蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 液相色谱与质谱分析
<ol>
	<li>将肽段在超声水浴中用30 µl上样缓冲液重新溶解5分钟。在离心机中以15,800 × g离心1分钟，用移液器将澄清溶液转移至质谱自动进样瓶中。</li>
	<li>使用nanoLC-MS/MS系统的自动进样器，每次分析进样5 µl样品。在反相C18预柱（内径0.15 mm × 长度20 mm，填料为5 µm孔径C18材料）上在线富集并脱盐肽段，该预柱可安装于通气柱系统或预柱切换系统中。</li>
	<li>在反相C18微柱（内径0.075 mm × 长度200 mm，使用3 μm或更小孔径C18材料自装填于如PicoFrit的自装纳米喷雾柱）上分离肽段，采用90分钟梯度，以300 nl/min流速从5&#62;35%乙腈对比0.1%水相甲酸进行洗脱。通过纳米喷雾离子源将洗脱液导入杂交四极杆/轨道阱质谱仪。</li>
	<li>采用Top15数据依赖采集模式分析肽段（MS m/z 范围350–1600，分辨率目标70,000 FWHM，AGC目标1 × 106，最大填充时间60毫秒；MS/MS起始质荷比100，分辨率目标17,500 FWHM，AGC目标2 × 105，最大填充时间60毫秒；MS/MS阈值3 × 104，包含电荷态2–5，归一化碰撞能量NCE 25%，动态排斥时间15秒）。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>对于数据分析，使用免费的 MaxQuant16 软件。生物信息学数据分析的详细方案见文献16,17。分析时，将 SDS-PAGE 胶道中所有切片的原始数据文件合并为一个实验进行分析17。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突或其他问题需要披露。

为了发现新的诊断性/预测性生物标志物，并更深入地理解癌细胞生物学，从而可能识别出新的潜在药物靶点，需要对患者来源的癌细胞蛋白质组进行质谱分析。然而，此类质谱分析极具挑战性，尤其因为必须解决多种分析前问题，才能获得可靠且具有生物学意义的结果。
本文所述的实验流程可实现对源自液体和实体肿瘤细胞亚群的蛋白质组进行定量蛋白质组学表征。需通过基于FACS的细胞分选或显微切割技术对肿瘤细胞进行初步富集，以避免肿瘤微环境中的细胞污染。此外，这些技术还可用于分离感兴趣的细胞亚群。近年来的细胞生物学研究表明，某些细胞亚群具有肿瘤起始特性，因此在癌症发病机制中具有重要意义19,20。随着质谱技术近年来灵敏度的不断提高，即使仅从数千个细胞中提取的微量蛋白质，也可进行定量蛋白质组学分析，从而能够聚焦于功能上具有重要意义的细胞群体。
本文介绍的实验方案可用于鉴定和验证福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的新型诊断性生物标志物。因此，该方法有望成为改进临床诊断的有力工具，因为迄今为止，许多癌症类型仍缺乏足够数量和质量的分子生物标志物。一些难以进行鉴别诊断的重要实例包括：原发性肺癌与肺转移瘤的区分、胰内胆管细胞癌与胰腺导管腺癌的鉴别，以及良性神经纤维瘤与高度恶性的周围神经鞘膜肿瘤的区分。此外，我们及其他研究团队已证实，对蛋白质组特征进行定量解析不仅有助于深入研究癌症细胞生物学，还可用于发现癌症患者对治疗反应的预测性生物标志物21。
该方法目前存在的两个缺点是需要大量的人工样品处理以及对纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）采集时间的需求。前者可通过将样品制备转移至 例如， 96孔板格式并结合机器人处理，后者将需要改变质谱采集策略。一旦鉴定出可与目标蛋白质子集相关联的 例如， 肿瘤分类，我们设想设计靶向质谱方法，以对这些亚群提供定量检测结果，同时大幅减少分离工作量，从而相应地缩短采集时间。若所需的采集时间能够从24至36小时（液体肿瘤）或3小时（固体肿瘤）缩短至 例如， 使用靶向质谱技术并结合肽段的一维简单分离，可在1小时内完成分析，由此提高的通量可用于显著增加所检测的生物学重复和技术重复的数量，从而相应提升定量结果的统计学显著性。已有研究证明，靶向质谱方法是验证癌症相关蛋白质生物标志物候选物的合适工具。22，并已发展到显示出可用于验证甚至作为常规临床应用潜在工具的前景23,24.

