Name: 的自然杀伤细胞免疫突触上的玻璃支承平面脂双层超分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习使用玻璃支撑平面脂双层结合STED超分辨率显微镜技术对自然杀伤细胞免疫突触进行成像的方法。该技术可清晰显示肌动蛋白细胞骨架和穿孔素颗粒的精细结构，为免疫学研究提供高分辨率的可视化工具。

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感谢 Emily Mace 和 Malini Mukherjee 在成像和去卷积分析方面的帮助。刘实验室的工作部分得到了美国国家过敏与传染病研究所贝勒大学-休斯顿大学艾滋病研究中心核心支持基金（编号 AI36211）、Caroline Wiess Law 分子医学研究基金、德克萨斯儿童医院儿科研究启动基金，以及贝勒医学院与卫理公会研究医院淋巴瘤 SPORE 发展研究计划的资助。

1. 脂质体的制备
<ol>
	<li>计算所需氯仿悬浮的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-帽-生物素（Biotin-PE）储备液的用量，以配制所需终浓度的稀释储备液。若需分别配制终浓度为400 μM DOPC和80 μM Biotin-PE的磷脂溶液各10 ml，则分别取629 μl 10 mg/ml DOPC溶液和88 μl 10 mg/ml Biotin-PE溶液，置于不同的玻璃色谱管中。 
	注意：必须使用清洗液（1 L）清洁玻璃制的汉密尔顿注射器和玻璃制色谱管&#160;将95%乙醇加入含60 g氢氧化钾（KOH）的120 ml水中，同时转移溶于氯仿的DOPC和Biotin-PE储备溶液。</li>
	<li>在通风橱中用氩气流干燥氯仿。用封口膜密封色谱柱。</li>
	<li>将新制备的干燥脂质体置于冻干机中，在高真空条件下过夜，以去除任何残留的氯仿。若需在同一天内完成，则干燥60–90分钟。</li>
	<li>在冻干机运行的同时，配制一些稀释缓冲液。本实验方案中，配制25 ml缓冲液，包含25 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl以及2%（质量分数）的正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）去垢剂。先将前两种成分混合，然后在加入干燥的OG粉末前用氩气置换氧气。配制完成后，使用0.2微米醋酸纤维素膜过滤OG溶液，并于4°C保存。</li>
	<li>此外，准备两个1 L的螺口瓶，装入相同浓度但不含OG的Tris-盐水缓冲液。在每个瓶底部放入一个经蒸馏水清洗的磁力搅拌子。另准备6 L Tris-盐水缓冲液。用氩气去除所有瓶中的氧气，并将这些瓶子一同置于4°C环境中。</li>
	<li>冻干后，将干燥的脂质溶解于Tris-盐水OG缓冲液中，配制成每种4 mM的溶液。按照示例体积，向DOPC管中加入2 ml，向Biotin-PE管中加入0.2 ml。</li>
	<li>将生物素-PE脂质与DOPC脂质混合。这可以提高支撑脂双层（SLB）的流动性，因为偶联的生物素可能影响磷酸头部基团的流动性。为制备终浓度为80 μM的生物素-PE溶液，取0.2 ml的4 mM生物素-PE与1 ml的4 mM DOPC混合，然后加入8.8 ml Tris-盐水OG缓冲液。</li>
	<li>要获得终浓度为400 μM的DOPC，只需将1 ml的4 mM DOPC与9 ml Tris-盐水OG混合即可。</li>
	<li>将超声波破碎仪中装入冰水。使用通用夹具将装有稀释磷脂的玻璃管固定在超声波破碎仪中央。对稀释的磷脂超声处理10分钟，直至溶液变为澄清。 
	注意：由于超声处理会产生热量，需在超声仪水浴中加入冰块以保持较低温度。</li>
	<li>用氩气填充试管，以置换液面上方空气中的氧气，并用封口膜密封。</li>
</ol>
2. 脂质体的透析
<ol>
	<li>从卷装中截取两段适当长度（本示例中为40 cm）的干燥透析袋（分子量截留值：12–14,000，直径：6.4 mm），每种磷脂稀释液各用一段。</li>
	<li>将管段放入玻璃烧杯中，加入200 ml蒸馏水浸泡2分钟以使其水化。</li>
	<li>高火微波加热5分钟，或至少加热至水沸腾。</li>
	<li>在每根管子的一端打结，并用数毫升 Tris-盐水-OG 缓冲液冲洗管内。随后仔细挤出尽可能多的洗涤缓冲液，以尽量减少管内残留的缓冲液量。</li>
	<li>在超净工作台中，将稀释后的磷脂加入各试管中，并用小型透析管夹夹住开口端，以完全排除空气。为彻底排除空气，需在“水线”以下夹闭，从而牺牲少量样品体积。</li>
