Name: 新生儿缺氧缺血性脑病的小猪模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习建立小猪缺氧缺血性脑病模型，通过振幅整合脑电图监测控制缺氧过程，模拟新生儿重症监护条件。该模型可用于研究新生儿脑损伤机制及治疗策略，为临床应用提供重要参考。

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作者谨此感谢丹麦奥胡斯大学医院通信部的 John Kristensen 和 Søren Braad Andersen 在拍摄与剪辑过程中提供的卓越帮助。感谢动物技术员 Diana Gyldenløve 及兽医 Birgitte Kousgaard（丹麦奥胡斯大学医院临床医学研究所）在动物护理方面的协助。本研究得到了伦德贝克基金会、拉尔多急性医学基金会、中丹麦地区研究基金会、奥古斯丁基金会、Aase 与 Ejnar Danielsens 基金会、奥胡斯大学医院临床医学研究所、Brødrene Hartmanns 基金会、Karen Elise Jensens 基金会、医学科学促进基金会以及 Marie Dorthea og Holger From, Haderslevs 基金会的资助。

本方案已获得丹麦动物实验监察局的批准。所有试验动物在操作过程中均处于麻醉状态。该方案的重复实施必须遵循国家伦理和动物福利指南，并经当地伦理委员会批准。
1. 动物
<ol>
	<li>丹麦长白猪仔 &lt; 24 小时龄，体重约 1,500 - 2,000 g。</li>
</ol>
2. 麻醉与维持液体
<ol>
	<li>准备麻醉所需设备（图1）：七氟烷给药面罩、酒精棉片、外周静脉导管、橡胶止血带、含生理盐水的注射器、丙泊酚（5 mg/kg）、芬太尼（10 µg/kg）以及普鲁卡因苄青霉素（15,000 IU/kg）。</li>
	<li>通过呼吸面罩输送1-2%七氟烷诱导麻醉。
	<ol>
		<li>通过评估眼睑反射和回缩反射判断麻醉深度。确认仔猪已深度麻醉后，经皮将外周静脉导管插入耳缘静脉。</li>
		<li>为确认外周静脉导管通畅，使用1-2 ml无菌0.9%氯化钠溶液冲洗导管。随后推注丙泊酚（5 mg/kg）和芬太尼（10 µg/kg）。推注完成后，再次使用1-2 ml无菌0.9%氯化钠溶液冲洗静脉导管。</li>
		<li>将含丙泊酚（10 mg/ml）和芬太尼（10 µg/ml）的注射器分别放入两台注射泵中。将两台注射泵的静脉输液管连接至三通阀，使输注液汇入同一管路并与静脉导管相连。开始持续静脉输注丙泊酚（4-12 mg/kg/hr）和芬太尼（10 μg/kg/hr）。持续输注开始后，不再给予丙泊酚和芬太尼的追加推注剂量。</li>
		<li>停止七氟烷气体麻醉的给药。</li>
		<li>根据当地抗生素预防指南，皮下或肌肉注射普鲁卡因苄青霉素（15,000 IU/kg）。每日重复一次。视频中展示的是皮下给药方式，研究表明在仔猪中，与肌内注射相比，皮下注射可获得更高的血浆浓度和更长的半衰期。</li>
		<li>涂抹眼用润滑软膏以防止角膜干燥。轻柔下拉下眼睑形成袋状开口，将少量软膏挤入袋内，然后闭合眼睛以均匀分布软膏。每小时检查一次眼部干燥情况，并根据需要重新涂抹。</li>
		<li>开始持续静脉输注5%葡萄糖/0.45%氯化钠溶液，输注速率为10 ml/kg/hr。在缺氧期间及之后将输注速率降低至5 ml/kg/hr。调整输注速率以维持血糖水平在2-10 mmol/L之间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于医疗用途的麻醉设备工具，放置在绿色布巾上，包括注射器、导管和人工呼吸球囊。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 麻醉与插管设备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 插管与通气
<ol>
	<li>准备插管所需的设备（图1）：罗库溴铵（1 mg/kg），用于肌肉松弛；绳套（将同一根4 mm尼龙绳的两端系在一起，形成一个环，如图1所示），用于张开嘴巴；棉签和带直 blade 的兽用喉镜、利多卡因喷雾剂（100 mg/ml）、带套囊的不同尺寸气管插管（3.0 mm、2.5 mm、2.0 mm）、500 ml 自充气气囊（气囊阀面罩）用于通气、2 ml 注射器用于套囊充气，以及听诊器。</li>
	<li>按照以下步骤进行插管：
	<ol>
		<li>将仔猪置于仰卧位，从两侧支撑颈部，以确保声门通道笔直，便于插管。</li>
		<li>通过测量从鼻尖至胸骨切迹的距离来估算气管插管的长度（通常约为13 cm）。</li>
		<li>将绳套绕在上颌（朝下）并向上提起下颌和舌头，以保持嘴巴张开。</li>
		<li>静脉注射罗库溴铵（1 mg/kg）以诱导肌肉松弛。</li>
		<li>使用喉镜将舌头向上抬起。</li>
		<li>使用棉签清除仔猪较长的会厌，因其可能向后翻入食管或卡在软腭后方。</li>
