Name: 有针对性的DNA甲基化分析通过新一代测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习使用亚硫酸氢盐扩增子测序技术对目标基因组区域进行DNA甲基化定量分析。该方法结合PCR扩增与新一代测序技术，可精确检测CpG位点甲基化水平，适用于多种模式生物的表观遗传学研究。

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作者感谢 Colleen Van Kirk 提供的小鼠视网膜和小脑样本，以及 Peter Gregory 在图像绘制方面的协助。作者还感谢 Allison Gillaspy 博士及分子生物学与流式细胞术研究核心实验室提供 MiSeq 仪器的使用权限。本研究由美国国立卫生研究院基金 DA029405、EY021716 和 AG026607 以及 Donald W. Reynolds 基金会资助。

1. 从组织中分离核酸
注意：从同一样本组织中共同分离DNA和RNA，可同时获得用于表观遗传学分析的DNA以及配对的用于基因表达分析的RNA。此处示例为从实验组织中进行柱纯化的方法，但也可根据不同的样本类型或其他分离方法采用替代方案。主要要求是获得高度纯化的核酸，且不含蛋白质或有机溶剂等污染物。
<ol>
	<li>选取一块新鲜冷冻或新鲜组织用于机械匀浆，并置于冰上。将组织储存或转移至2.0 ml圆底微量离心管中。</li>
	<li>向每个含有组织的离心管中加入一颗5 mm的不锈钢珠。根据制造商针对细胞数量或组织重量的建议，加入适量的裂解缓冲液。</li>
	<li>使用珠磨机机械匀浆仪在30 Hz条件下匀浆组织30秒。 
	注意：机械匀浆的频率和持续时间取决于组织类型。较软的组织使用推荐设置即可完全匀浆，而较硬的组织则需要优化设置。</li>
	<li>使用硅胶柱在室温下按照制造商说明书进行DNA和RNA的提取。
	<ol>
		<li>洗脱 RNA 50 µl 加入无RNase水，置于冰上。将RNA用于通过qPCR进行的mRNA表达分析。</li>
		<li>洗脱 DNA 于 100 µl TE缓冲液。使用洗脱液重复从DNA柱上洗脱，以提高DNA浓度和得率。将DNA用于靶向甲基化定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准分光光度计在 230 nm、260 nm、280 nm 和 320 nm 处测定吸光度，以评估 DNA 和 RNA 的质量。 
	注意：高质量DNA的A260/A280比值应约为1.8–2；高质量RNA的A260/A280比值应约为2。230 nm处出现过高的吸光度表明分离过程中存在污染物。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用毛细管电泳芯片对RNA进行进一步质量检测。 
	注意：高质量的RNA其RNA完整性指数（RIN）应较高 &gt;8. 电泳图谱中除rRNA峰外出现额外峰表明样品存在污染。</li>
	<li>根据制造商说明书，采用荧光法测定DNA和RNA的含量。 
	注意：与单独使用分光光度法相比，荧光测定法在核酸定量方面具有更高的灵敏度和特异性。</li>
	<li>将分离的DNA和RNA储存在-80 °C.</li>
</ol>
2. 靶标识别与引物设计
<ol>
	<li>根据适当的参考基因组序列，确定需通过BSAS分析的基因组区域。差异表达基因的启动子区域通常是甲基化定量分析的常见靶点。</li>
	<li>制备一种 计算机模拟 用于后续将测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的参考基因组，可通过文本编辑器修改 .fasta 序列文件实现。在 5’-3’ 方向，将非 CpG 位点的胞嘧啶（cytosine）替换为胸腺嘧啶（thymine）图2).</li>
	<li>设计引物组以扩增经亚硫酸氢盐转化DNA中的目标区域。
	<ol>
		<li>选择并复制未转化的目标区域（5’-3’方向）至一种专用于亚硫酸氢盐特异性PCR引物设计的程序中（图3). 
		注意：由于亚硫酸氢盐处理会片段化 DNA，因此难以扩增较长片段，每个亚硫酸氢盐-PCR 扩增子的最佳长度为 250–400 bp &gt;400 bp 区域。例如，若研究目标为 1 kb 的区域，可设计多对引物以覆盖该区域。为便于混合，应将扩增子设计为等长的碱基对大小。避免扩增子长度 &lt;250 bp，因为这些片段可能过短而不适合文库构建。BSAS 的理想引物长度为 &gt; 每个引物20 bp。</li>
		<li>选择一个 Tm 55-的范围65 °C 以及一个 max Tm 正向引物与反向引物之间的差异2 °C.</li>