	<li>将样品浸入先前准备好的不含OG的Tris-盐水缓冲液瓶中。在重新密封前，用氩气置换瓶中的氧气，并于4°下搅拌过夜。</li>
	<li>每12小时将管子转移至一瓶新的不含OG的Tris-盐水缓冲液中，至少重复3次。</li>
	<li>在取出透析后的脂质前不久，准备若干小管用于分装脂质，每管先充入氩气以置换氧气。</li>
	<li>36小时后，将透析瓶放入超净工作台，从瓶中取出透析管。准备吸水纸或烧杯以收集渗出的液体。</li>
	<li>剪断夹子上方的透析管，然后取下夹子，小心转移透析后的脂质溶液 通过 将溶液分装至预置于冰上并充有氩气的预处理试管中，每管1 ml。</li>
	<li>分装水相脂质体溶液，用氩气流再次置换每支试管中的氧气。</li>
	<li>将脂质体储存于 4°。切勿冷冻。</li>
</ol>
3. 脂质双层膜上抗体密度的测定
<ol>
	<li>准备一系列稀释的生物素化荧光标记抗体，每种稀释液的体积为 50 μl，浓度分别为：0 nM（空白）、10 nM、50 nM、100 nM 和 500 nM。（以下称为“样品系列”）。</li>
	<li>将 1 μl 二氧化硅微珠加入 96 孔 V 型底板的 6 个孔中。加样前务必充分振荡混匀微珠，因其容易沉降。 
	注意：若使用的是干燥微珠而非悬浮液，请按照制造商说明进行稀释。</li>
	<li>向各孔中的微珠中加入 2 μl 混合的 DOPC:生物素化磷脂（1:1 比例）。对每个孔均执行此操作。</li>
	<li>将板在涡旋振荡器上以中等强度脉冲振荡 3 次，每次 10 秒，以促进微珠与磷脂之间的相互作用。</li>
	<li>向每孔中加入 150 μl 5% 脱脂乳（casein）。通过上下吹打 3 次充分混匀。</li>
	<li>将板在脱脂乳溶液中孵育 10 分钟，然后进行洗涤。洗涤时，用含 1% 人血清白蛋白（HSA）的 HEPES 缓冲盐水（HBS）将每孔补至总体积 250 μl。以 1,000 × g 离心 2 分钟。吸弃上清液顶部 200 μl，重复洗涤两次，共完成三次洗涤循环。</li>
	<li>向每孔中加入 50 μl 浓度为 333 ng/ml 的链霉亲和素。再次将板脉冲振荡 3 次，每次 10 秒，并在摇床上孵育 15 分钟。按步骤 6 的方法洗涤 3 次，以去除未结合的链霉亲和素。</li>
	<li>向每孔中加入 50 μl 前一步骤制备的荧光标记生物素化抗体稀释液（见步骤 3.1），并将板放回摇床孵育 20–30 分钟。按步骤 6 的方法洗涤 3 次，以去除未结合的抗体。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将微珠重悬于 100 μl HBS/1% HSA 中，然后转移至流式管中。重复此操作两次，以确保微珠完全从孔中回收，总体积为 300 μl，每个孔均需如此操作。</li>
	<li>将所得样品管送至流式细胞仪，准备检测。</li>
	<li>从荧光强度校准（FIC）微珠试剂盒中标记为“B”的瓶子中取 1 滴，加入流式管中，并用 300 μl HBS/1% HSA 稀释。（以下称为“标准系列”）</li>
	<li>先检测该管，但暂不记录数据。首先确保空白微珠的信号已正确归零。绘制微珠在相应通道中荧光信号的直方图，然后逐步降低激发激光电压，直至峰位于直方图最左侧。</li>
	<li>取出该管，再向其中依次加入系列中其余 4 管（标记为 1 至 4）各 1 滴。将该管再次放入仪器中，记录所得数据，应呈现 5 个明显分离的峰。</li>
	<li>依次检测样品系列中的每一根单独的样品管。</li>
	<li>使用流式分析软件，在标准系列直方图中每个峰的半高宽处绘制门控区域，每个峰对应一个门。对每个样品也进行相同操作。记录每个门对应的 MFI（平均荧光强度）值。</li>
	<li>在电子表格程序中，将测得的 MFI 值填入相应位置。同时输入标准系列中各瓶对应的 MESF（可溶性荧光染料等效分子数）值（即每颗微珠表面包被的荧光分子平均数量）。该信息可通过查看微珠包装瓶上的说明获取。</li>
	<li>电子表格将根据 MFI 与 MESF 值绘制曲线，建立荧光分子数量与检测信号强度之间的线性关系。</li>
	<li>使用微量分光光度计的“蛋白质与标记物”（proteins &amp;#38; labels）模块，测定标记抗体的染料-蛋白质比值。</li>
	<li>输入样品蛋白的标记效率、脂质包被微珠的平均直径以及每组样品的 MFI 值。电子表格将自动利用步骤 3.16 生成的线性图公式，计算每种蛋白稀释浓度下的 MESF 值及样品蛋白在各浓度下的包被密度。</li>