		<li>推进喉镜，使会厌保持抬高并紧贴舌根，从而充分暴露杓状软骨和声带。</li>
		<li>在喉部局部喷洒利多卡因喷雾剂（100 mg/ml），以防止喉痉挛。</li>
		<li>将气管插管经声带插入。使用旋转动作有助于通过狭窄的气管软骨。根据预先测量的距离推进插管，并连接至自充气气囊（气囊阀面罩）进行手动通气。为减少插管过程中的摩擦，可在气管插管远端1/3处喷洒利多卡因喷雾剂。</li>
		<li>确认气管插管位置正确的方法：观察是否存在呼吸困难的迹象，听诊胸部以确认双肺均有对称的通气声音，目视检查气管插管近端是否存在呼出气体的冷凝现象，并通过比色法二氧化碳检测器或机械通气机上的呼气末CO2读数确认呼气末二氧化碳的存在（如设备可用）。正常的呼气末二氧化碳约为5%。当数值高于2%且波形正常时，可确认气管插管位于气管内。</li>
		<li>充气气管插管套囊以防止误吸。套囊充气压力应低于25 cm H2O，以避免周围组织缺血性损伤。固定气管插管位置后，用胶带缠绕插管，闭合下颌，并继续将胶带绕过鼻部以固定插管。轻轻牵拉插管以确保其位置稳固。</li>
		<li>将气管插管连接至机械通气机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调整通气机参数：容积控制通气，潮气量（TV）：10 ml/kg [或压力控制通气时的峰吸气压（PIP）为15 cm]。呼气末正压（PEEP）：5 cm。吸呼比（I:E）1:2。呼吸频率：35次/分（根据需要调整呼吸频率，以维持呼气末CO2在4.5–5.5 kPa之间）。</li>
</ol>
4. 监测与体液采样
<img alt="医疗监测设备，包括心电图电极、脉搏血氧仪和绿色背景上的静脉导管。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 监测设备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>准备用于监测所需的设备（图2：胶带、无菌润滑剂、用于连续直肠温度测量的探头、心电图（ECG）电极、脉搏血氧仪、剃刀和脑电图（EEG）电极。
	<ol>
		<li>将饱和度探头置于后肢，润滑直肠温度探头并插入直肠6 cm，开启头顶辐射加热器和/或充气式加热垫，维持直肠温度在生理水平38.5-39 °C，并放置心电图电极。</li>
		<li>将仔猪置于俯卧位，剃除耳前各一侧约1 cm × 1 cm区域的毛发，用于放置皮下针式脑电图电极，参考电极置于眼后中线位置。用酒精棉片清洁电极放置部位，随后将针式电极插入皮下。用胶带固定电极，然后将仔猪恢复至仰卧位。</li>
		<li>打开振幅整合脑电图（aEEG）监测仪。 
		注意：振幅整合脑电图由一条密集波形及上下边缘构成。在此模型中，上下边缘通常为15-50 μV，通常高于婴儿期所见水平。在缺氧期间需注意，心电图（ECG）伪影可能使振幅整合脑电图（aEEG）波形出现假性升高。推注药物（如丙泊酚或芬太尼）也可能暂时抑制aEEG波形，因此在实验过程中应尽量避免使用。用药情况及临床事件应予以标注，以利于aEEG波形的解读。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于放置脐动脉导管以进行中心动脉血压监测和采血所需的设备（图3：无菌手套、无菌铺巾、手术刀、酒精棉片、无菌擦拭巾、脐静脉导管（5 Fr）、脐动脉导管（3.5 Fr）、缝合器械包（含镊子）、弯头显微镊、剪刀、持针器及缝线例如3-0 规格缝合线、透明粘性敷料、用于采血的 5 ml 注射器。</li>
</ol>
	<img alt="用于医疗操作的手术器械设置，包括注射器、剪刀、手术刀和镊子。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
	图3. 脐带置管和采血所需设备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
	<ol start="3">
		<li>对脐周区域进行消毒并铺巾。使用手术刀尽可能贴近皮肤切断脐带。若在麻醉后的仔猪中此操作未能暴露脐血管，可在脐带下方2 mm处切开脐部皮肤以暴露血管。辨认两条较小的脐动脉和一条较粗大的脐静脉（图4）。</li>
		<li>使用弯头显微镊扩张动脉（图4），插入脐动脉导管（3.5 Fr）。导管插入长度（cm）可按经验公式估算：3 × 体重（kg）+ 10（该公式基于尸检时导管正确置于肾动脉上方降主动脉的位置）。</li>
		<li>将第二根5 Fr导管插入脐静脉，深度为5 cm（图4）。通过回血确认导管位于血管内。在脐部周围缝置荷包缝线，将缝线两端分别绕过每根脐导管并打结固定。用透明粘性敷料覆盖导管。</li>
		<li>在预设的时间点采集血样：1）缺氧前即刻；2）缺氧损伤开始后30分钟；3）45分钟缺氧损伤结束时；4）缺氧损伤后2小时。根据实验目的，也可选择其他采血时间点。</li>
