Name: 纳米抗体和基于抗体的验证在体内肿瘤异种移植NIRF成像的小鼠实验使用离体流式细胞仪和显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学习使用纳米抗体和传统抗体在小鼠肿瘤异种移植模型中进行体内近红外荧光成像，并通过离体流式细胞术和荧光显微镜验证成像结果。该方法可在一天内完成多模态成像分析。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）合作研究中心841的研究生院“炎症与再生”（Alexander Lenz、Valentin Kunick、William Fumey）、德国研究基金会合作研究中心877（Friedrich Koch-Nolte）、Werner Otto基金会（Peter Bannas）、Wilhelm Sander基金会（Peter Bannas、Friedrich Koch-Nolte）以及德国研究基金会（Martin Trepel、Friedrich Haag和Friedrich Koch-Nolte）提供资助。我们感谢汉堡大学癌症中心（UCCH）In Vivo 光学成像核心设施及UKE工作人员提供的咨询和高质量服务。该核心设施部分得到了德国癌症援助基金会（Deutsche Krebshilfe）资助项目的支持。

注意：实验严格遵循国际关于动物伦理使用的指南，并经当地动物福利委员会批准&#160;汉堡大学医学中心
1. 肿瘤细胞、小鼠和抗体构建体的制备
<ol>
	<li>淋巴瘤细胞的制备与基质胶（Matrigel）的分装
	<ol>
		<li>注射肿瘤细胞前一天，将一个无菌的吸头盒（1,000 &#181;l 吸头）和适当的移液器置于 -20 &#176;C 冷冻柜</li>
		<li>在4℃冰上解冻含有基底基质的瓶子 &#176;4°C 冰箱过夜。</li>
		<li>注射当天，准备一个装有冰块的冰桶，将基底膜基质、移液器、枪头以及带有30 G针头的1 ml注射器放入其中&#160;冰上的针</li>
		<li>将淋巴瘤细胞分装至100 μL体积中 &#181;1.5 ml 微量离心管中加入 RPMI 培养基，并小心与 100 混合 &#181;基底膜基质。吸入预冷的注射器中，并置于冰上直至注射。 
		注意：全程使用良好的无菌技术并在冰上操作，以防止基底膜基质堵塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠准备
	<ol>
		<li>使用8-10周龄的裸鼠（NMRI-Foxn1nu).</li>
		<li>为减少肠道自发荧光，应在实验前1周将小鼠置于无苜蓿饮食环境中 体内 成像</li>
		<li>使用诱导室以2%异氟烷对小鼠进行麻醉，以用于淋巴瘤细胞注射。在操作过程中，通过异氟烷多通管路系统维持1-2%异氟烷麻醉。</li>
		<li>将淋巴瘤细胞皮下注射至肩部两侧。为进行直接的个体内比较，分别在右侧注射抗原阳性细胞，左侧注射抗原阴性细胞。
		<ol>
			<li>用拇指和食指捏住小鼠皮肤，并将其从身体上轻轻拉开。将细胞缓慢且均匀地注射至手指形成的皮下袋中，使细胞在皮下形成单一的细胞簇。基底膜基质有助于固定注射的细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体构建体的制备
	<ol>
		<li>使用市售的蛋白质标记试剂盒，按照制造商说明书将单克隆抗体和单域纳米抗体标记荧光染料AlexaFluor-680（AF680）（激发波长 = 679 nm，发射波长 = 702 nm）。利用摩尔消光系数15,720 mol⁻¹·cm⁻¹计算每个纳米抗体和传统抗体所连接的染料分子数。-1 厘米-1 和 203,000 mol-1 厘米-1分别通过SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色评估抗体构建物的纯度。</li>
		<li>确保标记偶联物的特异性，需进行一系列实验 体外 在实际成像研究之前进行实验。检测标记抗体构建物的特异性 体外 通过阻断实验和非特异性同型对照 8,20. 