		<li>选择最能覆盖目标区域的引物对。避免选择包含CpG位点或紧邻CpG位点的引物，以免导致PCR反应出现偏倚。使用标准PCR引物，可从多家学术或商业供应商处订购。</li>
		<li>将冻干引物用无RNase/DNase的水重悬，配制成工作浓度的储存液 100 µM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 PCR 引物保存在 -20 °C稀释 100 µM 引物储备液至 10 µM 用于PCR反应的工作液</li>
</ol>
3. 亚硫酸氢盐特异性 PCR 优化
注意：对于基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，有多种不同的商业试剂盒可供选择。请选择最适合预定实验的试剂盒或方案。
<ol>
	<li>使用 200 ng 至 2 µg 基因组DNA。对于优化实验，应进行多次转化反应，以获得足量的亚硫酸氢盐转化DNA，用于多次BS-PCR反应。</li>
	<li>使用小的（例如, 10 µl) 为维持较高的DNA浓度，使用较小的洗脱体积对亚硫酸氢盐转化后的DNA进行洗脱。 
	注意：1-2 µl 的亚硫酸氢盐转化DNA足以用于优化PCR反应 1 µg 基因组DNA用作转化输入。</li>
	<li>通过亚硫酸氢盐特异性PCR扩增亚硫酸氢盐转化的DNA。BS-PCR反应需要使用亚硫酸氢盐特异性引物 Taq 能够扩增亚硫酸氢盐转化DNA的聚合酶
	<ol>
		<li>为单个扩增子的目标扩增优化组装以下反应。对于多个样本，将反应体系组装于96孔PCR板中。 
		25 µl 2x 反应缓冲液 
		0.5 µl dNTP混合液 
		5 µl 10 µM 正向引物（终浓度 1 µM) 
		5 µl 10 µM 反向引物（终浓度 1 µM) 
		2 µl 模板亚硫酸氢盐转化DNA 
		0.4 µl (5 U/µlDNA聚合酶 
		12.1 µl 无DNA酶的水（终反应体积 50 µl)</li>
		<li>使用适当的粘性封膜或热封膜密封PCR板。</li>
		<li>将反应置于适当的PCR仪中，并使用以下循环条件，同时开启加热盖：
		<ol>
			<li>进行初始变性处理 95 °C 10 分钟。</li>
			<li>变性于 95 °C 30秒。</li>
			<li>在特定 T 下退火 30 秒m 引物所使用的退火温度。起始退火温度可略低于几度 °C T下方m 引物用于优化反应。 
			注：最佳退火温度也可通过梯度PCR仪测试一系列温度来确定。</li>
			<li>进行延伸反应 72 °C 30 秒。对于较长的扩增片段，需延长延伸时间。</li>
			<li>重复步骤 3.3.3.2–3.3.3.4，共进行 35 个循环，用于初步优化。虽然可能需要更高的循环数，但通常应避免，以防止克隆扩增导致反应产生异常产物。</li>
			<li>进行最终延伸反应 72 °C 7 分钟</li>
			<li>保持反应在 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对扩增产物进行可视化分析。或者，按照制造商的说明书使用毛细管电泳DNA芯片。
		<ol>
			<li>混合 24 µl PCR 反应的 6 µl 在冰上加入5x上样染料并涡旋混匀。</li>
			<li>通过将200 ml 5x TBE电泳缓冲液与800 ml ddH₂O混合，配制1 L 1x TBE电泳缓冲液。2O. 将DNA Marker稀释至终浓度为 0.5 µg 每孔 ddH₂O 中2O 和上样染料。</li>
			<li>加样至孔中 30 µl PCR反应或分子量标记物</li>
			<li>以200 V电压电泳约45分钟。当第一种染料前沿到达凝胶末端时，停止电泳。</li>
			<li>用染色剂对凝胶进行染色 5 µg/ml 溴化乙锭混合 5 µl 10 mg/ml，100 ml ddH₂O中2O. 覆盖整个凝胶，孵育约 5 分钟。</li>
			<li>使用紫外光箱或多功能成像仪，在482 nm激发波长下对凝胶进行成像。</li>
			<li>参照DNA分子量标准，对PCR扩增产物进行大小分析，并通过观察除预期扩增片段大小外是否存在其他条带，判断反应的特异性。图4A 和 C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在确定BS-PCR的最佳条件后，对实验样本进行BS-PCR。
		<ol>
			<li>从剩余引物及其他反应组分中纯化扩增产物。采用硅胶柱纯化、SPRI 磁珠法或凝胶回收法进行纯化与定量。</li>
			<li>洗脱扩增子 30 µl TE缓冲液</li>
			<li>使用制造商提供的方案，通过荧光测定法对扩增子进行定量。</li>