		<li>利用缺氧期间采集的血样进行动脉血气分析，以验证缺氧-缺血引起的血气变化（表1）。需注意，仔猪出生时血红蛋白水平较低（约8 g/dL），频繁采血可能导致贫血。每次采血量应少于2 ml/kg体重，24小时内总采血量应少于5 ml/kg体重，并遵守当地关于采血的指导原则。贫血的表现包括血细胞比容下降和心动过速。</li>
		<li>将动脉导管连接至监护仪，用于持续监测动脉血压（MABP）。静脉导管用于输液和给药。</li>
	</ol>
<img alt="手术过程特写，在医疗操作环境中用镊子分离组织。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 脐带血管。 脐静脉（右侧）和两条脐动脉中的一条（左侧）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
5. 缺氧
<ol>
	<li>监测结束后等待60分钟。通过切换至4% O₂诱导缺氧。296% N2 气体混合物。密切监测生命体征和振幅整合脑电图（aEEG），并持续缺氧45分钟。</li>
	<li>一旦aEEG轨迹呈平坦状（上缘） &lt;7 µV），通过调整吸入氧浓度（FiO₂）来调节氧合2）以及平均气道压至最高的FiO₂2 根据所示流程图维持平坦的aEEG轨迹水平 图5. 目标是使平均动脉压（MABP）低于基线水平的70%，持续至少10分钟，必要时降低吸入氧浓度（FiO₂）2 以确保产生低血压和缺血。此前已有其他研究证实了所述程度的低血压19,13,30 以产生相关的缺氧缺血性脑损伤。</li>
	<li>若出现严重低血压（MABP &lt;25 mm Hg）时，按以下步骤逐步处理：短暂提高 FiO₂2 1-5%，生理盐水推注（10 ml/kg），多巴胺输注（5-20 µg/kg/分钟），以及去甲肾上腺素输注（20 ng-1 µg/kg/分钟</li>
	<li>若惊厥持续 &gt;10分钟内出现（阵挛性、强直性或肌阵挛性发作，通常为局灶性或表现为aEEG振幅突然变化）时，按以下步骤依次处理（每步间隔30分钟，再进行下一次给药）：静脉缓慢推注苯巴比妥20 mg/kg，随后重复静脉推注苯巴比妥20 mg/kg，接着静脉推注咪达唑仑0.5 mg/kg。
	<ol>
		<li>如果癫痫发作且对药物治疗无反应，则应实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示呼吸治疗中根据aEEG、心率和平均动脉血压目标调整FiO2和Paw的流程图。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 缺氧缺血流程图。 该流程图展示了根据振幅整合脑电图（aEEG）反应调整氧合参数（FiO2 和 Paw）的过程。平均气道压（Paw）通过调节吸气峰压/潮气量（降低吸气峰压可降低Paw）和呼吸频率（降低呼吸频率可降低Paw）进行调整。aEEG目标值：脑电图波形上界< 5 µV，下界> 3 µV（平均4 µV）。心率（HR）目标值：> 80。平均动脉血压（MABP）目标值：MABP > 25。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 72 小时存活率
<ol>
	<li>在缺氧损伤后密切监测仔猪，并逐渐降低丙泊酚和芬太尼的输注速率。当动物恢复自主呼吸时，进行拔管。</li>
	<li>在存活期间，将仔猪安置于配备经重症监护与监测培训人员的动物设施中，并实施24小时监护。每2-3小时静脉输注葡萄糖20 ml/kg。在缺氧缺血后26-48小时，可开始部分奶瓶喂养。若咽反射尚未恢复，奶瓶喂养可能导致液体误吸入气管和肺部。</li>
	<li>若实验需要，可采用Thoresen et al. 所建立的神经系统评分系统进行神经功能评估，该评分系统在原始出版物中有详细描述17。</li>
</ol>
7. 结果评估
<ol>
	<li>72 小时后，按照第 2 和第 3 节所述方法再次进行麻醉和通气。根据 Munkeby et al31 及其他研究者2 的描述，使用相应的成像模式进行 MRI 扫描。</li>
	<li>实验结束时，通过静脉注射致死剂量的戊巴比妥（5 g/kg）处死仔猪。</li>
	<li>根据实验目的准备脑组织以供检查。
	<ol>
		<li>如需对福尔马林固定组织进行脑组织学分析：采用 PBS 中含 4% 多聚甲醛的心脏灌注，随后进行解剖并按照 Robertson et al.2、Chakkarapani et al1 或 Liu et al.18 的方法进行多聚甲醛后固定；或按照 Andresen et al.32 的方法取出脑组织并浸入 4% 多聚甲醛中固定。</li>
		<li>如需用于快速冷冻组织的分析（例如，RNA 分析或酶活性测定33）：取出脑组织，分离出目标脑区，并按照 Munkeby et al.33 的方法将大小不超过 1 cm × 1 cm 的组织块在液氮中迅速冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chakkarapani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenon+enhances+hypothermic+neuroprotection+in+asphyxiated+newborn+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of%22%5BJournal%5D)">Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs.</a> Annals of. 68, 330-341 (2010).</li>