		注意：在步骤1.2.4中，阴性抗原细胞与阳性抗原细胞（或不同细胞系）的细胞数量可能需要根据其不同的生长速率进行调整。在这些实验中，使用0.5×106 DC27.10 ARTC2 阴性及 1.5x106 使用DC27.10 ARTC2阳性细胞以获得大小相似的肿瘤。在步骤1.3.1中，抗体探针的标记过程及其荧光标记效率可能因所用标记试剂盒的不同而有所差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体内 成像
<ol>
	<li>肿瘤直径达到约 8 mm 后 7-9 天，将 50 µg AlexaFluor680 标记的抗体构建物溶于 200 µl 生理盐水中，通过尾静脉静脉注射至小鼠体内（mAb-AF680：50 µg，每分子含 2 个染料 ≈ ~4^14 荧光染料 ≈ ~0.8 µg 荧光染料；Nanobody-AF680：50 µg，每分子含 0.3 个染料 ≈ ~5.6^14 荧光染料 ≈ ~1.1 µg 荧光染料）。</li>
	<li>成像前，使用 XGI-8 麻醉系统在诱导室中以 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉，随后启动成像系统，并在成像过程中通过成像室内的异氟烷多路装置维持 1-2% 异氟烷麻醉浓度。
	<ol>
		<li>将小鼠置于加热的成像平台，使肿瘤部位朝向相机。通过轻捏小鼠脚趾或尾巴监测麻醉深度；若动物出现反应，表明麻醉过浅。</li>
		<li>监测呼吸频率；若呼吸频率加快，提示麻醉过浅；若呼吸减慢、加深或不规则，提示麻醉过深。麻醉期间使用眼药膏保护动物角膜，防止干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择激发光滤光片 615-665 nm，发射光滤光片 695-770 nm，背景扣除激发光滤光片 580-610 nm，图像矩阵大小设为 512 × 512 像素。曝光时间设为自动，像素二乘设为中等，光圈值（F/Stop）设为 2。 
	注意：较短的曝光时间可实现更高的帧率，较长的曝光时间可提高灵敏度。像素二乘控制 CCD 相机的像素大小。增加二乘值会增大像素尺寸、提高灵敏度和帧率，但会降低空间分辨率。F/Stop 设置相机镜头光圈的大小，光圈大小控制检测到的光量和景深。请注意，不同成像设备和实验设置下的参数可能有所不同。请参考制造商手册以获得最佳结果。
	<ol>
		<li>在成像软件中，根据细胞系的表达水平优化曝光时间、F/Stop 和像素二乘设置。可在实验过程中随时调整这些参数，而不会影响定量结果。也可使用成像向导（Imaging Wizard）软件自动确定参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在注射抗体构建物前及注射后 6 小时对小鼠进行成像。 
	注意：标记效率可能影响获得最佳成像效果所需的剂量。因此，获得最佳成像效果所需的抗体构建物用量需通过实验确定，其用量可能因标记效率、构建物大小、肿瘤模型及靶抗原表达水平的不同而有所差异。</li>
</ol>
3. 肿瘤的收获与制备
<ol>
	<li>将冰桶装满冰，将含4%多聚甲醛（PFA）、磷酸盐缓冲液（PBS）/蛋白酶抑制剂（AEBSF）以及PBS/0.2%牛血清白蛋白（BSA）的溶液置于冰上。</li>
	<li>成像结束后，将异氟烷浓度提高至4%。待动物呼吸停止后，将其从成像台取出，并实施颈椎脱位处死。</li>
	<li>将小鼠固定在泡沫塑料块上，并用70%乙醇喷洒。</li>
	<li>使用剪刀和镊子剪开外皮并小心向后剥离，以暴露肿瘤。用手术刀切除肿瘤，确保肿瘤组织保持完整。</li>
	<li>用手术刀将肿瘤切成两半。将其中一半放入含有 PBS/AEBSF 的收集管中，用于流式细胞术分析；另一半放入含有 4% 多聚甲醛的 50 ml 管中，用于免疫组织化学分析。</li>
	<li>免疫组织化学实验前准备
	<ol>
		<li>将肿瘤组织置于4% PFA中，4℃冰箱保存 &#176;4℃下孵育24小时。将肿瘤转移至含有PBS/30%蔗糖的离心管中，置于4℃冰箱中保存 &#176;直至肿瘤沉降至管底。</li>
		<li>将肿瘤切成适合包埋盒的适当大小片段，放入包埋盒中，并加入OCT包埋剂完全覆盖肿瘤组织。</li>
