核衣壳退火介导电泳（NAME）分析允许HIV-1核衣壳抑制剂的快速鉴定
January 19th, 2015
该方案描述了 NAME，一种允许快速识别能够在体外抑制 HIV-1 核衣壳蛋白伴侣活性的分子的测定法。
该实验的总体目标是快速鉴定能够抑制 HIV 一种核衣壳蛋白伴侣活性的分子。体外 NC 是一种小而高碱性的蛋白质，其结构特征是一个灵活的末端结构域和两个高度保守的锌指，它们与病毒核酸相互作用。NC 与 tar RNA 发夹及其 DNA 互补序列 CT A r 相互作用，并促进其二级结构的熔解，使它们可用于牙垢杂交体。
当混合在一起并与 nc 孵育时，通过使用 tar 和 sitar 序列的顶端部分来执行该方案。杂交体以线程形式形成，与寡核苷酸相互作用的循环器抑制 NC 催化的杂交体形成。通过标准聚丙烯酰胺分析反应结果，凝胶电泳、TAR 和 CA 在凝胶中的迁移率与杂化物相比不同。
堆存器中穿线浓度的增加导致杂交体的减少，同时出现游离焦油和 CT A.该技术相对于现有方案（例如凝胶位移分析或焦油跪下）的主要优点是它不需要对核酸进行初步作，例如放射性标记。这种方法可以帮助回答药物发现领域的关键问题，例如 HIV 1 和 C 抑制剂 通常是个体。作为这种方法的新手，我们努力解决方案的整体组织问题，特别是每个原液的连续稀释、准确的孵育时间以及终止反应的正确程序。
要开始此程序，请在 TNMG one X 缓冲液中制备 10 微升一微摩尔焦油和 10 微升一微摩尔 CT A。将试管加热至约 95 摄氏度 5 分钟，然后冷却至室温，以便 TAR 和 CT A 修复其茎凸起环结构。要制备一种微摩尔的杂交焦油 CT A 溶液作为对照，将 1 微升 10 微摩尔焦油与一微升 10 微摩尔 CT A 在 TNMG 1 X 缓冲液中混合。
用 DEPC 水填充试管，总体积为 10 微升。然后将试管加热至 95 摄氏度 5 分钟，使寡核苷酸变性。当所有溶液冷却至室温时，进行短暂的旋转离心，然后向每种溶液中加入 3 微升带有 SDS 的 GLB，并将其在试管内注入 3 次
。将样品放在冰上，直到加载步骤。在此过程中，在毫 Q 水中制备 10 微升 500 微摩尔、250 微摩尔、50 微摩尔和 5 微摩尔稀释的化合物 1。然后在 TNMG one X 缓冲液中制备 27.5 微升四微摩尔焦油和 27.5 微升四微摩尔 CTA。
将两根试管加热至约 95 摄氏度 5 分钟以折叠结构，并使用 2.5 μL 这些折叠的寡核苷酸溶液进行以下步骤。接下来，将 NC 蛋白和 NC 12 至 55 肽的储备液用水稀释至 80 微摩尔。当 TAR 和 CAR 溶液冷却至室温时，对两根试管进行短暂的离心离心，然后制备 20 个空的高压灭菌试管，并将两排每排 10 支试管放在用于实验室样品的架子中。
然后，将 2.5 微升折叠的焦油添加到第一行的每根试管中。随后，向每根试管中加入 2.5 微升折叠的 CT A。在第二行中，加入 2 微升适当的化合物，1 微升稀释到 tar 和 CT A r。
将样品中的化合物替换为水，以分析对照中的 NC 和 NC 12 至 55 肽。将样品在室温下孵育 15 分钟。15 分钟后，将 CT A R 样品与相应的焦油样品混合。
向样品中加入 1 微升 80 微摩尔 NC 进行 NC 分析，或向样品中加入 1 微升 80 微摩尔 NC 12 至 55 肽，用于 NC 12 至 55 肽分析。在室温下再孵育 15 分钟后，向每个样品中加入 3 μL 含 SDS 的 GLB 以终止反应。将每管中的混合物移液 3 次，然后将其置于冰上。
使用用于 NC 和 NC 12 至 55 肽分析的样品重复此步骤，并将样品保持在冰上直到加载步骤。现在，取下凝胶装置的盖子。将每个样品 13 微升装入孔中。
在打开凝胶仪之前，请盖上凝胶仪的盖子。在 200 恒定电压下电泳凝胶 2 小时 30 分钟，直到染料迁移到凝胶底部上方 1.5 厘米处。然后，将凝胶放入装有所需核酸染色溶液的合适容器中，并在搅拌下放置 30 至 45 分钟。
将凝胶放在透光器成像系统上，通过荧光信号检测核酸。名称测定用于评估线程和相互排列剂稳定动态核酸结构和抑制 NC 伴侣活性的能力。螺纹间整理器是较普通的芳香族分子，被位于环系统相对两侧的大块侧链所取代，例如此处显示的蒽醌。
该图显示了在化合物 1 存在下的名称测定结果，化合物 1 是存在全长 NC 或截短肽的已知螺纹间整理器。在这两种情况下，通过增加 inter collator 的浓度来减少 tar ct（一种由 NC 混合体）的形成。同时，游离焦油和 CT A R 的量增加。
在尝试此过程时，请务必记住将 JA 上样缓冲液与 SDS 一起使用。这是 name 取得最佳成功的关键一步。例如，如果不遵循此步骤，则无法区分凝胶系统中的核酸条带。
观看此视频后，您应该对折叠在飞机结构中的任何字母室温寡核苷酸进行 MSA 以及如何分析反应结果，使用重组全长 NC 蛋白或截短合成 NC 肽来识别交易插值剂抑制 NC。不要忘记，使用 intercos 和聚丙烯酰胺可能非常危险，在执行此方案时应始终采取预防措施，例如佩戴实验室外套、手套和安全眼镜。
概述
本协议描述了一种能够快速识别能够在体外抑制HIV-1核衣壳蛋白伴侣活性的分子的检测方法。该方法利用特定的RNA序列，并通过凝胶电泳分析结果。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 病毒学
背景
- HIV-1核衣壳蛋白（NC）在病毒复制中起着至关重要的作用。
- NC与病毒RNA和DNA相互作用，促进核酸结构的形成。
- 抑制NC的伴侣活性可能是药物发现的潜在策略。
- 现有方法通常需要复杂的核酸操作。
研究目的
- 开发一个简单的检测方法来识别NC抑制剂。
- 消除在核酸分析中使用放射性标记的需要。
- 提供一个对这一领域的新研究者友好的协议。
使用的方法
- RNA寡核苷酸的制备及其杂交。
- 将NC蛋白与各种化合物孵育以评估抑制效果。
- 使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应结果。
- 通过荧光成像检测核酸。
主要结果
- 该检测方法成功识别出能够抑制NC伴侣活性的化合物。
- 抑制剂浓度的增加与杂交形成的减少相关。
- 该方法比传统技术表现出明显的优势。
- 结果显示了针对HIV的进一步药物开发的潜在途径。
结论
- 该检测方法提供了一种快速有效的方法来筛选NC抑制剂。
- 该协议用户友好，适合广泛的研究人员使用。
- 未来的研究可以在此方法的基础上探索其他治疗选择。
常见问题
Executive Industry Relevance