			<li>如果每个样本中存在多个扩增子，则按每单位体积等质量进行混合，并于 -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. NGS文库构建及文库质量控制
注意：BSAS NGS 文库制备采用简化的转座子介导的双端索引建库方法（文库制备试剂盒的选择详见材料列表）。该方法可实现极快速且高通量的文库构建，已在亚硫酸氢盐测序应用中得到验证，表现出极低甚至无偏倚的测序结果16,19。双端索引相比单端索引可实现更高程度的样本多重混合。其他文库制备方法可能可行，但尚未经过测试。
<ol>
	<li>从BS-PCR扩增子在96孔PCR板中制备NGS文库。将扩增子稀释至0.2 ng/µl，使最终上样量为1 ng，或取5 µl的0.2 ng/µl稀释液。使用SPRI磁珠对生成的文库进行纯化。本方案中使用50–90 µl SPRI磁珠进行文库回收。SPRI磁珠的用量取决于文库的目标片段大小以及所需测序反应的循环数。 
	注意：使用微孔板振荡器或板式涡旋振荡器重悬磁珠。
	<ol>
		<li>将文库从磁珠上洗脱，并转移至新的96孔板中，用热封膜密封后于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定文库的片段大小和浓度（图4B 和 D）。
	<ol>
		<li>按照制造商的操作说明，在毛细管电泳DNA片段分析芯片上运行文库。
		<ol>
			<li>采用高灵敏度毛细管电泳DNA检测方法，根据制造商的操作说明确定检测到的文库峰的平均片段大小，并估算其摩尔浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过qPCR对文库进行定量，使用针对所构建文库中接头序列设计的引物，并采用已知浓度的标准品进行校准。
		<ol>
			<li>在实时荧光定量PCR仪上运行qPCR反应，按照制造商的操作说明设置绝对定量程序。</li>
			<li>结合文库片段大小和qPCR获得的摩尔定量结果，计算文库的摩尔浓度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用pH 8.5的10 mM Tris-Cl缓冲液（含0.1% Tween-20）将文库稀释至4 nM。将稀释后的文库置于96孔PCR板中，用热封膜密封后于-20 °C保存。</li>
</ol>
5. 使用台式测序仪进行测序文库构建
<ol>
	<li>根据制造商说明书解冻并准备试剂。</li>
	<li>将 4 nM 文库在冰上解冻。</li>
	<li>在 1.5 ml 微量离心管中配制 1 ml 的 0.2 N NaOH 溶液。</li>
	<li>若使用多个文库，需将 4 nM 文库按等体积混合合并。</li>
	<li>根据制造商说明书将合并后的文库稀释并变性至所需的最终摩尔浓度。
	<ol>
		<li>将稀释并变性后的文库置于冰上，待准备上样至试剂盒时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成包含样本名称及相应索引信息的样本表，并设置仅生成 .fastq 文件。
	<ol>
		<li>将样本表载入测序仪相应的样本表文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将总共 600 µl 稀释并变性后的文库加入试剂盒的相应孔中。</li>
	<li>运行测序反应直至完成。</li>
</ol>
6. 甲基化定量数据分析
注意：目前有多种可用于高通量测序（NGS）数据分析的程序，包括商业软件和开源工具。各程序的具体使用方法可参见其对应的软件包说明。本方案在每一步骤中均提供通用操作说明，以及该软件包对应的具体命令。（有关本实验方案所用软件的详细信息，请参见材料列表）。
<ol>
	<li>将 .fastq.gz 文件导入适当的测序分析流程中，并保留质量值（Qscores），用于后续的读段修剪。（在此示例程序中，选择“Import”，并选择用于生成读段的测序方法。选择要导入的 .fastq.gz 读段文件，并在“General Options”下取消勾选“Discard quality scores”，以保留 .fastq 文件中的质量值用于读段修剪。选择导入读段的存储位置，然后选择“Finish”。）
	<ol>
		<li>在NGS数据分析流程中使用以下设置进行读段修剪并保留有效读段。（在此程序中，选择“NGS Core Tools”下的“Trim Sequences”，并选择要修剪的读段。）
		<ol>
			<li>仅保留包含 ≥ Q30 质量值的读段。（在此程序中，选择“Trim using quality scores”，并将阈值设为 0.001。）</li>