		<li>将模具置于干冰上，等待化合物完全冻结。将冻结的肿瘤转移至 -80 &#176;C 冻存，用于免疫组织化学实验。</li>
		<li>将冷冻肿瘤切成8微米厚的切片 &#956;使用切片机将样本切成 m 厚的切片。采用标准免疫组织化学染色流程，使用抗 CD31-AF488 抗体标记血管，DAPI 标记细胞核。 
		注意：肿瘤切片对光极为敏感，因其已含有荧光标记的抗体。应尽可能避免光照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS 分析前准备
	<ol>
		<li>将培养皿置于冰上，从2.0 ml注射器中取出活塞。将肿瘤组织放入细胞筛中，用手术刀轻轻切成3-4块。将初始的PBS倒入培养皿中，使用活塞的平端在细胞筛内研磨肿瘤组织。</li>
		<li>用10 ml移液管将初始的PBS冲洗细胞滤筛，以洗出所有细胞。将细胞悬液转移至新离心管中，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于10 ml PBS/0.2% BSA中。计数细胞。</li>
		<li>分装 1-5 x 106 5 ml FACS 管中的淋巴瘤细胞。再次离心（500 × g），弃上清，重悬于 100 &#181;l PBS/0.2% BSA</li>
		<li>可选地，使用抗 CD16/CD32 单克隆抗体（FcgR3/2）阻断 FcR，该抗体可结合 Fc 受体&#947;冰上孵育 R 10 分钟。用 PBS/0.2% BSA 洗涤细胞一次。</li>
		<li>加入抗-CD45单克隆抗体以区分白细胞与其他细胞。冰上避光孵育20分钟，随后用PBS/0.2% BSA洗涤两次。</li>
		<li>在进行FACS分析前，先在冰上用碘化丙啶染色15分钟以区分死细胞，随后用PBS洗涤两次。重悬于150 &#181;用于FACS分析。 
		注意：在步骤 3.7.4 和步骤 3.7.5 中，可根据肿瘤类型使用其他抗体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FACS&#160;分析
<ol>
	<li>使用一系列设门工具对目标细胞群进行设门，包括依据大颗粒度设门、双细胞排除、死细胞排除、CD45阳性细胞设门以及抗原阳性细胞设门。
	<ol>
		<li>首先，在前向散射光（FSC-A）与侧向散射光（SSC-A）的双参数图中圈选细胞，排除细胞碎片；接着排除双细胞；最后排除非CD45抗原阳性（CD45）细胞以及死/濒死细胞（LD – live/dead染色）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有实验均使用相同的模板记录样本。 
	注意：有关硬件和分析软件使用的专业技术建议，请参考制造商的操作说明。</li>
</ol>
5. 显微分析
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜配合油浸物镜（40倍物镜）分析染色的肿瘤冷冻切片。采用He-Neon 633 nm激光激发AF680，氩离子激光激发AF488，以及405-二极管激光激发DAPI。</li>
	<li>使用与显微镜兼容的软件处理原始图像数据。必要时进行背景校正和去噪滤波。进行其他图像调整，如层切、裁剪以及亮度和对比度调整。
	<ol>
		<li>最后，将所有检测通道的数据生成单一的复合叠加图像。调节各单独图层的亮度和对比度。复合图像将显示细胞定位（DAPI染色，蓝色）、标记抗体构建物的分布（AF680染色，红色）以及血管结构（AF488染色，绿色）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 在体 内 成像分析
<ol>
	<li>在成像软件中打开图像文件，通过将照片图像数据与荧光图像数据合并，生成叠加图像。通过从特异性示踪剂滤光片组获取的图像中减去背景滤光片组获取的图像，去除组织自发荧光背景信号，从而优化图像显示，保留特异性荧光信号。</li>
	<li>在抗原阳性肿瘤和抗原阴性肿瘤周围绘制相同大小的圆形感兴趣区域（ROI）。为确定背景信号强度，将一个圆形ROI置于动物体内预期荧光信号较低的区域例如，后肢）
	<ol>
		<li>在所有时间点对所有动物使用相同的感兴趣区域（ROIs）。定位时，利用黑白 photographic 图像来识别肿瘤边界。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在测量表中显示感兴趣区域（ROI）数据。使用平均辐射效率数据，以便对荧光信号进行更定量的比较，用于后续的统计分析。