基于质谱的蛋白质组学已经兴起，并成为细胞生物学和转化生物医学研究中广泛应用的学科。该领域的技术进步使得在细胞系和动物模型中研究复杂的细胞过程成为可能，因为在单次质谱实验中即可鉴定出数千种蛋白质1,2。对于多种翻译后修饰（如磷酸化或泛素化）的分析也取得了类似的进展，尽管这通常需要针对每种修饰类型设计特定的富集方法和数据分析流程2,3。此外，化学标记和代谢标记策略（包括SILAC）的应用能够实现对蛋白质及翻译后修饰的精确定量比较，使该方法在揭示基本细胞过程、发现诊断性生物标志物以及人类癌症中潜在药物靶点方面具有显著优势4。
然而，在原发性人类癌症的蛋白质组学分析方面，仍需克服若干挑战5。首先，人类癌症样本通常表现出高度的细胞异质性，这是由于肿瘤微环境中存在多种细胞类型，包括免疫细胞和成纤维细胞所致。其次，克隆进化导致肿瘤内部出现遗传多样性，从而形成具有不同功能特性的多个细胞亚群。根据目前认为少数癌症干细胞是驱动癌症发生和进展的关键因素这一概念，对这些在功能上高度相关的细胞亚群进行蛋白质组学分析，有望对理解与临床应用相关的致癌机制具有重要意义6。第三，为了鉴定可靠的临床生物标志物，通常需要对大量样本进行定量蛋白质表达谱分析；而化学标记方法（如iTRAQ7）难以实现这一目标，代谢标记策略则依赖于细胞增殖4，同样不适用于此类分析。第四，大多数现有的实体瘤样本均为福尔马林固定，由于蛋白质交联的形成，给质谱蛋白质组分析带来困难8。最后，大多数现有的蛋白质组学工作流程需要大量的样品处理和数据采集，使得针对临床研究所需样本量的分析变得困难，因而亟需新的工作流程范式9,10。
为克服这些障碍，我们开发了一种实验方案，该方案结合了流式细胞分选11或激光捕获显微切割12,13技术用于细胞富集，并采用Super-SILAC14策略引入全局内标，以实现全面的质谱分析。通过使用此处所述的方法，可在来自液体或实体肿瘤的单个人类肿瘤样本中定量检测多达8,000种蛋白质。