			<li>仅保留包含 ≤ 1 个模糊碱基的读段。（在此程序中，选择“Trim ambiguous nucleotides”，并将“maximum number of ambiguities”设为 1。选择保存修剪后读段的位置，然后选择“Finish”。）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将修剪后的读段比对至步骤 2.2 中的 in silico 亚硫酸氢盐转化基因参考序列。（在示例软件中，选择“NGS Core Tools”下的“Map Reads to Reference”，选择要进行比对的修剪后读段，然后选择“next”。选择已转化的参考序列，并在“reference masking”下选择“no masking”。然后选择“next”。）
		<ol>
			<li>为错配、插入和缺失分配最大罚分。设置参数，要求读段全长的 100% 均需比对，且序列一致性达到 90%。在示例软件中，为错配、插入和缺失分配得分为 3；为比对至参考序列的读段最小长度比例分配得分为 1；为比对读段与参考序列之间的最小一致性比例分配得分为 0.9。</li>
			<li>丢弃或忽略比对到参考序列上的非特异性读段。这些读段可能同样良好地比对到多个区域。在示例软件中，在“Non-specific match handling”下选择“Ignore”，然后选择“next”。</li>
			<li>对于比对输出，将每个样本生成为独立文件。在示例软件中，在“Output options”下选择“Create stand-alone read mappings”，在“Result handling”下选择“Save”。选择保存读段比对结果的位置，然后选择“Finish”。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对已比对的读段运行变异检测流程。在示例软件中，选择“Resequencing Analysis”下的“Probabilistic Variant Detection”，选择要分析的读段比对结果，然后选择“next”。在“Read filters”下选择“Ignore non-specific matches”，然后选择“next”。
		<ol>
			<li>通过在“Significance”下将“minimum coverage”设置为 1,000，确保目标序列的测序深度 ≥ 1000 X。</li>
			<li>确保变异在正向和反向读段中均存在。在示例软件中，在“Variant filters”下选择“Require presence in both forward and reverse strands”，然后选择“next”。</li>
			<li>将比对后并完成变异检测的数据导出为带注释的表格。在示例软件中，在“Output options”下选择“Create annotated table”，并选择保存变异表格文件的位置。选择“Finish”。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用变异表格文件中目标区域注释的 CpG 位点处的变异频率计算 5-mC 百分比。参考序列中 CG 背景下的胞嘧啶频率即为该位点的 5-mC 百分比。 
	注意：当使用变异检测算法分析高度甲基化的 CpG 位点时，需将 CpG 中的胞嘧啶替换为胸腺嘧啶。这将使比对上的胞嘧啶被识别为变异，从而获得 CpG 位点处的胞嘧啶频率。</li>
	<li>通过以下方式计算亚硫酸氢盐转化效率（bsc）：首先计算参考序列中非 CpG 位点的胞嘧啶所占百分比（C）。将非 CpG 位点的胞嘧啶百分比乘以比对到参考序列上的总胸腺嘧啶数（Tmp），再除以参考序列上对应胸腺嘧啶位置比对到的总胞嘧啶数（CmpT）。用 100 减去该频率所得结果即为该文库的亚硫酸氢盐转化效率（bsc）（公式 1）。</li>
</ol>
<img alt="BSC 公式：\(bsc = 100 - \frac{(C \times Tmp)}{CmpT}\)；数学公式与分析。" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52488/52488eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1">
公式 1. 亚硫酸氢盐转化效率。 
注意：尽管哺乳动物基因组中非 CpG 胞嘧啶甲基化的含量极低（干细胞可能例外20），但植物基因组中含有较高水平的此类甲基化。为了测定这些参考基因组中的亚硫酸氢盐转化效率，可选择对线粒体基因组或叶绿体基因组的一部分，或植物基因组中已知未甲基化的基因进行测序，并按上述方法计算转化效率21。大多数情况下，亚硫酸氢盐转化效率应≥98%，未转化的胞嘧啶（C）可能来源于非 CpG 甲基化。