<li>Robertson, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+augments+hypothermic+neuroprotection+in+a+perinatal+asphyxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%3A+a+journal+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model.</a> Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).</li>
<li>Lawn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+Newborn%3A+progress%2C+priorities%2C+and+potential+beyond+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival.</a> Lancet. 384, 189-205 (2014).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum-related+neonatal+encephalopathy+incidence+and+impairment+at+regional+and+global+levels+for+2010+with+trends+from+1990%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990.</a> Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).</li>
<li>Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+neonatal+encephalopathy+and+hypoxic-ischaemic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Early+human+development%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy.</a> Early human development. 86, 329-338 (2010).</li>
<li>Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+neonatal+morbidity+and+long-term+central+nervous+system+sequelae+of+perinatal+asphyxia+in+term+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Early+human+development%22%5BJournal%5D)">Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants.</a> Early human development. 25, 135-148 (1991).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于该模型较为复杂，只能在具备动物实验资质且有相关经验的机构中实施。实验开始前必须获得当地伦理委员会的批准，并始终确保动物福利。由于该模型依赖于受试动物的存活，因此在侵入性操作过程中必须维持无菌环境，以防止感染。
麻醉药物的选择至关重要，因为大多数（即使不是全部）麻醉药物都具有潜在的神经保护作用。既往发表的不同模型之间结果的差异，部分原因可能在于所使用的麻醉药物不同，例如氟烷或丙泊酚17,19。这一点在文献中很少被提及，因为麻醉无法省略，且目前尚缺乏适用于该模型的充分证据。我们采取的实用策略是尽量减少使用不同类型的麻醉药物，即仅短暂使用七氟烷，随后持续输注丙泊酚和芬太尼。在我们的实验中，药物推注仅对振幅整合脑电图（aEEG）产生短暂影响，而维持在连续输注规定的剂量范围内则不会产生干扰。在评估神经保护治疗时，通过采用随机试验设计可避免偏倚。
该模型中最关键的步骤是建立缺氧缺血性损伤，因为主要目标是在诱导中度至重度缺氧缺血性损伤的同时，确保动物存活。该缺氧缺血性脑病（HIE）模型的独特之处在于能够适应不同动物...