</ol>
4. 分离与培养人自然杀伤细胞
<ol>
	<li>取15 ml外周血或血沉棕黄层，加入50 ml锥形管中。用含1%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1比例稀释血液。</li>
	<li>使用10 ml移液管，将13 ml Ficoll液轻柔加入管底。</li>
	<li>以1,200 × g离心20分钟，离心时关闭加速器和制动器，或将其设为最低档。</li>
	<li>离心后，使用移液管收集上层漂浮的乳白色中间层——即外周血单个核细胞（PBMCs），该层位于上部澄清的黄色液体与下部较浑浊的浅色液体之间的界面处，而这两层均位于最底部红细胞（RBCs）层之上。注意：收集PBMCs时切勿混入红细胞。</li>
	<li>将收集的PBMCs转移至新的50 ml锥形管中，用含1% FBS的PBS补足体积并混匀。再次离心，此次将加速器和制动器调至最大，300 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于10 ml含1% FBS的PBS中。</li>
	<li>在与步骤4.6相同条件下再次离心的同时，对细胞进行计数。</li>
	<li>再次弃去上清液，将细胞重悬于R10培养基中，调整细胞密度至1000万个细胞/ml。</li>
	<li>取3000万个细胞置于5 ml聚苯乙烯管中，按照生产商说明书使用磁珠分选试剂盒分离自然杀伤（NK）细胞。分离完成后，再次计数细胞，并将其重悬于完全R10培养基（88% RPMI；10% FBS；1% HEPES；1%丙酮酸钠）中，调整细胞密度为50万个细胞/ml，同时添加IL-2（100 U/ml）。在37°C、CO2培养箱中培养，每周更换培养基2–3次。</li>
</ol>
5. 组装玻璃支撑的平面脂双层
<ol>
	<li>在烧杯中按1:3的比例混合30%过氧化氢与硫酸，配制100 ml piranha溶液。 
	注意：操作硫酸等有毒试剂时，务必在指定的化学通风橱内进行。</li>
	<li>将两片矩形#1.5盖玻片浸入该溶液中，处理20-30分钟。 
	注意：使用piranha溶液清洗盖玻片至关重要。</li>
	<li>在清洗盖玻片的同时，取1管预先配制的400 μM DOPC脂质和1管预先配制的80 μM Biotin-PE脂质，置于冰上运送至氩气钢瓶处。</li>
	<li>用氩气置换新微型离心管中的氧气，然后按1:1比例加入DOPC和Biotin-PE。具体体积根据实验需求而定，但每种至少应取2 μl&#160;。加样后再次用氩气置换混合液管及各试剂管中的氧气，随后将试剂管放回冰箱。</li>
	<li>清洗完成后，用蒸馏水彻底冲洗盖玻片，并将其置于空气中晾干数分钟。</li>
	<li>吸取第5.4步制备的脂质体混合液1.5 μl，以单滴形式加入载玻片的某一通道腔室中。每个通道使用两滴较为常见，但非必需。</li>
	<li>迅速而高效地将干燥的盖玻片覆盖于液滴上方。确保各液滴间距足够，避免盖玻片压下后液滴融合。同时确保液滴保持圆形且轮廓清晰，不接触腔室壁边缘。在各通道之间及周围均匀施压，确保盖玻片与载玻片之间形成严密的防水密封。</li>
	<li>使用记号笔标记液滴的位置</li>
	<li>向腔室中通入100 μl含5%酪蛋白的水溶液，以封闭双层膜。操作时应尽量避免流动腔室内产生气泡。</li>
	<li>向每个通道注入100 μl浓度为333 ng/ml的链霉亲和素溶液，在室温下孵育10-15 min&#160;。随后，每个通道通入3 ml HBS/1% HSA溶液进行洗涤，以去除未结合的链霉亲和素。</li>
	<li>加入100 μl生物素化荧光标记的抗CD16抗体（如Alexa Fluor 568），其蛋白浓度应为第3节中确定的最佳浓度。避光孵育20-30分钟。再次向每个通道通入3 ml HBS/1% HSA溶液进行洗涤。</li>
	<li>向腔室中通入100 μl浓度为25 nM的D-生物素溶液，以结合残留的游离链霉亲和素，从而消除链霉亲和素与细胞非特异性结合的可能性。</li>
	<li>计数NK细胞，并以HBS/1% HSA重悬至浓度为500,000/ml。</li>
	<li>在离心细胞的同时，每个通道用额外3 ml HBS/1% HSA溶液冲洗，以去除腔室中的D-生物素。</li>
	<li>在加入NK细胞前，通过全内反射荧光（TIRF）或共聚焦显微镜进行光漂白后荧光恢复（FRAP）实验，检测SLB上配体的流动性。</li>