<table><tbody><tr><td>660 nm 试剂盒</td><td>Thermo scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>缺乏精氨酸和赖氨酸的细胞培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>88421</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250 染色液</td><td>Bio Rad</td><td>161-0436</td><td></td></tr><tr><td>透析胎牛血清（FCS）</td><td>PAA</td><td>A15-107</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖用弥散帽</td><td>MMI</td><td>50202</td><td></td></tr><tr><td>FACS 分选仪</td><td>BD</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>离子型去垢剂兼容试剂</td><td>Thermo scientific</td><td>22663</td><td></td></tr><tr><td>激光捕获显微切割系统</td><td>MMI&amp;nbsp;</td><td>cell cut plus</td><td></td></tr><tr><td>LDS 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>显微切割用膜片</td><td>MMI</td><td>50103</td><td></td></tr><tr><td>Microcon YM-30</td><td>Millipore</td><td>MRCF0R030</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini 凝胶</td><td>Life Technologies</td><td>NP0335PK2</td><td></td></tr><tr><td>Picofrit 自填充柱</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td>质谱柱/喷雾头</td></tr><tr><td>还原剂</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur LC/MS/MS 分析柱固定相</td><td>Dr. Maisch</td><td>120 C18-AQ, 3 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur LC/MS/MS 预柱固定相</td><td>Dr. Maisch</td><td>120 C18-AQ, 5 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>SILAC 标记的精氨酸</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2265-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SILAC 标记的赖氨酸</td><td>Eurisotop</td><td>DLM-2640-0.25</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，NB 测序级</td><td>Serva</td><td>3728301</td><td>用于胶内酶解</td></tr><tr><td>胰蛋白酶，测序级</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>用于溶液中酶解</td></tr><tr><td>缓冲液与溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液：150 mM NaCl，50 mM Tris/HCl pH 7.8，5 mM NaF，&amp;nbsp;0.5% NP40，0.1% 十二烷基麦芽糖苷，Roche 完整蛋白酶抑制剂，1 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织裂解缓冲液：100 mM Tris/HCl pH 7.8，0.1 M DTT&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素：8 M 尿素溶于 0.1 M Tris-HCl，pH 8.5</td><td></td><td></td><td>用于 FASP 方案</td></tr><tr><td>IAA：0.05 M 碘乙酰胺，8 M 尿素，0.1 M Tris-HCl，pH 8.5</td><td></td><td></td><td>用于 FASP 方案</td></tr><tr><td>0.05 M NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM 二硫苏糖醇（DTT）溶于 0.1 M 碳酸氢铵</td><td></td><td></td><td>用于胶内酶解</td></tr><tr><td>55 mM 碘乙酰胺（IAA）溶于 0.1 mM 碳酸氢铵</td><td></td><td></td><td>用于胶内酶解</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;5% 甲酸水溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

源自液体和实体肿瘤的癌细胞蛋白质组的定量质谱分析

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

深入分析癌细胞的蛋白质组对于阐明肿瘤发生相关的病理机制，以及发现潜在的药物靶点和诊断生物标志物至关重要。然而，目前尚缺乏对患者来源的肿瘤组织、特别是其细胞亚群进行定量蛋白质组学表征的有效方法。本文介绍一种实验方案，可实现对源自液体或实体肿瘤的癌细胞亚群蛋白质组的定量分析。该方法通过将细胞富集策略与基于定量Super-SILAC的质谱技术相结合，并辅以生物信息学数据分析来实现。为富集特定细胞亚群，液体肿瘤首先通过流式细胞术进行免疫表型分析，随后采用荧光激活细胞分选（FACS）进行分选；对于实体肿瘤，则采用激光显微切割技术以纯化特定的细胞亚群。第二步，从纯化的细胞中提取蛋白质，并与特异性的、采用SILAC标记的“内标”标准品混合，从而实现蛋白质的定量。所得的蛋白质混合物随后进行凝胶电泳或滤膜辅助样品制备（FASP）处理，并进行胰蛋白酶消化。最后，利用混合型四极杆-轨道阱质谱仪分析胰蛋白酶消化产生的肽段，所得数据通过包括MaxQuant在内的生物信息学软件套件进行处理。通过本方案，可在患者来源的样本中鉴定并定量多达8,000种蛋白质，并可在不同患者之间比较所获得的蛋白质表达谱，以识别具有诊断价值的蛋白质组特征或潜在的药物靶点。