围产期窒息是一种与缺氧缺血性脑病（HIE）相关的急性且常难以预测的临床状况。本实验方案的总体目标是建立一种用于围产期缺氧缺血性脑病研究的仔猪存活模型。该模型可用于研究不同程度的缺氧缺血对新生儿大脑的影响，以及实验性治疗对神经病理学、磁共振成像与波谱分析（MRI 和 MRS）和血液、脑脊液及尿液等体液中生物标志物的作用。此外，该模型已被证实可用于研究心血管系统、呼吸系统、肾脏和肝脏，这些器官在全身性缺氧缺血过程中均会受到影响。
围产期窒息是由于分娩期间或产后即刻缺氧所致。每年全球因分娩期缺氧事件导致约 0.66 百万例死亡，约占 2012 年全球 290 万新生儿死亡病例的四分之一3。据估计，2010 年有 115 万新生儿在出生窒息后发生新生儿脑病4。缺氧缺血性脑病（HIE）定义为胎龄超过 34 周出生的婴儿出现的脑病，在工业化国家的发生率为每 1,000 例活产中 1-3 例5，在发展中国家则高达每 1,000 例活产中 8.5 例4。患儿死亡风险为 10-60%，存活者中神经系统功能障碍的风险为 30-100%6,7。分娩期缺氧事件共造成 5020 万伤残调整生命年（DALYs）的损失4。目前，除支持性治疗外，HIE 唯一有效的治疗方法是缺氧后的低温治疗。因此，诊断方法和治疗策略的进步对于改善 HIE 的管理至关重要8。
围产期窒息后预后的改善以及新生儿脑损伤的管理，依赖于对潜在疾病机制和可能治疗方法的不断深入认识。由于导致缺氧缺血性脑病（HIE）的临床事件多种多样，且单一分娩中心的发病率较低，动物HIE模型在研究中具有特别重要的价值5。在评估新的预后判断工具、诊断方法和治疗策略时，必须建立一种能够最大限度减少生物学变异影响的实验体系。理想的动物模型应尽可能接近临床实际情况，从而有助于理解所诱导损伤背后的病理机制，以及疾病发展过程及其结局的动态变化9。目前已建立的新生儿HIE动物模型涉及多种物种，包括啮齿类、羔羊和猪。相比之下，新生仔猪在出生时的体型、心血管系统10以及脑发育成熟度方面与人类新生儿更为相似11,12。在仔猪模型中进行的监测、仪器使用和结局评估方法，与临床上对HIE患儿的管理措施相似。因此，该模型在新生儿临床护理中的转化应用程度较高。
许多研究团队使用新生仔猪作为围产期缺氧和缺血缺氧性脑病（HIE）的动物模型，这些模型在多个方面存在差异13。根据实验目的，必须仔细考虑药物的选择、缺氧-缺血的诱导方法、损伤持续时间与严重程度的控制方法、损伤后的复苏与护理，以及结局评估。为避免偏倚，干预性研究应始终采用随机化试验设计。
在诱导缺氧缺血性损伤时所采用的方法至关重要。导致缺氧缺血性脑病（HIE）的全身性缺氧常引起包括脑、心脏、肺、肾脏和肝脏在内的多器官功能衰竭。根据所评估的结局指标，HIE模型应基于全身性缺氧和缺血，而不应依赖于局灶性缺血，例如，通过颈动脉结扎14。最近一篇论文采用了一种结合低氧（FiO2 12%）与颈动脉压迫的方法，同时维持平均动脉血压 &#62; 40 mm Hg2。另一研究团队则通过8% O2诱导全身性缺氧，直至碱剩余为负且绝对值 &#62; 20 mmol/L，或平均动脉血压（MABP）&#60; 15 mm Hg，并在4小时后处死动物15。此外，也有研究根据心输出量（降至基础值的30–40%）、MABP（降至30–35 mm Hg）和动脉pH值（6.95–7.05）来调节缺氧程度16。
通过aEEG抑制程度来调节的全球性缺氧-缺血模型，如本报告中所展示的模型，已证明可产生在临床表现、电生理学及神经病理学上均与足月窒息婴儿所见脑病相似的脑功能障碍17,18。
所诱导的缺氧缺血性脑病（HIE）程度至关重要。一个有效的HIE动物模型还必须能够用于测试新的诊断方法和治疗方案。为了实现这一目标，模型应诱导出具有治疗潜力的中度HIE，因为重度脑损伤的治疗潜力极低或不存在，在评估新疗法时相关性较小。实验动物对缺氧的耐受性存在显著差异。既往研究表明，根据每只仔猪通过振幅整合脑电图（aEEG）评估的脑部反应个体化地调整缺氧诱导过程，相较于在整个缺氧过程中使用固定的吸入氧浓度（FiO2）值，能够实现更一致的脑损伤程度，并提高动物存活率17,19。aEEG抑制持续时间与脑损伤程度相关：aEEG抑制时间&#60;20分钟时，组织病理学改变较少；而抑制时间&#62;45分钟时，严重发作显著增加。最近一项关于HIE神经保护治疗的综述强调了建立可用于动物模型行为学结局评估的存活模型的必要性20。
