源自液体和实体肿瘤的癌细胞蛋白质组的定量质谱分析

本实验的总体目标是阐明液体和实体肿瘤的蛋白质表达谱。首先从患者来源的血液或组织样本中富集癌细胞，以实现这一目标。第二步，从癌细胞中分离蛋白质，然后与肿瘤特异性的SuSAC定量标准品混合。

在最后一步中，对蛋白质混合物进行消化。最终，通过质谱技术分析液体和固体肿瘤中的蛋白质表达谱。该方法有助于回答肿瘤学和病理学领域的关键问题，例如如何鉴定药物靶点以及治疗耐药机制？

尽管该方法可为生物标志物的发现提供见解，但也适用于其他系统，例如对多种实体瘤和液体肿瘤的研究。演示该实验步骤的是病理学汉尼拔·伯杰研究所的Hannibal Berger博士，以及我实验室的Christophe Lanz博士。为了准备用于流式细胞术荧光分选的液体肿瘤细胞，首先分别取1毫升用含2% FBS的PBS悬浮的人单个核细胞样本，作为阴性对照，以及每种最终染色所用荧光染料各1毫升。接下来，将细胞与用于分离白血病细胞群的相应抗体以及补偿对照抗体在冰上孵育。

30分钟后，用含2%FCS的PBS洗涤细胞两次。然后向相应的试管中加入细胞活力染料，并根据示意图分选细胞。使用含10%FCS的IMDM收集样本，以通过激光捕获显微切割技术收集实体瘤。

首先，使用切片机从福尔马林固定的石蜡包埋样品中切下5至10微米厚的切片。接着，将切片置于覆膜载玻片上，并在37摄氏度下干燥一小时。通过在二甲苯、无水乙醇、70%乙醇和水中依次孵育一分钟，进行脱蜡和水化处理。

然后用苏木精对切片染色20秒。用自来水冲洗，并利用激光捕获显微切割系统收集目标细胞，以从分选的液体肿瘤细胞中提取蛋白质。将样品离心三次，在第二和第三次离心过程中，每次用500 µL冷PBS洗涤细胞。

接下来，每1×10⁶个细胞加入40 µL裂解缓冲液，孵育细胞。15分钟后，离心裂解液，并将含有上清液的澄清裂解物转移至新的反应管中，以提取显微切割的实体瘤细胞中的蛋白质。将组织样本与60 µL组织裂解缓冲液在72°C下孵育。

15分钟后，通过短暂离心收集液体，并将上清液转移至新的反应管中。然后将裂解液在冰上超声处理3分钟，随后在加热块中加入15微升20%十二烷基硫酸钠（SDS），于99摄氏度孵育，同时以600转/分钟振荡。一小时后，离心裂解液，并将上清液转移至新管中。

接下来，测定经澄清的细胞和超速SLAC标准品的蛋白质浓度，然后将等量的肿瘤细胞碎片与超速SLAC标准品混合，再加入锂。按样品体积的25%加入脱盐硫酸盐缓冲液，按样品体积的10%加入还原剂。随后将所得溶液置于加热块中，在72摄氏度下加热10分钟。

在酶标仪上测定实体瘤裂解液的蛋白浓度时，使用 commercially available 蛋白检测试剂盒和 96 孔板，将标准牛血清白蛋白稀释液系列、裂解液以及适量的 super SLAC 标准品混合。振荡混匀 1 分钟后，将样品按照试剂盒说明书要求孵育适当时间，并测定吸光度。随后，在滤膜装置中将等量的澄清裂解液与 super SLAC 标准品同 200 微升尿素混合，离心 30 分钟。

通过液相色谱和质谱分析来分析肿瘤细胞裂解物。首先将目标肽段溶于30 µL上样缓冲液中，在超声水浴中处理5分钟。然后离心沉淀蛋白质，将澄清的上清液转移至质谱自动进样瓶中。

接下来，每次分析时将五微升样品注入纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）系统的自动进样器中，并在反相C18预装柱上在线富集和脱盐肽段。最后，在自填充纳米电喷雾柱的反相C18微柱上分离肽段。采用90分钟梯度洗脱，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度设置为5%至35%乙腈，流速为300纳升/分钟，然后使用纳米电喷雾离子源进行离子化并分析肽段。

采用前15位数据依赖性采集方法，可使用不同类型的质谱仪对肽段进行分析。对患者来源的液体和实体肿瘤进行蛋白质组学分析，是发现新的诊断性和预测性生物标志物的有前景方法。例如，本图展示了从液体肿瘤样本中分离CD117染色的白血病细胞的一个典型设门策略。

而在此处，将厚约5到10微米的切片置于覆膜载玻片上，如前所示。随后手动选择感兴趣的区域，并通过激光显微切割技术进行分离。接着可利用质谱技术对液体和实体肿瘤样本的蛋白质表达谱进行无监督聚类分析，从而根据其独特的蛋白质表达谱清晰区分不同的肿瘤类型。这些数据最终可能有助于建立具有临床意义的生物标志物。

实施针对翻译后修饰（如磷酸化）或UIC通气的富集策略，也可用于回答其他问题，例如，在其形成后，如何鉴定失调的激酶模式？该技术为病理学和肿瘤学领域的研究人员探索多种癌症实体中的特异性生物标志物和信号通路奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何从癌症组织中分离出蛋白质亚群，并利用质谱技术分析其蛋白质表达模式和信号状态。