在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

本实验的总体目标是演示如何在支撑脂质双层上成功捕获自然杀伤细胞（NK细胞）免疫突触的超分辨率图像。该目标通过在腔室载玻片中构建含有抗NK细胞活化受体CD16抗体的玻璃支撑平面脂质双层来实现。随后将先前分离的NK细胞加入该平面脂质双层中，再使用F-肌动蛋白（f actin）和穿孔素对细胞进行染色。

最后一步是使用 STEAD 显微镜对形成的 NK 细胞突触进行成像，最终实现对支撑脂双层上 NK 细胞突触的成像。STEAD 技术能够以增强的细节显示 NK 细胞突触，从而可视化肌动蛋白细胞骨架的超微结构以及位于低 F-肌动蛋白密度区域上方的 perforin 阳性溶细胞颗粒。该技术的主要优势在于，玻璃支撑的平面脂质屏障可以模拟靶细胞的质膜，以及该平面脂质屏障上的蛋白质分布。

它们能够进行侧向移动，从而更真实地模拟免疫突触的形成过程。这一技术有助于解答免疫学领域的关键科学问题，使研究人员能够以可控且详细的方式观察突触的形成，这是目前商用显微镜技术所无法实现的。一名博士后研究员和一名研究生将演示组装玻璃支撑的平面脂双层的实验步骤。

首先，在烧杯中将30%过氧化氢与硫酸按1:3的比例混合，配制100毫升的piranha溶液。将两片矩形1.5号盖玻片放入该溶液中，浸泡20至30分钟以进行清洗。同时，取出一管先前配制好的400 µM DOPC脂质和一管先前配制好的80 µM生物素化PE脂质。

将新离心管用氩气脱氧后，置于冰上并转移至氩气罐中。按1:1比例混合DOPC和生物素化PE。具体体积根据实验需求而定，但至少应为2 µL。

每次使用后，需对混合管及各个试剂管进行脱氧处理，然后将梯度管放回冰箱。清洁完成后，用蒸馏水彻底冲洗盖玻片。将盖玻片取出，静置空气中干燥数分钟，随后吸取1.5 µL脂质体混合物，以单滴形式加入玻片腔室中任一通道腔内。

每泳道使用两滴样品是常规做法，但并非必需。现在，迅速而高效地将干燥的盖玻片覆盖在液滴上，确保液滴之间留有足够间距，以免盖玻片压下后液滴相互融合。此外，需确保液滴保持圆形且轮廓清晰，不与腔室壁的边缘接触。

用力按压每个泳道之间及周围区域，确保盖子之间形成严密的防水密封。使用记号笔标记液滴的位置。然后向腔室中通入100微升5%的水相casing溶液，以封闭双层膜。

尽量确保流室中无气泡。然后向每条通道注入100微升浓度为333纳克/毫升的链霉亲和素。在室温下孵育10至15分钟后，用含有1%人血清白蛋白的3毫升HEPES缓冲盐水冲洗每条通道。

为去除过量的Tritin，加入100 µL生物素标记的荧光标记抗CD16抗体，其蛋白浓度按照文本方案中先前确定的浓度配制，并在避光条件下孵育20至30分钟。随后用3 mL含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水冲洗每条通道，再次洗涤。然后将浓度为25 nmol/L的D-生物素溶液100 µL流经反应室，以结合任何过量的链霉亲和素（STR avidin），从而消除链霉亲和素非特异性结合细胞的可能性。

随后计数人NK细胞，并用含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水将其重悬，浓度为每毫升50万个细胞。每道加入三毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水，洗涤除去腔室中的D-生物素。待细胞重悬至所需浓度后，向每道加入100微升。

将培养 chamber 置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 至 20 分钟。通过向每条通道中加入三毫升磷酸盐缓冲液清洗，以去除多聚甲醛。

然后加入 400 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。接着，加入 2 µL 稀释的荧光标记鬼笔环肽（Phin）和荧光标记的抗穿孔素（perforin）单克隆抗体，室温孵育 1 小时，随后通过向腔室中注入 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。此时腔室已准备好进行成像。

开启稳态显微镜的所有必要硬件模块。启动图像分析软件，并启用共振扫描和稳态模块。完成这些设置后，等待约三到五分钟，使软件完成初始化。

点击屏幕顶部的配置选项卡，选择激光配置。然后打开白光和稳态592纳米激光器。选择100倍物镜，并将592纳米耗尽激光与激发激光束对准。

选择激光配置模块，关闭592耗尽激光，打开660纳米耗尽激光。将载玻片放置在物镜上方的载物台上。使用白光灯和目镜，将结合在划定双层区域上的细胞调至焦点。

然后返回配置选项卡右侧的采集选项卡。单击切换至白光选项卡，开启该模块，并将激发激光线拖动至适当的波长。选择所需的探测器并设置检测范围后，单击左侧采集工具栏中的“连续”按钮，以在左侧工具栏底部弹出连续扫描对话框。

这允许用户为不同颜色分别添加多个序列，每个序列对应不同的激发光源。在各帧之间点击，然后为每种额外的颜色设置激发频率探测器和检测范围。当所有设置优化完成后，点击“开始”以启动采集过程。

在玻璃支撑的平面脂双层上，自然杀伤细胞突触的三色稳态图像显示，红色所示的抗 CD16 抗体在脂双层上聚集，触发 F 肌动蛋白的形成，以及穿孔素（蓝色所示）在焦点平面上穿过 F 肌动蛋白网格的极化与穿透。通过这种联合方法，可以清晰地观察到玻璃支撑脂双层中荧光标记的抗 CD16 微簇，其直接反映了 NK 细胞上 CD16 的聚集情况。与传统的共聚焦图像相比，由于背景荧光被有效消除，稳态图像中 CD16 中心簇的环状结构更易于识别。

此外，肌动蛋白细胞骨架的超微结构得以显著提高的分辨率呈现。与先前的观察结果一致，perin 阳性的溶细胞性颗粒位于 F 肌动蛋白密度较低的区域。在 STED 图像中，这一关键细节在共聚焦图像中大多丢失。一旦掌握，若操作得当，完成该技术大约需要四小时。

需要记住的是，在组装样品腔室时，应通过反复用氩气置换氧气来保持样品的无氧状态，并迅速将盖玻片盖在样品上，然后将其浸入外壳溶液中。