有针对性的DNA甲基化分析通过新一代测序
February 24th, 2015
亚硫酸氢盐扩增子测序 （BSAS） 是一种定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化的方法。该方法在下一代测序之前使用亚硫酸氢盐转化与靶区的 PCR 扩增配对，以产生碱基特异性水平的 DNA 甲基化绝对定量。
该程序的总体目标是从感兴趣的组织或细胞中分离的基因组 DNA 中定量目标区域目标区域的 CPG 甲基化。这是通过首先设计亚硫酸盐特异性 PCR 引物以从亚硫酸氢盐转化的基因组 DNA 中扩增目标区域来实现的。在第二步中，扩增亚硫酸氢盐转化的目标区域，并从扩增子缺点生成下一代测序或 NGS 文库。
接下来，对库进行排序并生成 FASTQ 文件进行分析。在最后一步中，将测序读数与亚硫酸氢盐转化的参考靶序列对齐，最终通过亚硫酸盐扩增子测序计算 5 mc %，或者可以执行 BS a s 以精确和准确地定量任何模式生物中任何感兴趣区域的 CPG 甲基化。与 Sanger 测序等现有方法相比，该技术的主要优势在于，BS A S 以快速、高通量的方式提供准确和精密的 CPG 甲基化定量，从而有机会在大量样品中检测多个区域。
在确定靶标并设计引物后，组装反应物以优化单个扩增子的靶标扩增，然后用热封膜密封 PCR 板，以通过页面电泳观察扩增子。接下来，在适当的孔中加入 30 μL PCR 反应或分子量标准，然后在 200 伏特下运行凝胶约 45 分钟。当第一种染料到达凝胶末端时，停止反应，然后用每毫升 5 微克新鲜制备的 AUM 溴化物覆盖整个凝胶。
5 分钟后，通过 UV 透射器以 482 纳米的激发波长对凝胶进行成像。使用分子量标准确定 PCR 扩增子的大小，以确定反应的特异性。寻找预期扩增子大小以外的多个条带，以确定检测到的文库峰的平均大小和摩尔浓度的估计值。
接下来，根据制造商的说明，用高灵敏度 DNA 测定在毛细管电泳 DNA 大小芯片上运行文库。通过 QPCR 量化库。根据制造商的说明，使用绝对定量设置，在实时仪器上使用针对生成的文库和标准品中已知浓度的接头序列设计的引物。
然后使用文库的大小和 QPCR 的摩尔定量来计算文库的摩尔浓度。测序后，将压缩的快速 Q 文件导入到相应的测序分析管道中，选择导入，然后选择用于生成读数的测序方法，以保留读数修剪应用的 Q 分数。导入相应的压缩快速 Q 读取文件，然后在 General options （常规选项） 下，取消选择 discard quality scores （放弃质量分数）。
为导入的读取选择一个位置，然后单击 finish。然后在 NGS 核心工具下，选择 trim 序列。突出显示要修剪的读数，仅保留包含大于或等于 Q 30 分数的读数。
然后选择 Trim using Quality Scores，并将限制设置为 0.001。进一步仅选择包含小于或等于一个模糊核苷酸的 reeds。选择 trim ambiguous nucleotides 并将最大歧义数设置为 1。
然后选择一个位置来保存修剪的读数，然后单击 finish（完成）将修剪的 res 映射到亚硫酸盐转换的基因参考计算机模拟。在 NGS 核心工具下，选择 map reads。要引用，请选择要映射的修剪读数，然后单击 下一步。
然后在 reference masking （引用掩码） 下，选择转换后的 reference sequence 并选择 no masking（无掩码）。单击 Next（下一步），然后为 mismatches、insertions 和 deletion 分配一个分数 3。为参考的读长映射的最小分数分配分数 1，并在非特异性匹配处理下为映射、读取和引用之间的最小身份分数分配分数 0.9，选择、忽略，然后单击输出选项下的下一步。
接下来，选择 Create standalone read mappings（创建独立读取映射）。然后在 result handling（结果处理）下，单击 Save（保存）。选择一个位置以保存读取映射，然后单击 finish 以对映射的读取运行变体调用。
在 re-sequencing analysis 下，选择低频变异检测，然后选择要分析的读长映射。单击 Next，然后在 Low frequency variant parameter 下输入 0.01%，然后单击 Next。在常规过滤器下，将最小覆盖范围设置为 1000，以确保序列的深度大于或等于 1000 x。
最后，单击下一步，然后在输出选项下选择创建注释表并选择保存变体表文件的位置，单击完成并使用变体表文件中感兴趣区域中注释的 CPG 位点的变体频率，通过亚硫酸盐扩增子测序读数计算 CG 上下文中参考胞嘧啶甲基化的频率与转换后的参考序列正确对齐的读数将类似于所示内容在图中。通过观察 CPG 位点的碱基检出，可以清楚地识别 CPG 二核苷酸，并估计甲基化状态。在映射的读数中，0% 甲基化将导致含有胸腺嘧啶的映射读数映射到 CPG 位点。
100% 甲基化对照将导致包含映射到 CPG 位点的胞嘧啶的映射读数。在本实验中，从小鼠、小脑和视网膜中共分离 RNA 和 DNA。然后按预期使用 QPCR 测量视网膜组织中选择性表达的视蛋白表达。
通过亚硫酸氢盐扩增测序定量 Opsin 启动子区域的 CPG 甲基化水平后，仅在视网膜中检测到 Opin RNA。然而，小脑中整个启动子区域的累积甲基化水平大于 80%，而视网膜中则小于 15%。B SAS 甲基化定量受益于位点特异性甲基化定量，允许在 CPG 特异性基础上比较任何给定基因组区域的甲基化水平。
事实上，在该实验中，发现与视网膜样本相比，小脑样本中跨视蛋白启动子的 CPG 甲基化水平显着更高。观看本视频后，您应该对如何从组织或细胞中分离的基因组 DNA 中定量目标区域中目标区域的 CPG 甲基化有很好的了解。
概述
亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量特定基因组区域的胞嘧啶甲基化的技术。这种方法结合了亚硫酸氢盐转化、PCR扩增和下一代测序，以实现精确的甲基化定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 分子生物学
- 表观遗传学
背景
- BSAS允许分析DNA甲基化模式。
- 它在研究基因调控和表达方面特别有用。
- 该方法为多个样本提供高通量能力。
- 它比传统方法（如Sanger测序）具有优势。
研究目的
- 准确定量目标基因组区域的CPG甲基化。
- 提高对各种生物学背景下表观遗传调控的理解。
- 促进不同模型生物甲基化的分析。
使用的方法
- 为目标扩增设计特定PCR引物。
- 扩增亚硫酸氢盐转化的基因组DNA。
- 从PCR扩增产物中生成NGS文库。
- 测序并分析生成的FASTQ文件。
主要结果
- 成功定量了各种组织中的CPG甲基化水平。
- 展示了小脑和视网膜之间甲基化模式的差异。
- 基于甲基化状态，提供了对视蛋白表达调控的见解。
- 验证了BSAS在甲基化分析中的准确性和精确性。
结论
- BSAS是一种定量DNA甲基化的稳健方法。
- 该技术增强了研究表观遗传修饰的能力。