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

BSAS 能够实现对大量样本和多个靶标进行高通量、聚焦且准确的 DNA 甲基化定量分析。此外，该文库构建方法采用转座子介导的标签化（tagmentation）技术，相较于传统的片段化及后续接头连接技术，所需起始 DNA 量更少、操作更快速，步骤也更少。这些对现有方法的改进使得针对任何感兴趣靶标的碱基水平 DNA 甲基化分析更加精确。更重要的是，BSAS 为通过全基因组亚硫酸氢盐测序22或捕获测序23方法鉴定出的兴趣区域（如差异甲基化区域（DMRs）、CpG 岛、调控区域）提供了一种新的验证手段。采用正交验证策略并结合更精确的定量方法，可显著提升表观基因组研究的分析严谨性。BSAS 实现的高测序深度可在较窄的置信区间内实现准确的定量结果，从而获得精确的甲基化水平定量16。此外，单次实验可同时运行多个样本，有助于增加对全基因组方法结果进行验证时的样本量，从而提高统计效能——这正是当前许多表观遗传学研究的薄弱环节。尤为重要的是，BSAS 可提供单碱基分辨率的 CpG 甲基化定量数据，有助于提出可验证的表观遗传学研究假设，例如：特定反应元件上甲基化水平升高将导致特定转录因子结合能力下降。将 BSAS 与配对的 mRNA 表达数据相结合，可在同一组织样本或细胞群体中同时获取表观遗传调控信息和 mRNA 表达水平。调控与表达的配对测量还可进一步增强研究发现的科学严谨性和影响力。
BSAS 实验方案中的关键步骤包括引物设计、扩增子优化以及文库构建与质控。如果引物设计不当，导致扩增效率不同，则会引入 PCR 偏倚8。使用甲基化标准品（例如通过酶法生成的 100% 和 0% 胞嘧啶甲基化标准品）可用于评估甲基化定量是否存在偏倚及其程度，这是甲基化定量分析中恰当的方法学对照16。同样，在优化 PCR 反应以生成单一高质量扩增子时也应谨慎操作。若按照本实验方案中详述的建议条件未能获得扩增产物，可采取的优化措施包括增加 PCR 循环次数或增加 bsDNA 的投入量。若出现多个 PCR 产物（包括引物二聚体），则优化措施可包括减少 bsDNA 投入量、降低 PCR 引物的摩尔投入浓度、提高退火温度或减少 PCR 循环次数。采用其中一种或多种组合的优化策略通常足以获得单一高质量扩增子。另外，对于无法产生单一扩增子的引物组合，重新设计引物是一种有效的解决方法。对于不适合或无法重新设计引物的区域，可尝试使用简并引物，即在正向引物的 CpG 位点处包含胞嘧啶和胸腺嘧啶，在反向引物的 CpG 位点处包含腺嘌呤和鸟嘌呤。然而，这类简并引物需要进一步优化，以确保不产生 PCR 偏倚，该过程超出了本实验方案的范围。高质量的文库对实验成功至关重要。在测序前必须进行质控检测，以确认文库的大小、质量和数量。低质量文库容易导致测序反应失败。通过确保 CpG 位点的甲基化频率在正向和反向测序读长中均有体现，可减轻甲基化定量中的偏倚。此外，对应于 CpG 位点的碱基质量分数应不低于 Q30，以保证定量结果的高可信度。尽管已有研究先前表明，经亚硫酸氢盐转化的 DNA 在标签化（tagmentation）反应中几乎不存在或仅有轻微偏倚19，但确保上述各项指标仍有助于验证甲基化定量过程中的低偏倚特性。
BSAS 目前可检测 CpG 位点的甲基化水平，但该方法未来将进一步扩展，通过增加区分 5-mC 与 5-hmC 的实验步骤（例如在亚硫酸氢盐转化前引入高钌酸钾），实现 CpG 位点 5-hmC 的配对检测24。这将提升 BSAS 的应用价值，使其能够同时获得配对的 5-mC 和 5-hmC 甲基化数据以及基因表达数据，从而确定 DNA 甲基化在基因表达调控中的作用。通过转座子介导的文库构建方法制备 PCR 扩增子，会导致扩增区域末端的测序深度有所下降。因此，高关注区域应设计在扩增子的中间位置。然而，由于 BSAS 产生的测序深度可达 &#62;1,000 X，即使在扩增区域末端，5-mC 测量的定量准确性仍然很高。

自首次报道以胞嘧啶甲基化形式存在的天然DNA修饰以来，已超过半个世纪1胞嘧啶甲基化是一种修饰的胞嘧啶核苷酸碱基，其中5位碳原子上添加了甲基th 碱基环上的碳原子连接一个甲基基团（5-甲基胞嘧啶，5-mC），在哺乳动物基因组中主要出现在CpG二核苷酸序列中。基因启动子区域存在5-mC通常与转录抑制相关，而其缺失则与转录活性相关。2.
近年来，我们在理解DNA甲基化在发育3、表观遗传谱式的跨代传递4、癌症发病机制5,6以及多个其他研究领域中的作用方面取得了巨大进展。这些进展大多出现在过去几年中，得益于新开发的DNA甲基化谱型分析方法7。随着新一代测序（NGS）技术的出现和普及，目前已有多项方法可用于全基因组或基因组大片区域的DNA甲基化谱型分析8。这些方法为发现性研究提供了可能，能够量化DNA甲基化模式及其差异。除了这些用于生成假设的方法外，对靶向性/假设验证型的DNA甲基化定量方法也存在重大需求。
焦磷酸测序、甲基化特异性 PCR 和对亚硫酸氢盐转化 DNA 的直接 Sanger 测序是分析特定区域（例如，单个基因的启动子区域或 CpG 岛）最常用的方法9-12。这些方法均依赖于亚硫酸氢盐转化，这是一种化学脱氨反应，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变13,14。对亚硫酸氢盐转化后的 DNA 进行 PCR 扩增会将尿嘧啶替换为胸腺嘧啶15，从而使不同的甲基化状态表现为碱基差异，便于检测。尽管这些方法非常有用，但其局限性包括定量准确性较低、读长较短以及样本通量不高。为克服这些局限性，我们开发了一种称为亚硫酸氢盐扩增子测序（Bisulfite Amplicon Sequencing, BSAS）的方法16。该方法的目标是能够在大量样本中以高定量准确性分析感兴趣的靶向基因组区域。
BSAS 采用现有方法的多个要素（亚硫酸氢盐转化和区域特异性 PCR 扩增），并将其与简单的下一代测序文库构建（转座子介导）17 和台式 NGS18（图 1）相结合。该方法可更定量且高通量地检测任意目标区域的胞嘧啶甲基化状态。本文详细介绍了该方法，并描述了 BSAS 流程的故障排除和质量控制策略。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR 纯化试剂</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech 96 孔 PCR 板&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>半裙边</td></tr><tr><td>热封膜</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>热封箔</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>热封仪</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1–10 &amp;#956;l 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2–200 &amp;#956;l 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50–1,000 &amp;#956;l 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT DNA 样本制备试剂盒&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 次反应</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index 试剂盒&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 个索引</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq 桌面测序仪&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq 试剂盒 v2&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 个循环</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal qPCR 试剂盒</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96 孔 PCR 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA 凝胶</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10 孔</td></tr><tr><td>Novex TBE 电泳缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex 高密度 TBE 上样缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml 溴化乙锭</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT 快速实时 PCR 系统</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384 孔模块</td></tr><tr><td>DynaMag-96 侧裙板磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>甲基化分析流程软件</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 次反应</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 孔全裙边标准板</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR 密封膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 甲基化-Lightning 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 次反应</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA 聚合酶</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 次反应</td></tr></tbody></table>