	<ol>
		<li>以靶向组织和背景组织的测量 ROI 数据为基础，将数据以绝对信号强度显示并进行比较，或计算信噪比。通过将肿瘤摄取值除以来自后肢的背景值，计算肿瘤与背景的比值。</li>
		<li>作为对照，还需在同一动物体内分析抗原阴性和抗原阳性肿瘤，以及注射了标记同型对照的动物，以评估信号的特异性 体内.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies+from+llama+effectively+and+specifically+block+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo.</a> FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).</li>
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Friedrich Koch-Nolte 和 Friedrich Haag 通过 MediGate GmbH 获得抗体和蛋白质销售的部分收益，MediGate GmbH 是汉堡埃彭多夫大学医学中心的全资子公司。

我们采用针对淋巴瘤细胞同一靶点的近红外荧光染料标记纳米抗体和传统单克隆抗体，进行了多模态比较研究 体内 和 离体 分析。我们证明了纳米抗体非常适合作为快速且特异性的诊断工具 体内 淋巴瘤的检测
体内实验中，s+16a680 能够实现对 ARTC2 阳性异种移植瘤的快速且更特异的检测。除了在体内肿瘤显像的最佳动力学方面存在差异外，Nika102680 的主要缺点是 ARTC2 阴性肿瘤产生较强的非特异性信号以及较高的背景信号。
离体 对分离自解剖肿瘤的细胞进行流式细胞术分析，结果显示注射的AF680偶联物对ARTC2阴性淋巴瘤细胞无非特异性结合。 离体 荧光显示，在注射纳米抗体s+16a后6小时，ART2C阳性肿瘤切片中的细胞呈现强且几乎均一的染色，证实该纳米抗体能够在6小时内到达肿瘤内部的远端区域。相比之下，单克隆抗体在6小时后对ARTC2阳性肿瘤的细胞染色较弱且不均一。使用传统抗体在24小时或48小时后可获得更佳的成像效果（数据未显示）。为了对两种不同大小的分子构建体进行充分比较，需在多个时间点进行成像（序列成像），以确定每种构建体的最佳成像时间点。
与其他先前的研究类似，本文报道的结果强调，使用标记的纳米抗体进行体内分子成像可实现快速、特异的同日肿瘤成像，并具有较高的肿瘤与背景比值12-15,17-19。相反，由于传统抗体在体内的清除速度较慢，注射后早期会在抗原阴性肿瘤中产生较低的肿瘤与背景比值以及非特异性信号。为了获得传统抗体的最佳成像效果，通常需要在注射后24小时甚至48小时进行成像。这些发现与以往的研究一致，即已被证实具有治疗益处的传统抗体在分子成像中的应用有限17,19,26。因此，传统抗体因其较长的血浆半衰期可能更适用于治疗目的，而纳米抗体因其在循环系统中快速清除的特性则更适用于成像目的。这些差异的原因在于，较小的纳米抗体（15–17 kDa）过量部分可通过肾脏迅速清除，而较大的传统抗体（150 kDa）过量部分则会在循环系统中滞留。因此，纳米抗体用于分子成像的主要优势在于，无论注射剂量如何，在早期成像时间点均能实现较低的背景信号。这使得同日成像成为可能，并有望转化为临床应用。相反，传统抗体必须精确滴定，以在维持靶组织足够特异性信号的同时，最大限度地减少非特异性背景信号（未发表数据）。
该方法的局限性之一是 体内 近红外荧光成像技术的局限性在于穿透深度较浅，通常只能用于皮下肿瘤模型的成像，而无法对原位肿瘤模型进行成像。然而，这一限制在实验条件下可能通过近年来发展的断层光声成像技术得以克服，该技术可实现对活体小鼠的全身成像。 27近红外荧光成像技术的另一局限性在于与放射性核素介导成像相比，难以评估组织剂量。然而，纳米抗体可通过放射性标记用于移植瘤模型的正电子发射断层扫描（PET）成像，并实现示踪剂生物分布的精确定量评估。事实上，我们的近红外荧光成像结果与近期一项比较纳米抗体与传统抗体用于PET成像的研究结果一致。该研究作者同样得出结论：纳米抗体可实现当日成像，并获得较高的肿瘤与背景信号比。 15.