所介绍的HIE仔猪模型具有诸多优势。该模型基于一种其研究结果极有可能外推至人类生理学的物种。全身性缺氧-缺血模型可模拟多器官功能衰竭，通过aEEG对缺氧-缺血程度进行滴定，可诱导出程度一致的脑损伤，并实现具有临床相关性的存活结局，从而可在相关时间点评估生物标志物、磁共振成像（MRI）及行为学指标。
新生仔猪缺氧缺血性脑病（HIE）模型不仅极大地促进了当前对HIE病理生理机制的理解，而且成功地为临床试验奠定了基础，最终推动了人类HIE新疗法的产生。仔猪模型研究在确立低温疗法作为HIE治疗手段的过程中发挥了关键作用21，并被广泛应用于新生儿复苏研究22。多个研究团队在缺氧与HIE相关研究中采用了仔猪模型，相关研究涵盖低温治疗23、α-黑素细胞刺激素24、心脏骤停25、酪氨酸羟化酶活性26、反复缺氧暴露27、NMDA受体活性14以及近红外光谱技术28。
本报告中介绍的仔猪HIE模型在技术上具有较高的操作难度，因为在手术过程中微小的调整可能导致脑损伤过轻或过重29,2。我们发现现有文献中缺乏足够详细的描述，难以重现此前已发表的模型。因此，本文详细展示了建立仔猪72小时存活模型所需的各项技术操作步骤，以帮助研究人员成功构建这一先进的HIE研究模型。

<table><tbody><tr><td>暖触式儿科毯</td><td>Covidien</td><td>5030840</td><td></td></tr><tr><td>粘性手术孔巾</td><td>Barrier</td><td>915447</td><td></td></tr><tr><td>通用手术巾（无菌）75×80 cm</td><td>Barrier</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Neoflon</td><td>BD - Luer</td><td>391350</td><td></td></tr><tr><td>喉镜</td><td>Miller</td><td>85-0045</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mm 气管插管&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td>111-25</td><td></td></tr><tr><td>带套囊 3.0 mm 气管插管</td><td>Unomedical</td><td>MM61110030</td><td></td></tr><tr><td>带套囊 3.5 mm 气管插管</td><td>Unomedical</td><td>MM61110035</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>GE Healthcare</td><td>1009-9002-000</td><td></td></tr><tr><td>脑电图电极/一次性皮下针电极</td><td>Cephalon</td><td>ACCE120550</td><td></td></tr><tr><td>心电图电极</td><td>medtronic</td><td>3010107-003</td><td></td></tr><tr><td>用于磁共振的心电图电极</td><td>philips</td><td>ACCE120550</td><td></td></tr><tr><td>动脉血采样器 - 吸引装置</td><td>Radiometer medical ApS</td><td>956552</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯脐静脉导管（5 Fr/Ch）</td><td>Covidien</td><td>8888160341</td><td></td></tr><tr><td>聚氨酯脐静脉导管（3.5 Fr/Ch）</td><td>Covidien</td><td>8888160333</td><td></td></tr><tr><td>缝合包（3-0 规格）</td><td>Covidien</td><td>8886 