对患者来源的液体和实体肿瘤进行蛋白质组学分析，是发现新的诊断性和预测性生物标志物的有前景方法。然而，由于样本本身的复杂性以及在大量样本中进行精确蛋白质定量的需求，样品制备过程和质谱分析仍具有挑战性。上述实验流程从分离目标细胞开始，可通过荧光激活细胞分选或激光捕获显微切割实现。
为此，将来自患者骨髓穿刺液或血液样本的细胞用针对特定表面标志物的荧光标记抗体进行染色，然后进行基于流式细胞术的分选和细胞裂解。
为了从组织切片中富集特定的细胞亚群，首先需要将组织切片固定在适当的载玻片上，以便进行激光捕获显微切割。为此，应将组织切片置于专用的膜片载玻片上，并根据制造商的说明使用激光捕获显微切割仪。选择目标区域和感兴趣细胞需要具备关于正常组织与肿瘤组织组织形态学的充分知识。捕获的细胞随后被转移至合适的收集管中。对于每种新的目标组织，应先开展初步实验，以确定提取足够量蛋白质（至少10 µg总蛋白）所需的组织量。每个显微切割样本加入60 µl组织裂解缓冲液。为实现有效裂解，需对组织样本中的细胞进行3分钟超声处理；加入15 µl SDS后，将样本在99 °C的恒温混匀仪中孵育1小时，以去除福尔马林引起的蛋白质交联。最后通过离心，便于收集澄清的细胞裂解液。
针对每一种感兴趣的疾病（液体和实体肿瘤），必须建立相应的超SILAC定量标准14。一个合适的定量标准应能代表待测样本中超过90%的表达蛋白。在制备定量标准时，应首先通过质谱分析与目标癌症类型相关的细胞系，以确定其蛋白质表达谱，随后进行主成分分析。应选择4至6种具有不同蛋白质表达模式的细胞系，并使用“重”同位素标记的精氨酸和赖氨酸进行SILAC标记。标记效率需通过纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）检测，并确保高于98%。随后，细胞系应采用与相应患者来源样本相同的方法进行裂解，并将各细胞系等摩尔量的蛋白质与SILAC内标定量标准混合。对感兴趣的临床样本进行准确蛋白质定量的关键步骤，是将患者来源样本与SILAC内标定量标准以等摩尔蛋白质含量精确混合。为测定分选细胞来源裂解液的蛋白质浓度，可采用多种蛋白质定量检测方法。对于组织来源细胞的细胞裂解液，需使用能够耐受裂解液中高浓度SDS和DTT的检测方法。每次与相应临床样本混合前，均应测定患者来源样本和SILAC内标定量标准的蛋白质浓度，以确保混合的准确性，这对于实现数百个样本之间的可比性至关重要。
将等量的外源添加标准品与裂解液混合后，从液体肿瘤获得的样品与LDS混合，在72 °C的热混仪中加热10分钟，随后进行一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE），并对凝胶中分离出的蛋白质进行胰蛋白酶原位消化。从组织获得的样品则采用Wisniewski等人et al.15建立的FASP方法去除SDS后，用胰蛋白酶进行消化。
可通过测量色氨酸荧光来定量所获得的胰蛋白酶消化肽段，这种方法特别适用于组织样品，因为从滤膜上洗脱出的肽段量与最初加载到滤膜上的蛋白量相比，差异可达15%至75%。为此，我们检测色氨酸的荧光强度。通过与适当的色氨酸稀释系列进行比较，可实现肽段的定量，因为1.1 µg色氨酸约相当于100 µg肽段。如有需要，特别是经FASP处理所得的样品，可在上样至纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC/MS/MS）系统前，使用商用或自制的反相C18（RP-C18）材料填充的StageTip进行预纯化18。