The NAME assay enables rapid identification of inhibitors targeting the HIV-1 nucleocapsid protein's chaperone activity, a critical step in viral replication. By providing a label-free, gel-based readout, this method supports early-stage drug discovery and mechanistic de-risking for antiviral portfolios. Its streamlined workflow enhances predictive confidence in target engagement and inhibitor efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates direct interrogation of nucleocapsid chaperone function and inhibitor impact.
- Enables mechanistic de-risking by distinguishing compounds that disrupt nucleic acid annealing.
- Supports functional target validation for HIV-1 replication pathways.
- Provides actionable data for triaging candidate inhibitors in antiviral programs.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible assay format suitable for primary or secondary screening.
- Generates quantitative gel-based outputs without the need for nucleic acid labeling.
- Enables rapid assessment of compound potency and specificity against NC-mediated annealing.
- Supports scalable evaluation of diverse chemical libraries targeting nucleic acid-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling HIV-1 nucleocapsid activity in vitro.
- Provides continuity from molecular target validation to preclinical inhibitor profiling.
- Informs risk-adjusted advancement of lead compounds with validated mechanism of action.
- Supports translational biomarker development by linking biochemical inhibition to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The NAME assay is positioned at the intersection of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and mechanistic validation of nucleocapsid inhibitors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of NC function and inhibitor mechanism.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound ranking and selection.
- Analytics: Delivers clear gel-based readouts to compare inhibitor efficacy across conditions.
- Translational Research: Bridges molecular mechanism to preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for screening nucleic acid-protein interaction inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement and mechanism-based inhibitor selection.
- Operational Value: Reduces assay complexity by eliminating labeling and streamlining gel-based analysis.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and prioritization of high-value antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risks late-stage biological failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and polyacrylamide gel electrophoresis.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and imaging systems.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptable to different NC protein constructs and oligonucleotide substrates as supported by the protocol.
- Careful handling of intercalators and gel reagents is essential for safety and data integrity.