然而，只有使用近红外荧光染料 AF680 标记抗体构建体，才使我们能够进行全面的 体外, 在体 和 离体 采用流式细胞术、荧光显微镜和近红外荧光成像（NIRF-imaging）进行比较。基于上述原因，以及近红外荧光成像具有非放射性、高灵敏度、成本低廉且所用靶向探针相对易于制备等优势，我们推荐在临床前分子成像中应用NIRF成像技术来评估新型抗体构建物。

在本报告中，我们描述了近红外荧光染料标记探针在验证中的应用 体内 使用异种移植成像实验 离体 流式细胞术和分离的异种移植肿瘤的荧光显微镜检查。我们比较了一种单域纳米抗体（s+16a 17 kDa 1 和一种单克隆抗体（Nika102 150 kDa 2,3 靶向同一目标抗原以实现特异性 体内 在淋巴瘤异种移植模型中进行近红外荧光成像。靶抗原ADP-核糖基转移酶ARTC2.2由淋巴瘤细胞以GPI锚定的细胞表面外切酶形式表达 4-9.
源自骆驼科动物重链抗体的纳米抗体是目前最小的抗原结合片段 10,11分子量仅约15 kDa，这些小型抗体片段具有可溶性、高度稳定性，并可通过肾脏从循环中清除 8,10这些特性使它们特别适用于对肿瘤抗原进行特异且高效的靶向 体内 12-20常见的可利用纳米抗体靶向的抗原包括表皮生长因子受体（EGFR1 或 HER-1）、人表皮生长因子受体2型（HER-2 或 CD340）、癌胚抗原（CEA）以及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1） 21纳米抗体偶联物在癌症免疫治疗和炎症性疾病治疗中具有广阔的应用前景 22.
近期研究表明，与传统抗体相比，纳米抗体在肿瘤与背景的比值（T/B）方面具有更高的比率 体内 分子成像应用 8,17,19这主要归因于传统抗体相对较差且缓慢的组织穿透能力、血液循环中的清除速度慢，以及在非靶向组织中的长期滞留。 23此外，过量的传统抗体会因增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）而在靶抗原阴性的肿瘤中发生非特异性蓄积。 24,25这意味着，增加传统抗体的剂量不仅会增强特异性信号，还会增加非特异性信号，从而降低可达到的最大肿瘤与背景比。相比之下，增加纳米抗体的剂量可提高抗原阳性肿瘤的信号，但不会增强正常组织或抗原阴性肿瘤的信号（未发表数据）。
除了比较纳米抗体与传统抗体外，我们还概述了在同一小鼠体内对抗原阳性与阴性异种移植瘤进行个体内评估的方法，以直接比较由于EPR效应引起的特异性与非特异性信号。通过近红外荧光染料标记的探针，我们能够在活体（in vivo）和离体（ex vivo）条件下利用近红外荧光成像、流式细胞术和荧光显微镜使用单一探针&#160;。应用我们的实验方案可实现非放射性、高灵敏度且低成本的in vivo分子成像实验优化，例如评估用于特异性肿瘤靶向的新抗体构建体。
本教程研究的目的是强调近红外荧光成像（NIRF-成像）在临床前分子成像中用于评估新型抗体构建物的应用。
在本实验方案中，所有实验均使用小动物近红外荧光成像系统、荧光激活细胞分选（FACS）流式细胞仪和共聚焦显微镜进行。

<table><tbody><tr><td>AF680 蛋白标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD16/CD32 抗体</td><td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD31 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td>使用 AF488 标记的二抗进行检测</td></tr><tr><td>抗 CD45 抗体 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision LE 软件</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>可使用替代产品</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>可使用替代产品</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Leica SP5，配备以下激光器：用于 AF680 的 He-Ne 激光器、用于 AF488 的氩离子激光器，以及用于 DAPI 的 405 二极管激光器</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10 