纳米抗体和基于抗体的验证在体内肿瘤异种移植NIRF成像的小鼠实验使用离体流式细胞仪和显微镜

该方案概述了使用荧光团标记的纳米抗体和常规抗体在小鼠中进行体内近红外荧光异种移植成像实验的离体验证所需的步骤。

该程序的总体目标是使用 Fluor 四个标记的纳米抗体或常规抗体在小鼠中进行体内近红外荧光异种移植成像实验的离体验证。这是通过首先对携带抗原阳性和阴性异种移植物的小鼠施用近红外荧光、四种标记的抗原特异性抗体和常规抗体来实现的。第二步是进行体内成像。

成像后，处死小鼠以去除异种移植物，这些异种移植物被处理用于离体分析。最终，离体流式细胞术和荧光显微镜用于验证体内成像结果。与细胞核成像等现有方法相比，该方法的优势在于，使用近红外荧光染料可以与流式细胞术、荧光显微镜和近红外荧光成像的单个探针进行全面的体外、体内和离体多模式成像比较。

这种方法可以帮助回答肿瘤成像领域的关键问题，例如在手术过程中定位转移和监测抗肿瘤治疗的效率。用荧光力标记抗体可以对细胞结合的抗体进行精确的离体定量。这使我们能够区分我们在体内看到的特异性单细胞是由于抗体引起的，与细胞表面抗原结合，还是由于所谓的增强渗透性和保留效应而引起的非特异性。

注射肿瘤细胞后 7 到 9 天，此时肿瘤的直径应约为 8 毫米。准备首先对小鼠进行成像，涂抹眼药膏并初始化成像系统。然后将麻醉的小鼠放在加热的舞台上，它们的肿瘤对准相机。

使用安装在成像室中的 isof 氟歧管在成像过程中保持 1% 至 2% ISO 氟。监测呼吸频率。如果麻醉太快，则麻醉太轻，如果麻醉缓慢或不规则，则麻醉太深。

然后在获得基线图像后对小鼠进行成像。向小鼠注射 50 μg LOR 6 80 标记的抗体构建体。以 200 微升盐水的体积进入尾静脉进行此作。

成像后，对小鼠实施安乐死并将其安装到聚苯乙烯泡沫塑料块上，并用 70% 乙醇清洁。然后切开皮肤以露出肿瘤。用手术刀切除肿瘤并保持肿瘤完整。

取出后，将肿瘤切成两半，将一半转移到 ICE 上的 P-B-S-A-E-B-S-F 溶液培养皿中进行传真分析，并将另一半转移到两次冷的 4% PFA 中进行免疫组织化学。在 4 摄氏度的固定剂中 24 小时后，将肿瘤转移到含有 30% 蔗糖的 PBS 中，并保持在 4 摄氏度，直到它们完全沉入溶液中。然后将肿瘤切成适合冷冻模具的碎片。

用 OCT 化合物填充模具并将肿瘤块转移到模具中。组织必须完全浸入 OCT 中。然后将冷冻模具转移到干冰中，当它们完全冻结时，将它们存放在零下 80 摄氏度下，直到它们可以加工。

为了准备细胞，将肿瘤的一半转移到细胞中，在过滤器中过滤。将其切成三到四块，然后从 2 毫升注射器中取出柱塞，用柱塞将组织捣碎在过滤器上。收集流经过滤器的溶液 组织捣碎后，用 PBS 冲洗过滤器。

然后将收集的悬浮液转移到新试管中，并以 500 G 的离心速度离心 5 分钟。我们将细胞沉淀悬浮在 10 毫升含 0.2% BSA 的 PBS 中。然后将细胞计数，将 1 到 500 万个淋巴瘤细胞分装到 5 毫升传真管中，并以 500 G 的速度旋转管并丢弃上清液。

然后将细胞悬浮在 100 微升含 0.2% BSA 的 PBS 中。此时，可以使用结合 FC γ R 的抗体阻断 FCR，等待 10 分钟，然后用含 0.2%BSA 的 PBS 洗涤细胞一次。现在添加抗 CD 45 单克隆抗体来鉴定白细胞。

用这种抗体在黑暗中孵育细胞 20 分钟，然后在传真分析前用两次洗涤将其去除。在冰上用碘化丙啶对细胞染色 15 分钟，以鉴定死细胞。然后用普通 PBS 清洗干净。

随后，Resus 将细胞悬浮在 150 微升 PBS 中，然后进行事实分析。给小鼠注射 50 μg 纳米抗体和单克隆抗体，以评估荧光标记构建体的特异性。用于体内成像。

所有成像均在注射流式后 6 小时进行。肿瘤细胞悬液的细胞术分析显示，AF six 80 偶联物均对抗原阳性肿瘤细胞进行特异性标记。两种构建体均未对抗原阴性细胞进行非特异性标记。

肿瘤。冷冻切片显示抗原阳性细胞与纳米抗体的强烈且几乎均匀的标记。然而，单克隆抗体在均质染色中表现出的抗体比预期的抗原要弱得多。

阴性肿瘤显示抗体抗原无染色 阴性肿瘤注射常规抗体后间质间隙显示非特异性散在染色。这与抗原中的染色场景非常相似。注射常规抗体后肿瘤阳性 一旦掌握。

该技术的成像部分可以在一天内完成 遵循此程序。可以执行其他方法，如纳米抗体的放射性标记，以研究注射的偶联物在不同组织中的生物分布或其他问题。观看此视频后，您应该对如何使用荧光 4 标记探针对体内近红外荧光成像体验进行多模态离体验证有了很好的了解。

从而为您提供一种用于临床前分子成像的新抗体构建体评估的技术。