- 它在各种研究领域中有应用潜力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeted DNA methylation analysis via bisulfite amplicon sequencing (BSAS) addresses the need for high-throughput, quantitative epigenomic profiling in early discovery. It enables precise interrogation of epigenetic regulation in disease-relevant genomic regions, supporting target validation and mechanistic de-risking. The method provides base-specific methylation quantitation that informs hypothesis testing and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of epigenetic mechanisms in target gene promoters or CpG islands.
- Scientific Value: Provides absolute cytosine methylation quantitation with base specificity for functional target validation.
- Operational Value: Supports rapid analysis of up to 96 samples and 10 kb of targeted regions per run.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative methylation data suitable for assay standardization and reproducibility assessment.
- Operational Value: Produces NGS-ready libraries from amplicons for scalable, multiplexed epigenetic screening.
- Operational Value: Facilitates confirmation of regions identified in genome-wide methylation studies through targeted validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system analysis by comparing methylation patterns across tissues or disease models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment through site-specific methylation quantification.
- Operational Value: Provides predictive confidence in epigenetic mechanism de-risking prior to lead identification.
Pipeline & Workflow Integration
BSAS fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling epigenetic data integration at key decision points.
- Discovery Biology: Supports interrogation of epigenetic regulation in target validation workflows.
- Screening: Delivers quantitative, high-throughput methylation readouts for compound or condition comparison.
- Analytics: Generates variant frequency data at CpG sites for precise methylation level calculation.
- Translational Research: Connects discovery epigenetics to preclinical continuity via tissue-specific methylation profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for targeted epigenetic analysis across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in epigenetic mechanism validation and reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of methylation quantification across sample sets.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through epigenetic de-risking and capital efficiency in target selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on epigenetic validation of disease-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bisulfite conversion, PCR primer design, and NGS library preparation.
- Depends on access to benchtop next-generation sequencing and capillary electrophoresis for library quantification.
- Necessitates cross-team standardization of bioinformatics pipelines for read trimming, mapping, and variant calling.
- Involves adaptation considerations for different DNA sources and genomic regions of interest.
- Limited by the need for prior knowledge of target regions to design specific primers.