细胞&amp;nbsp;</td><td>实验室特有</td><td></td><td>可使用具有不同表面靶标的其他细胞</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200，配备用于 AF680 的滤光片组 #32：000000-1031-354</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>可使用其他活体成像系统</td></tr><tr><td>Leica LAS 软件</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>与所用显微镜配套的专用软件</td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>与所用成像系统配套的专用软件</td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>可使用替代产品</td></tr><tr><td>Nika102-抗体 AF680</td><td>实验室特有</td><td></td><td>可使用针对不同表面靶标的其他抗体</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>潜在危害：具有致癌性，可刺激眼睛和皮肤，接触可能导致皮肤干燥和/或过敏性皮炎</td></tr><tr><td>s+16a-纳米抗体 AF680</td><td>实验室特有</td><td></td><td>可使用针对不同表面靶标的其他抗体</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>可使用替代产品</td></tr></tbody></table>

纳米抗体与抗体验证 在体 小鼠肿瘤异种移植nirf成像实验 离体 流式细胞术与显微镜检查

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

本方案概述了执行所需的操作步骤 离体 验证 在体 使用荧光标记的纳米抗体和传统抗体在小鼠中进行近红外荧光（NIRF）异种移植成像实验
首先，我们描述如何在小鼠体内建立皮下肿瘤，使用抗原阴性细胞系作为阴性对照，抗原阳性细胞系作为阳性对照，置于同一只小鼠体内以进行个体内的比较。我们概述了如何静脉注射近红外荧光染料标记（AlexaFluor680）的抗原特异性纳米抗体和常规抗体。体内成像采用小动物近红外荧光（NIRF）成像系统进行。在完成体内成像实验后，处死小鼠。随后，我们描述如何制备肿瘤组织，用于流式细胞术和荧光显微镜的平行离体分析，以验证体内成像结果。
使用近红外荧光染料标记的纳米抗体可实现非侵入性的同日体内成像。in vivo。我们的实验方案描述了通过流式细胞术对肿瘤细胞的特异性标记效率进行离体（ex vivo）定量，并通过荧光显微镜分析抗体构建物在肿瘤内的分布情况。使用近红外荧光染料标记的探针可实现非侵入性、经济高效的in vivo成像，且具有独特优势：同一探针无需进一步二次标记，即可用于流式细胞术和荧光显微镜的离体（ex vivo）验证实验。

荧光标记探针可实现不同近红外荧光成像技术的结合（图1A）。我们的目标是执行 体内 近红外荧光成像、流式细胞术和荧光显微镜依次进行，以比较荧光标记的纳米抗体与单克隆抗体的特异性 体内 成像（图1B).
为评估荧光标记构建体在活体成像中的特异性，小鼠被注射了50 μg的纳米抗体和单克隆抗体。体内成像结果显示，在注射后6小时，纳米抗体和单克隆抗体均能特异性地标记抗原阳性肿瘤（图2）。对抗原阳性肿瘤进行感兴趣区域（ROI）分析显示，纳米抗体的肿瘤/本底比（T/B比）约为12，明显高于单克隆抗体的约6。此外，纳米抗体在抗原阴性肿瘤中未显示非特异性信号，而单克隆抗体在抗原阴性肿瘤中则表现出非特异性的干扰信号。
除了阴性肿瘤的非特异性信号外，单克隆抗体还在整个动物体内引起非特异性的背景信号。这可能是由于过量的游离循环抗体所致，这些抗体分子过大，无法经肾脏排泄。相反，注射纳米抗体的动物仅在肾脏中出现非特异性信号，这是由于小分子纳米抗体通过肾脏被清除所致。
肿瘤细胞悬液的流式细胞术分析显示，在注射后6小时，两种AF680偶联物均特异性标记了抗原阳性肿瘤细胞。与单克隆抗体标记的细胞相比，纳米抗体标记细胞表现出更强的荧光信号，这反映了 在体内 近红外荧光成像结果。重要的是，流式细胞术分析显示，两种构建体均未对无抗原表达的细胞产生非特异性标记图3).