通过下一代测序进行靶向dna甲基化分析

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

表观遗传过程在基因表达调控中的作用已为人所知多年。胞嘧啶残基的DNA甲基化在表观遗传研究中尤为引人关注，因其已被证实既是持久性的又是动态的基因表达调控因子。由于缺乏高通量且定量准确的方法，对健康与疾病状态下表观遗传变化的研究进展一直受到限制。随着下一代测序（NGS）技术的发展与普及，这些工具现已被应用于表观基因组学研究，与现有的基因组学和转录组学方法并行使用。针对那些已确定感兴趣区域（如特定基因启动子或CpG岛）并需要以高定量准确性检测大量样本的胞嘧啶甲基化表观遗传研究，我们开发了一种名为亚硫酸氢盐扩增子测序（Bisulfite Amplicon Sequencing, BSAS）的方法。该方法结合了亚硫酸氢盐转化、靶向扩增感兴趣区域、转座子介导的文库构建以及台式NGS技术。BSAS为一次最多96个样本中多达10 kb靶向区域的分析提供了一种快速高效的方案，大多数具备基础分子生物学技能的研究团队均可实施。该方法可提供具有单碱基特异性的胞嘧啶甲基化绝对定量结果。BSAS可应用于来自任何DNA来源的任何基因组区域。该方法适用于对感兴趣靶区域进行假设验证研究，也可用于验证全基因组甲基化分析（如全基因组亚硫酸氢盐测序、简化代表亚硫酸氢盐测序和甲基化DNA免疫沉淀测序）中所鉴定出的区域。