采用高分辨率、高灵敏度的质谱系统进行质谱分析。简而言之，肽段样品首先在反相C18预柱上进行脱盐和预浓缩，随后在直接连接至质谱仪的反相C18分析柱上进行分离。为了实现充分的分析深度，我们对液体肿瘤样本采用SDS-PAGE蛋白质预分级联合40分钟反相C18梯度洗脱，或对通过FASP方法处理的实体瘤样本采用单次进样并结合2至3小时的长梯度反相C18洗脱。质谱图谱以不低于70,000 FWHM的分辨率采集，以便通过对色谱峰轮廓积分实现SILAC配对样本的准确定量。在蛋白质鉴定方面，采用Top15数据依赖性采集模式，以产生大量肽段的MS/MS谱图，用于肽段和蛋白质的鉴定。
基于获得的原始数据，使用 MaxQuant 软件在 UniProt 知识库人源完整蛋白质组序列数据库中进行数据库搜索，从而实现蛋白质的鉴定与定量17。在 MaxQuant 软件（当前版本 1.5.0.25）中，通过将采集的 MS/MS 谱图与从蛋白质序列数据库经 in silico 模拟生成的肽段碎片谱图进行匹配，实现肽段的鉴定。同时，提取前体离子在其色谱保留时间附近的同位素轮廓，并利用其积分峰面积对 SILAC 标记产生的轻/重肽段对进行相对定量。随后将肽段的鉴定结果和相对强度信息归并至相应的蛋白质属性。接着使用 Perseus 软件（当前版本 1.5.0.15）对 MaxQuant 的处理结果进行进一步的下游统计分析，包括样本间比较、主成分分析（PCA）以及层次聚类分析。
利用所述实验装置，我们已从液态肿瘤来源的低至30 µg总蛋白中鉴定并定量了多达8,000种蛋白质。
采用 Shotgun 蛋白质组学方法，仅需 2 小时的液相色谱梯度，即可从实体瘤样本中鉴定并定量多达 2,500 种蛋白质，从而能够在相对较短的时间内分析数百个临床样本。
<img alt="液体和实体肿瘤蛋白质组学工作流程图、LC-MS/MS分析、FACS、SILAC、FFPE。" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验工作流程。本图展示了用于液体和实体肿瘤的细胞亚群富集、蛋白质分离、定量标准品添加以及质谱分析的主要步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析细胞标志物的流式细胞术散点图（A）和组织学组织切片（B）" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 细胞富集策略。 FACS 分选和 LCM。（A）代表性设门策略，显示通过细胞分选仪获取的 CD117 染色白血病细胞群的设门情况。（B）实体瘤组织的激光捕获显微切割。将厚度为 5 - 10 µm 的组织切片置于覆膜载玻片上，染色前进行固定。通过手动选择感兴趣区域用于激光捕获显微切割。图中显示显微切割前标记为黄色的感兴趣区域以及显微切割后的组织切片。图中包含 50 µm 的比例尺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SILAC 蛋白质表达热图，Z 分数 log2 比值，比较聚类分析图" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 人类癌细胞蛋白质组的聚类分析。 使用计算平台 Perseus 对液体肿瘤和实体瘤的蛋白质表达谱进行无监督聚类分析。AC – 腺癌，SCC – 鳞状细胞癌，SCC-Met – 头颈部癌症的鳞状细胞癌转移灶，R – 技术重复。