肿瘤冷冻切片的荧光显微镜观察显示，在注射纳米抗体6小时后，抗原阳性细胞呈现强且几乎均一的标记。相反，单克隆抗体的染色则明显较弱且分布不均（图4A）。注射纳米抗体6小时后，抗原阴性肿瘤未见染色；而注射传统抗体的抗原阴性肿瘤则在间质区域出现非特异性的散在染色（图4B）。
<img alt="多模态成像示意图：体内成像、流式细胞术和显微镜下的NIRF AF680；纳米抗体与单克隆抗体比较。" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：荧光成像与抗体构建体。 (A) AF680偶联物的成像设置：体内近红外荧光（NIRF）成像，随后进行流式细胞术和荧光显微镜分析。(B) AlexaFluor680标记的纳米抗体s+16a（红色）与单克隆抗体Nika102（蓝色）的示意图。橙色星号表示AlexaFluor680荧光染料。
<img alt="显示 Nika102 和 s+16a 化合物在 0 小时和 6 小时分布的小鼠荧光成像。" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：活体近红外荧光成像。 注射了纳米抗体 s+16a（A）和单克隆抗体 Nika102（B）的小鼠体内抗原阳性（+）和抗原阴性（-）肿瘤的荧光信号图像。活体成像在注射前（0 h）和注射后 6 h 进行。信号强度以辐射效率（p/sec/cm2/sr）/（µW/cm2）表示。
<img alt="Flow cytometry scatter plot analysis diagram showing ARTC2+ cell detection via fluorescence intensity." src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3： 离体 肿瘤细胞悬液中细胞结合抗体构建物的FACS分析 (A) 肿瘤细胞FACS分析的设门策略。B) 直方图显示静脉注射的AF680标记纳米抗体s+16a和抗体Nika102特异性结合到肿瘤细胞的量 体内抗原阴性肿瘤以空心直方图表示，抗原阳性肿瘤以实心直方图表示。
<img alt="Fluorescence microscopy of s+16a&lt;sub&gt;680&lt;/sub&gt; and Nika102&lt;sub&gt;680&lt;/sub&gt;, ARTC2 positive/negative." src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 离体 荧光显微镜技术 (A) 概述 注射 s+16a 后 6 小时对全部抗原阳性肿瘤冷冻切片进行荧光显微镜观察680 或 Nika102680. 条带信号强度的 体内 静脉注射的AF680偶联物未使用任何二抗标记试剂，以红色显示。 离体 细胞核复染呈蓝色，血管呈绿色。虚线表示整个肿瘤的外缘。B) 特写 抗原阳性与抗原阴性肿瘤的荧光显微镜观察

本方案概述了执行所需的操作步骤 离体 验证 体内 使用荧光标记的纳米抗体和常规抗体在小鼠中进行近红外荧光异种移植成像实验。

纳米抗体与抗体验证 在体 小鼠肿瘤异种移植NIRF成像实验 离体 流式细胞术与显微镜检查

本方案概述了在小鼠体内进行近红外荧光（NIRF）异种移植成像实验后，开展离体验证所需的操作步骤。

