在斑马鱼胚胎的机械血管损伤
February 17th, 2015
本文介绍了一种在斑马鱼胚胎中造成机械血管损伤的方法。该损伤模型为研究非常适合实时显微镜的生物体中的止血、损伤相关炎症和伤口愈合提供了一个平台。
以下程序的总体目标是在斑马鱼胚胎中造成机械血管损伤。这是通过使用细枝末针刺穿斑马鱼胚胎的 coddle 静脉来实现的。接下来通过测量血液从伤口积极流出的时间来评估止血。
然后进行延时显微镜检查以可视化伤口愈合的各个方面，例如血管修复。结果表明，斑马鱼胚胎中的机械血管损伤可用于可重复地测量止血和伤口修复的各个方面，例如出血时间和重建血流所需的时间。与小鼠和其他标准损伤模型相比，该技术的主要优点是，在斑马鱼胚胎中，炎症、止血和修复可以很容易地使用实时显微镜可视化。
首先，将细枝末节针插入针架中，然后用细镊子夹住针。小心地弯曲针尖，形成一个轻微的钩子，以便在受伤期间纵和稳定胚胎。使用尖嘴钳弯曲安装在胰岛素注射器上的 28 号半英寸针头的末端。
接下来，如前所述，通过设置繁殖对并在鸡蛋水中收集鸡蛋来准备斑马鱼胚胎。当胚胎在受精或 HPF 后达到 8 到 24 小时时，将 PTU 添加到蛋水中以防止在两天时出现瓜。受精后或 DPF 使用细镊子对胚胎进行抽吸，使用终浓度为 0.02% 缓冲的 trica 麻醉胚胎，以机械损伤胚胎血管。
使用移液管将麻醉的胚胎放在凹陷载玻片上。将注射器针头的短而平的一侧放在解剖显微镜上，将胚胎放在其侧面，腹面背对针头。现在将细枝针定位，尖端直接指向鱼的腹面，在泌尿生殖道开口的后面。
以一个小角度握住它，使弯曲的尖端能够穿过周皮直接刺入 coddle 静脉。然后使用注射器针头作胚胎。使用细节针刺穿 coddle 静脉，方法是将胚胎敲入针中，用注射器针头将针头轻轻钩入静脉。
将胚胎从细枝针上拉出，在血管中形成一个小裂口。成功的损伤将导致静脉立即出血。对于此程序，请仅选择血细胞明显循环的胚胎。
将细枝针固定到位后，将其从血管中拉出，一旦可以看到伤口失血，就开始计时器 当伤口失血停止时，停止计时器并将总时间记录为出血时间 如果凝血受到抑制，记录不再明显循环细胞的时间。将受伤后的动物转移到玻璃底成像皿中进行显微镜检查，去除大部分蛋水，然后加入 0.3% 至 1.2% 低熔点 aeros，补充 0.02% trica 并加热至 42 至 45 摄氏度之间。覆盖胚胎。
使用镊子将胚胎放在两侧。aro 冷却后，在盘子中加入 0.02% trica 的蛋水。使用明场落射荧光或共聚焦显微镜在成像后采集图像。
使用镊子将胚胎转移回蛋水中。该视频显示了对 2D PF 胚胎进行的机械血管损伤。可以看到活动性失血后出血停止，损伤导致快速可靠的凝血反应，通过止血时间来衡量，以确定是否可以测量凝血反应的差异。
在受伤前立即通过注射到 QVA 导管中将抗凝剂 odin 注射到胚胎中。如图所示，与载体对照相比，该药物显着增加了出血时间。在本视频中，使用内皮和红细胞标志物的转基因品系，可以在受伤后立即看到血管损伤和凝血的证据。
在 12 小时内每 5 分钟采集一次图像，显示伤口修复的不同阶段。看完这个视频，你应该对如何导致斑马鱼胚胎的机械损伤有一个很好的了解。
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概述
本文描述了一种在斑马鱼胚胎中创造机械血管损伤的方法。这种损伤模型为研究止血、损伤相关的炎症和伤口愈合在一个非常适合实时显微镜观察的生物体中提供了平台。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 止血
背景
- 斑马鱼胚胎是研究血管损伤的有价值模型。
- 实时显微镜允许对生物过程进行详细观察。
- 理解止血和伤口愈合对医学研究至关重要。
- 机械血管损伤可以以可控的方式诱导。
研究目的
- 创建一个可重复的机械血管损伤模型。
- 评估斑马鱼胚胎中的止血和炎症。
- 使用时间跃迁显微镜可视化伤口愈合过程。
使用的方法
- 用细小针刺穿斑马鱼胚胎的尾静脉。
- 测量伤口中活跃血流的持续时间。
- 进行时间跃迁显微镜观察血管修复。
- 分析出血时间和血流重新建立。
主要结果
- 该模型允许可重复测量止血。
- 时间跃迁显微镜有效可视化伤口愈合。
- 炎症和修复过程可以实时观察。
- 这种技术比传统动物模型具有优势。
结论
- 斑马鱼胚胎模型对于研究血管损伤是有效的。
- 实时成像提供了对止血和修复的洞察。
- 这种方法可以增强对损伤相关过程的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mechanical vessel injury in zebrafish embryos provides a reproducible, real-time imaging platform for studying hemostasis and vascular repair in a whole-animal context. This model supports target validation and mechanistic de-risking in thrombosis and wound healing research by enabling quantitative measurement of bleeding dynamics and vessel reformation. Its optical transparency and genetic tractability allow direct visualization of cellular responses, improving predictive confidence in early discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in hemostasis pathways through controlled vascular injury and real-time monitoring of clot formation.
- Operational Value: Supports functional target validation by measuring bleeding time and vessel repair kinetics in genetically tractable embryos.
- Predictive Value: Facilitates preclinical de-risking of anticoagulant or pro-hemostatic compounds via reproducible, quantifiable phenotypic readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible injury models suitable for high-content screening of compounds affecting coagulation or vascular integrity.
- Quantitative Outputs: Delivers measurable endpoints including bleeding duration and time to blood flow reestablishment, enabling dose-response analysis.
- Scalability & Reuse: Compatible with time-lapse microscopy and transgenic reporter lines, allowing repeated use across compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models human vascular injury processes, supporting translational biomarker discovery in hemostasis and thrombosis.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by enabling real-time observation of inflammation, clot stabilization, and endothelial repair.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go decisions in early therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for hematologic and vascular therapeutic areas.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of coagulation factors and vascular repair mechanisms via controlled injury and real-time imaging.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on hemostasis and wound healing.
- Analytics: Generates quantitative temporal readouts (bleeding time, flow recovery) that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved vascular biology and real-time visualization of repair processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiple projects in thrombosis, inflammation, and vascular biology due to its adaptability and imaging compatibility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in hemostatic mechanism through direct observation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined injury protocols and quantifiable endpoints.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds with vascular or hematologic liability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing mechanistic data on target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, microsurgery, and live imaging techniques.
- Dependent on microfluidic or immobilization tools and high-resolution microscopy systems (brightfield, fluorescence, confocal).
- Necessitates standardization across teams for embryo staging, injury consistency, and endpoint measurement.
- Adaptation considerations include transgenic line selection for endothelial or hematopoietic labeling and anticoagulant dosing protocols.
- Practical limitations include embryo size constraining throughput and the need for careful temperature control during imaging.