对癌细胞蛋白质组的深入分析有助于发现新的药物靶点和诊断生物标志物。本文描述了一种实验流程，用于定量分析源自液体和实体肿瘤的癌细胞亚群中的（磷酸化）蛋白质组。该方法通过将细胞富集策略与基于定量Super-SILAC的质谱技术相结合而实现。

深入分析癌细胞的蛋白质组对于阐明肿瘤发生机制以及识别潜在的药物靶点和诊断标志物至关重要。

本实验的总体目标是阐明液体和实体肿瘤的蛋白质表达谱。首先从患者来源的血液或组织样本中富集癌细胞，以实现这一目标。第二步，从癌细胞中分离蛋白质，然后与肿瘤特异性的SuSaq定量标准品混合。在最后一步中，对蛋白质混合物进行消化。最终，通过质谱分析来展示来自液体和实体肿瘤的蛋白质表达谱。该方法有助于回答肿瘤学和病理学领域的关键问题，例如如何鉴定药物靶点以及治疗耐药机制？尽管该方法可为生物标志物的发现提供见解，但也适用于其他系统，例如对多种实体瘤和液体肿瘤的研究。演示该实验操作的是病理学汉尼拔·伯杰研究所的Hannibal Berger博士，以及来自我实验室的Christophe Lanz博士。为进行流式细胞术的荧光分选，首先将悬浮于含2% FBS的PBS中的人外周单个核细胞样本取出1毫升作为阴性对照，另取1毫升用于最终染色中每种荧光染料的标记。接下来，将细胞与用于分离白血病细胞群的特异性抗体以及补偿对照所需的抗体在冰上孵育。30分钟后，用含2%FCS的PBS洗涤细胞两次。然后向相应的试管中加入细胞活力染料，并根据示意图对细胞进行分选。使用含10%FCS的IMDM收集样品，以便通过激光显微切割技术收集实体肿瘤。首先，使用切片机从福尔马林固定的石蜡包埋样本中切下5至10微米厚的切片。接着，将切片置于覆膜载玻片上，并在37摄氏度下干燥一小时。然后依次在二甲苯、无水乙醇、70%乙醇和水中孵育各一分钟，进行脱蜡和水化处理。然后用苏木精对切片染色20秒。用自来水冲洗，并使用激光显微切割系统收集目标细胞，以从分选后的液体肿瘤细胞中提取蛋白质。将样品离心三次，在第二和第三次离心时，每次用500 µL冷PBS洗涤细胞。接下来，每1×10⁶个细胞加入40 µL裂解缓冲液，孵育细胞。15分钟后，离心裂解液，并将含有上清液的澄清裂解液转移至新的反应管中，以提取显微切割的实体瘤细胞中的蛋白质。将组织样本与60 µL组织裂解缓冲液在72 °C下孵育。15分钟后，通过短暂离心收集液体，并将上清液转移至新的反应管中。然后将裂解液在冰上超声处理3分钟，随后在加热块中加入15微升20%十二烷基硫酸钠（SDS），于99摄氏度孵育，同时以600 RPM振荡。一小时后，离心裂解液，并将上清液转移至新管中。接下来，测定澄清的细胞裂解液和超速离心SLAC标准品的蛋白质浓度，然后将等量的肿瘤组织碎片与超速离心SLAC标准品混合，再加入锂。按样品体积的25%加入十二烷基硫酸盐缓冲液，按样品体积的10%加入还原剂。随后将所得溶液置于加热块中，在72摄氏度下加热10分钟。使用商用蛋白质检测试剂盒和96孔板，将标准牛血清白蛋白稀释液系列、组织裂解液以及适量的super SLAC标准品在酶标仪上混合，以测定实体瘤裂解液的蛋白浓度。振荡混匀1分钟后，将样品孵育适当时间，然后按照试剂盒说明书指示测定吸光度。随后，在滤膜装置中将等量澄清裂解液与super SLAC标准品同200微升尿素混合，离心30分钟。通过液相色谱和质谱分析来检测肿瘤细胞裂解液。首先，在超声波水浴中将目标肽段溶解于30微升上样缓冲液中，持续5分钟。然后离心蛋白质样品，并将澄清的上清液转移至质谱自动进样瓶中。接下来，每次分析将五微升样品注入纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）系统的自动进样器中，并在反相 C18 预装柱上在线富集和脱盐肽段。最后，在反相 C18 微柱连接的自装纳米喷雾柱上分离肽段。采用90分钟梯度洗脱，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为乙腈，梯度设置从5%至35%乙腈，流速为300纳升每分钟，然后使用纳米喷雾离子源电离并分析肽段。采用前15位数据依赖性采集方法，可使用不同类型的质谱仪对肽段进行分析。对患者来源的液体和实体肿瘤进行蛋白质组学分析，是发现新的诊断性和预测性生物标志物的有前景的方法。例如，本图展示了从液体肿瘤样本中分离CD117染色的白血病细胞的典型设门策略。而在此，如上所述，将厚度为5至10微米的切片置于覆有薄膜的膜载玻片上。如图所示，随后手动选择感兴趣区域，并通过激光显微切割技术进行分离。接着可通过质谱分析液体和实体肿瘤样本的蛋白质表达谱，进行无监督聚类分析，从而根据各自独特的蛋白质表达谱清晰区分不同肿瘤类型。这些数据最终可为建立具有临床意义的生物标志物提供支持。实施针对翻译后修饰（如磷酸化）或UIC通气的富集策略，也可用于回答其他问题，例如，在其形成后，如何鉴定失调的激酶模式？该技术为病理学和肿瘤学领域的研究人员探索多种癌症实体中的特异性生物标志物和信号通路奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何从癌症组织中分离出蛋白质亚群，并通过质谱技术分析其蛋白质表达模式和信号状态。

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