本实验的总体目标是利用标记了近红外荧光染料 Fluor four 的纳米抗体或传统抗体，在小鼠体内进行活体近红外荧光异种移植成像实验的离体验证。首先，向荷有抗原阳性与阴性异种移植瘤的小鼠体内注射标记了近红外荧光染料 Fluor four 的抗原特异性抗体以及传统抗体；第二步，进行活体成像。成像后，处死小鼠以取出异种移植瘤，并进行离体分析。最终通过离体流式细胞术和荧光显微镜检测，验证活体成像结果。该方法相较于核成像等现有方法的优势在于，使用近红外荧光染料可利用单一探针实现流式细胞术、荧光显微镜和近红外荧光成像之间的全面体外、活体及离体多模态成像比较。该方法有助于解答肿瘤成像领域的关键问题，例如在手术过程中定位转移灶以及监测抗肿瘤治疗的疗效。使用荧光染料标记抗体可实现对细胞结合抗体的精确离体定量，从而帮助我们区分在活体中观察到的特异性信号是源于与细胞表面抗原结合的抗体，还是由于所谓的增强渗透性和滞留效应（EPR效应）导致的非特异性信号。在注射肿瘤细胞后7至9天，当肿瘤直径约为8毫米时。首先准备对小鼠进行成像，涂抹眼药膏并启动成像系统。然后将麻醉后的小鼠置于加热的载物台上，使其肿瘤部位朝向相机。在成像过程中，使用成像室内的异氟烷气体调控装置维持1%至2%的异氟烷浓度。监测动物呼吸频率：若呼吸过快，表明麻醉过浅；若呼吸过慢或不规则，则表明麻醉过深。在获取基线图像后，对小鼠进行成像。通过尾静脉注射，将50微克LOR六80标记的抗体构建物注入小鼠体内，注射体积为200微升生理盐水。成像后处死小鼠，将其固定在泡沫板上，并用70%乙醇清洁。然后切开皮肤以暴露肿瘤。用手术刀切除肿瘤，并保持肿瘤组织完整。取出后，将肿瘤切成两半，其中一半转移至含有P-B-S-A-E-B-S-F溶液的培养皿中，并置于冰上用于传真分析；另一半转移至预冷的4%PFA溶液中，用于免疫组织化学。在4°C固定24小时后，将肿瘤转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，并在4°C保存直至肿瘤完全沉入溶液底部。随后将肿瘤切成适合放入冷冻模具的小块。 将OCT包埋剂注入模具中，并将肿瘤组织块转移至模具内。组织必须完全浸没在OCT中。然后将冷冻模具置于干冰上，待其完全冻结后，于-80摄氏度保存，直至进行后续处理。为准备细胞，将肿瘤的一半转移至细胞筛中。将其切成三到四块，然后取出2毫升注射器的推杆，用推杆在筛网上碾压组织。收集滤过筛网的液体。待组织充分碾碎后，用PBS冲洗筛网。然后将收集的悬液转移至新离心管中，在500 G条件下离心5分钟。用含有0.2% BSA的10毫升PBS重悬细胞沉淀。随后对细胞进行计数，并将100万至500万个淋巴瘤细胞分装至5毫升流式管中，在500 G条件下离心，弃去上清液。然后将细胞重悬于100 µL含0.2% BSA的PBS中。此时可使用抗体结合FcγR以阻断Fc受体（FCR）。孵育10分钟后，用含0.2% BSA的PBS洗涤细胞一次。随后加入抗CD45单克隆抗体，以鉴定白细胞。将细胞与此抗体在避光条件下孵育20分钟，然后在进行传真分析前用两次洗涤去除抗体。将细胞在冰上用碘化丙啶染色15分钟以鉴定死细胞，随后用普通PBS彻底洗涤。随后将细胞重悬于150微升PBS中，并继续后续操作。为评估荧光标记构建物的特异性，向小鼠注射50微克纳米抗体和单克隆抗体。用于活体成像。所有成像均在注射流结束六小时后进行。对肿瘤细胞悬液的流式细胞分析显示，两种AF 680偶联物均特异性标记了抗原阳性肿瘤细胞。两种构建物均未对抗原阴性细胞产生非特异性标记。肿瘤。冷冻切片显示，纳米抗体对抗原阳性细胞的标记强且几乎均一。然而，单克隆抗体的染色则明显较弱，且呈异质性，与预期的抗原分布一致。阴性肿瘤未显示抗体抗原染色，注射常规抗体后，阴性肿瘤在间质区域仅呈现非特异性散在染色。这与注射常规抗体后抗原阳性肿瘤的染色情况非常相似，一旦掌握即可识别。该技术的成像部分可在单日内完成。此外，还可采用其他方法（如纳米抗体的放射性标记）来研究注射后的偶联物在不同组织中的生物分布或其他相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用荧光标记探针对活体近红外荧光成像结果进行多模态离体验证。从而为您提供一种用于临床前分子成像中评估新型抗体构建物的技术。

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