623341</td><td></td></tr><tr><td>BD 脊髓穿刺针 0.7×38 mm</td><td>BD needles</td><td>405254</td><td></td></tr><tr><td>含 96% 氮气 / 4% 氧气的混合气体</td><td>Air Liquide</td><td>按订单制备</td><td></td></tr><tr><td>NeuroMonitor (CFM) 系统</td><td>Natus Medical Incorporated</td><td>OBM70002</td><td></td></tr></tbody></table>

新生仔猪缺氧缺血性脑病模型

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

新生儿窒息导致的缺氧缺血性脑病（HIE）每年在全球造成约 0.66 百万例死亡，约占全球 290 万新生儿死亡病例的四分之一。HIE 的动物模型促进了人们对 HIE 发病机制的理解，并揭示了围产期窒息所致脑损伤中的动态过程。因此，动物研究提示了损伤后治疗策略的时间窗。亚低温疗法已在猪仔模型中作为 HIE 的治疗方法进行了测试，并随后在临床试验中被证实有效。该模型的多种改良版本已被应用于辅助性神经保护方法的研究，而有关氙气和褪黑素的猪仔研究则推动了临床 I 期和 II 期试验的开展1,2。猪仔 HIE 模型还被用于新生儿复苏和血流动力学研究，以及在细胞水平上对脑缺氧的探究。然而，该模型技术难度较高，实验方案的微小差异可能导致脑损伤程度过轻或过重。本文中，我们演示了建立稳定的新生儿 HIE 猪仔模型所必需的技术操作步骤。首先，将新生猪仔（&#60;24 小时龄，中位体重 1500 g）进行麻醉、气管插管，并在类似于新生儿重症监护病房的环境中进行监测。通过降低吸入氧浓度以诱导全身性低氧，同时通过低血压和表现为平坦波幅的振幅整合脑电图（aEEG）来实现缺血，从而诱导全身性缺氧缺血。根据 aEEG 反应和血压调整氧合水平以维持动物存活。在 72 小时后通过组织病理学和磁共振成像对脑损伤程度进行定量评估。

通过记录振幅整合脑电图（aEEG）轨迹，记录诱导损伤期间缺氧缺血对大脑的影响。图6显示了一条典型的aEEG轨迹。
<img alt="电泳结果；图表显示蛋白质分离；数据分析；峰检测；实验室研究。" src="/files/ftp_upload/52454/52454fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 典型的振幅整合脑电图（aEEG）轨迹。 由于缺氧缺血导致低振幅。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52454/52454fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
记录缺氧期间的 pH、碱剩余和乳酸的极值，以及心率和血压。进行临床神经学评分17。表1展示...

围产期窒息后发生的缺氧缺血性脑病可通过动物模型进行研究。本文展示了建立新生仔猪缺氧缺血性脑病模型所需的操作步骤。

出生窒息导致的缺氧缺血性脑病（HIE）每年在全球造成约 0.66 百万例死亡，约占……

以下实验的总体目标是建立一种新生仔猪缺氧缺血性脑病的围产期动物模型。该模型可用于新生儿脑损伤的研究。首先，仔猪在类似于新生儿重症监护病房的设备条件下接受镇静、机械通气和持续监测。本论文所描述的技术采用振幅整合脑电图来调节缺氧程度。根据每项独立研究的耐受性，以受控方式诱导动物缺氧，维持振幅整合脑电图处于抑制状态，同时确保动物存活。在此为期四天的存活模型中，动物于缺氧后72小时被实施安乐死。最后，根据实验目的，可采用磁共振成像、神经病理学检查以及体液和器官分析来评估脑部及其他结局指标。在本研究中，我们逐步展示建立新生仔猪缺氧缺血性脑病模型所需的技术操作步骤。神经发育结局是新生儿重症监护各个领域的主要关注问题。良好的动物模型对于改善新生儿脑损伤的管理至关重要。您即将看到的模型较好地模拟了缺氧缺血的临床病程。因此，该模型的研究结果能够很好地转化应用于临床实践。在本模型中，我们通过控制缺氧损伤的严重程度和发生时机，从而最大限度地减少生物学变异。