BSAS 读段正确比对到转化后的参考序列时，结果将如图5所示。通过观察比对读段中 CpG 位点的碱基检出情况，可清晰识别 CpG 二核苷酸并估计其甲基化状态。例如，在甲基化对照样本中，0% 甲基化将导致所有比对到 CpG 位点的读段均含有 T（图5A）；而 100% 甲基化对照则会使所有比对到 CpG 位点的读段均含有 C（图5B）。
CpG位点处胞嘧啶频率（C/C+T）的定量可反映原始样本中的甲基化频率。由全基因组甲基化对照品生成的代表性标准曲线（n = 3/甲基化比例）显示了各甲基化比例下甲基化定量的线性关系及定量的精密度图6）。作为该方法的示例，从 小鼠小脑和视网膜（每组 n=4）中共同分离了 RNA 和 DNA。通过 qPCR 检测视网膜组织中特异性表达的视紫红质表达。仅在视网膜中检测到表达（图7A）。利用BSAS法对视紫红质启动子区域的CpG甲基化水平进行定量。启动子区域内的累积甲基化水平 &gt;小脑中的80%相比 &lt;视网膜中为15%（p &lt; 0.001，参数t检验）（图 7B）。BSAS甲基化定量可从位点特异性甲基化定量中获益，且可在任意给定基因组区域内以CpG位点特异性为基础进行甲基化水平的比较。视紫红质启动子区域的CpG甲基化水平在小脑样本中显著高于视网膜样本（p &lt;0.001，每个CpG位点进行参数t检验）(图7C).
<img alt="亚硫酸氢盐测序示意图；基因组DNA转化以分析甲基化。PCR，标签化步骤。" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：BSAS方法示意图。 在该方法中，基因组DNA经过亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶。随后在PCR过程中，这些尿嘧啶被转变为胸腺嘧啶。PCR扩增针对目标区域进行，并高度富集这些特定序列。所得PCR扩增子通过简单的标签化（tagmentation）过程构建成双索引文库。随后，文库在台式下一代测序仪上进行测序，测序读长被比对至in silico转化的参考序列，并以单碱基分辨率确定胞嘧啶的甲基化百分比。
<img alt="染色体区域示意图；DNA序列分析；非CpG转化为T；遗传定位。" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：in silico 亚硫酸氢盐转化目标区域。 可从任意基因组参考序列中选择目标区域进行in silico亚硫酸氢盐转化。参考序列中的非CpG胞嘧啶被替换为胸腺嘧啶。CpG胞嘧啶在亚硫酸氢盐转化后的参考序列中仍保留为胞嘧啶。
<img alt="DNA测序引物设计示意图，显示在CpG位点处的良好与不良引物放置位置。" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3：引物放置。 亚硫酸氢盐PCR引物是针对in silico亚硫酸氢盐转化的参考序列设计的。引物设计时应避免与CG二核苷酸重叠，或紧邻CG二核苷酸设计。
<img alt="电泳结果与色谱图，显示DNA片段按碱基对（bp）分离。" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：高质量与低质量PCR扩增子及测序文库的示例。 典型的毛细管电泳图谱与凝胶图像显示：(A) 适用于转座子介导文库构建的理想扩增子，表现为单一高浓度产物；(B) 由此扩增子构建的文库具有高浓度且片段大小分布均匀；(C) 低质量的PCR扩增子可能片段小、浓度低，并含有多个产物和/或引物二聚体；此类低质量扩增子将导致 (D) 文库构建失败，表现为浓度低且片段大小分布不均。
<img alt="DNA测序比对，以图表形式显示参考序列比对和测序深度分析。" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5：甲基化对照测序结果示例。（A） in silico 转化后的参考序列，其中CpG位点以红色标出。0%甲基化对照的测序读段比对至选定区域，在CpG位点处显示胸腺嘧啶（绿色高亮）。（B） 100%甲基化对照的比对读段在CpG位点处显示胞嘧啶（蓝色高亮）。
<img alt="5-mC 百分比相关性图、示意图、甲基化分析、数据拟合、表观遗传学研究" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6：在不同甲基化对照样本中的甲基化定量结果。 使用 BSAS 对甲基化比例（n = 3/比例）从 0% 到 100% 的全基因组甲基化对照混合样本进行定量。通过绘制预期值与实测值的定量关系图，显示甲基化对照定量具有良好的线性关系。在所有对照样本中，甲基化定量均表现出高精确度。
<img alt="视紫红质基因表达与甲基化分析；小脑和视网膜中表达与5-mC的箱线图" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7：组织样本中配对的DNA甲基化与基因表达分析示例。（A） 小鼠小脑和视网膜组织中视紫红质（Rhodopsin）的相对mRNA表达水平。（B） 通过BSAS方法在小脑和视网膜DNA之间定量的视紫红质启动子区平均甲基化水平（***p &lt;0.001，参数t检验）。（C） 小鼠小脑和视网膜DNA中视紫红质启动子区域（-244至+6，相对于转录起始位点[TSS]）各CpG位点特异性的甲基化水平。