由于临床研究的解读较为复杂，我们采用丹麦长白猪仔作为模型，在出生后18至24小时进行实验。其平均体重为1000至2000克，生理特征在许多方面与新生儿相似。该模型可用于研究治疗干预对磁共振成像、神经病理学以及脑脊液、尿液和血液等体液中生物标志物的影响。这是一个在操作上具有技术挑战性的模型。以下，我们将演示完成该模型所需的每一步操作。诱导麻醉所需的设备包括用于七氟烷给药的面罩、外周静脉导管、含生理盐水的注射器、丙泊酚、芬太尼、肌松剂以及青霉素。开口器、棉签、直板兽用喉镜、带套囊的气管插管（Sloane喷雾型）、SIIS 3 0 2 0.5，以及两个用于套囊充气的自充气球囊注射器和听诊器。通过面罩给予七氟烷，监测麻醉深度。根据操作规程，在耳缘静脉置入外周静脉导管，并用生理盐水冲洗。此时，动物已处于镇静状态，但仍可自主呼吸。在插管前立即静脉给予芬太尼每公斤30微克，随后给予丙泊酚每公斤5毫克和溴化物每公斤1毫克，以启动静脉麻醉。进行插管时，将仔猪置于仰卧位。气管插管的长度从吻部尖端测量至胸骨突起上方，通常约为13厘米。使用棉签将细长的会厌向前牵拉，以便将其抬起。此操作结合喉镜使用，可充分暴露声带处的杓状软骨。将利多卡因喷雾局部应用于喉部以防止痉挛。当根据预先测量的距离将气管导管缓慢通过声门后，将其连接至自充气气囊以进行手动通气。通过观察胸部对称运动、听诊双肺呼吸音、目视导管内有雾气以及监护仪上显示的呼气末二氧化碳（白色曲线）来确认气管导管位置正确。最后，给套囊充气以确保气道密闭。此时将气管导管连接呼吸机进行机械通气。最后，输注丙泊酚（5 mg/kg/h）和芬太尼。开始以每小时每公斤10微克的剂量给药。将呼吸机设置为容量控制模式，输送每公斤10毫升的潮气量，并配备用于监测的设备。仔猪连接心电图电极、脉搏血氧仪、直肠温度探头以及相关设备。进行中心动脉压监测时，先放置脉搏血氧仪，随后插入直肠温度探头。在放置电极前，需剃除胸部毛发。屏幕上显示心电图、心率、中心动脉压和血氧饱和度。放置脐导管所需的设备包括无菌铺巾、手术刀、微型器械、3.5 法式和 5 法式脐导管、用于采血和冲洗的注射器，以及用于观察脐血管的缝合包。脐带在皮肤水平处被切断。图中右侧可见脐静脉，左侧可见两条脐动脉之一。首先，将动脉导管插入至相当于仔猪体重（公斤）乘以3再加10厘米的深度。通过回抽血液确认导管位置正确。随后，将静脉导管插入至5厘米深度。导管通过缝合固定。使用三叉线缝合，在放置电极前需剃除头部毛发。进行振幅整合脑电图监测时，顶叶电极之间应至少保持2至4厘米的间距，参考电极置于中线位置，接地电极可置于头部任意位置。脑电测试显示四个电极放置正确，信噪比良好。屏幕下方显示实时脑电图，上方屏幕显示时间压缩的振幅整合脑电图。现在允许幼猪休息60分钟，随后开始诱导缺氧。缺氧通过切换至呼吸机实现，呼吸机输送的气体为氮气与4%氧气的混合气体。达到与显著缺氧相对应的振幅整合脑电图上的平坦波形平均需要两分钟。脑内白血病持续45分钟。吸入氧浓度得到调节。为在缺氧期间维持脑电图（EEG）振幅低于7微伏，仔猪最初通过增加心率进行代偿。随着缺氧持续，仔猪开始失代偿，平均动脉压下降。此时，调整吸入氧浓度以确保存活至关重要。45分钟后，吸入氧浓度升至21%，脑部活动随之增强。缺氧结束后，拔除仔猪气管插管，使其苏醒并继续饲养四天。由一名经验丰富的动物技术员负责仔猪的日常护理，包括喂养和每日神经功能评分。在七十二小时时，猪已接受镇静并进行通气。再次强调，基因共振成像和波谱学是检查大脑的有力工具。磁共振成像可与神经病理学检查相互补充。大脑的各个区域被仔细分离，并由经验丰富的神经病理学家进行检查。通过观看本视频，您应能充分了解如何建立新生仔猪缺氧缺血性脑病模型。利用该模型，可深入研究与新生儿脑损伤诊断和治疗相关的各种重要问题。最终优化受累婴儿的管理。

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来源：Jantzie, L. L.，等。利用产前缺氧缺血联合宫内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型。J. Vis. Exp.

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