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

表观遗传过程在基因表达调控中的作用已为人所知多年。胞嘧啶残基上的DNA甲基化是……

本实验的总体目标是从感兴趣的组织或细胞中分离出的基因组DNA中，对特定目标区域的CpG甲基化水平进行定量分析。该目标首先通过设计亚硫酸氢盐特异性PCR引物来实现，这些引物用于扩增经亚硫酸氢盐转化的基因组DNA中的目标区域。在第二步中，对经亚硫酸氢盐转化的目标区域进行扩增，并利用扩增产物构建下一代测序（NGS）文库。接下来，对文库进行测序并生成用于分析的FASTQ文件。最后一步中，将测序读段比对至经亚硫酸氢盐转化的参考靶序列，并最终通过亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）精确且准确地计算5mC百分比，从而可对任意模式生物中任何感兴趣区域的CpG甲基化进行精确定量。与Sanger测序等现有方法相比，该技术的主要优势在于，BSAS能够以快速、高通量的方式实现准确且精确的CpG甲基化定量，从而可在大量样本中同时检测多个区域。在确定目标并设计引物后，构建用于单一条带扩增优化的反应体系，然后使用热封膜密封PCR板，通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。接下来，向合适的加样孔中加入30微升PCR反应产物或DNA分子量标记物，然后在200伏电压下电泳约45分钟。当第一条染料迁移至凝胶末端时，停止电泳反应，随后将凝胶完全浸入含有5微克/毫升新配制的AUM溴化物溶液中。五分钟后，使用紫外透射仪在482纳米激发波长下对凝胶成像。利用DNA分子量标记（ladder）对PCR扩增子进行大小测定，以确定反应的特异性。观察除预期扩增子大小以外的多条条带，以确定检测到的文库峰的平均大小，并估算其摩尔浓度。接下来，根据制造商说明书，使用高灵敏度DNA检测试剂盒在毛细管电泳DNA片段分析芯片上进行文库检测。通过QPCR对文库进行定量，采用针对文库中接头序列设计的引物，并使用已知浓度的标准品在实时定量仪器上进行检测，按照制造商说明书设置绝对定量程序。然后根据文库的大小以及QPCR测定的摩尔浓度，计算文库的摩尔浓度。测序完成后，将压缩的fastQ文件导入相应的测序分析流程，选择“导入”，然后选择用于生成测序读段的测序方法，以保留读段修剪应用所需的Q值。导入相应的压缩fastQ读段文件，然后在常规选项中，取消勾选“丢弃质量分数”。选择导入读段的位置，然后单击完成。接着在 NGS 核心工具下选择修剪序列。选中需要修剪的读段，仅保留质量值大于或等于 Q 30 的读段。然后根据质量分数选择修剪，并将阈值设为 0.001。进一步筛选仅包含少于或等于一个模糊核苷酸的序列。选择修剪模糊核苷酸，并将最大模糊数设置为 1。然后选择一个位置以保存经修剪的序列读段，单击“完成”以将经修剪的读段比对至通过体外化学法亚硫酸盐转化的基因参考序列。在 NGS 核心工具中，选择“比对读段”。在参考序列选项中，选择待比对的经修剪读段，然后单击“下一步”。然后在参考序列屏蔽选项中，选择已转换的参考序列，并选择不进行屏蔽。单击“下一步”，随后为错配、插入和缺失分别赋予得分为3。将读段长度比对到参考序列的最小比例分数设为1，将比对读段与参考序列之间最小一致性比例分数设为0.9。在非特异性匹配处理中选择“忽略”，然后在输出选项中单击“下一步”。接下来，选择“创建独立的读段比对”。然后在结果处理下，点击“保存”。选择一个位置来保存读段比对结果，然后点击“完成”，以对已比对的读段执行变异检测。在重测序分析中，选择低频变异检测，并选择要分析的读段比对结果。单击下一步，然后在低频变异参数设置中输入 0.01%，再单击下一步。在通用过滤条件中，将最小覆盖深度设置为 1000，以确保序列的测序深度大于或等于 1000 ×。最后，单击“下一步”，然后在输出选项下选择“创建注释表格”，并选择保存变异表格文件的位置，单击“完成”，并使用变异表格文件中目标区域注释的 CPG 位点处的变异频率，来计算参考胞嘧啶在 CG 背景下的胞嘧啶甲基化频率。通过亚硫酸盐扩增子测序读段，这些读段已正确比对至转化后的参考序列，其模式如图所示。CPG 二核苷酸可被清晰识别，通过观察 CPG 位点处的碱基识别结果可估计甲基化状态。在比对上的读段中，0% 甲基化将导致在 CPG 位点处比对到胸腺嘧啶（T）的读段。100%甲基化对照将产生包含映射至CPG位点的胞嘧啶的比对读段。在本实验中，从小鼠的小脑和视网膜组织中共同分离了RNA和DNA。随后通过qPCR检测视网膜组织中特异性表达的视蛋白表达水平，结果符合预期。通过亚硫酸氢盐扩增测序对视蛋白启动子区域的CpG甲基化水平进行定量后，仅在视网膜中检测到视蛋白RNA的表达。然而，在小脑中，启动子区域的累积甲基化水平超过80%，而在视网膜中则低于15%。BAS甲基化定量技术具有位点特异性甲基化定量的优势，可在给定的基因组区域内以单个CpG为单位比较甲基化水平。事实上，在本实验中，与视网膜样本相比，小脑样本中视蛋白启动子区域的CpG甲基化水平显著更高。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对从组织或细胞中分离的基因组DNA中特定目标区域的CpG甲基化水平进行定量分析。

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骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

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DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

学习使用亚硫酸氢盐扩增子测序技术对目标基因组区域进行DNA甲基化定量分析。该方法结合PCR扩增与新一代测序技术，可精确检测CpG位点甲基化水平，适用于多种模式生物的表观遗传学研究。

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

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