	<li>待细胞离心完成并重悬至所需浓度后，向每个通道加入100 μl细胞悬液。</li>
	<li>将腔室置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育30-60分钟。</li>
	<li>孵育结束后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10-20分钟。随后每个通道通入3 ml PBS溶液洗涤，以去除多聚甲醛。</li>
	<li>加入400 μl封闭缓冲液（含5%正常驴血清和0.2% Triton X-100的PBS溶液），室温孵育30分钟。</li>
	<li>通过加入200 μl稀释的荧光标记鬼笔环肽（1单位/ml标记鬼笔环肽）和荧光标记抗穿孔素单克隆抗体（500 ng/ml抗穿孔素mAb）对F-肌动蛋白和穿孔素进行染色。室温孵育1小时。</li>
	<li>用3 ml PBS溶液冲洗。腔室现已准备好进行成像。</li>
</ol>
6. 使用 STED 在脂质双层膜上对 NK 突触进行成像
<ol>
	<li>开启所有必要的硬件模块。</li>
	<li>启动图像分析软件，启用共振扫描和STED模块。完成这些选择后，等待约3-5分钟&#160;，使软件完成初始化。</li>
	<li>单击屏幕顶部的“Configuration”选项卡。</li>
	<li>选择“Laser Config”，然后打开白光激光和STED 592 nm激光。</li>
	<li>选择100x物镜，并对齐激发激光束与592 nm耗尽激光。</li>
	<li>返回“Laser Config”模块，关闭592 nm耗尽激光，打开660 nm耗尽激光。</li>
	<li>将载玻片放置在载物台上，位于物镜上方。使用白光灯和目镜，将结合在划定双层区域上的细胞调至焦点。</li>
	<li>返回“Configuration”选项卡右侧紧邻的“Acquisition”选项卡。</li>
	<li>单击“Switch to Whitelight”选项卡，然后开启该模块，并将激发激光线拖动至适当的波长位置。</li>
	<li>从可用列表中选择所需的探测器，然后设置检测范围以覆盖相应的波长范围。 
	注意：切勿将检测范围直接设置在激发光束下方。</li>
	<li>单击左侧“Acquire”工具栏中的“Sequential”按钮，以在左侧工具栏底部弹出顺序扫描对话框。此功能允许用户添加多个序列，每个序列使用不同颜色的激发光束。选择“Between Frames”，然后按照步骤6.9和6.10的方法，为每种额外颜色设置激发频率、探测器及检测范围。</li>
	<li>所有参数优化完成后，点击“Start”以开始采集过程。</li>
	<li>应用专为STED去卷积设计的免费去卷积软件（Huygens），具体设置如前所述13。</li>
</ol>

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<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究的创新之处在于将SLB技术与STED相结合，用于研究NK细胞突触。以往的研究利用TIRF对脂质双层进行成像，以观察T细胞突触的形成8以及质膜上信号分子的转运过程6。另有研究报道了使用抗体包被的玻璃载片对NK细胞突触进行STED成像13,14。本文所述的杂交方法在此基础上进一步推进，通过在脂质双层表面应用超分辨率成像技术，以更高的清晰度对NK细胞突触进行成像，从而更真实地模拟抗原呈递细胞（APC）的动态表面。
尽管支持性脂质双层膜（SLB）是一种人工膜，缺乏真实靶细胞或抗原呈递细胞（APC）所具有的细胞骨架、脂筏及其他配体，该技术仍可重现配体的流动性与取向等重要特征。这使得SLB系统可作为一种简化模型，用于解析单个受体与配体在免疫突触（IS）形成及其动态过程中的作用。SLB最重要的特性在于，研究人员可将该技术与高分辨率成像方法（如共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜TIRF）相结合。而STED显微镜的引入进一步增强了这一优势，为免疫突触研究及其临床应用提供了前所未有的洞察力。
该系统的一个潜在批评在于，SLB 未能充分模拟 APC 的复杂表面，从而可能导致所形成的免疫突触出现潜在的非生理性结构特征。尽管确实如此，SLB 表面分子种类有限，无法完全重现 APC 表面分子的异质性分布，但这种局限性也有其优势，即允许研究人员确定单个受体与配体相互作用对突触形成的影响。
该过程包含若干关键步骤。其中最关键的一步是在整个操作过程中持续使用氩气置换试管和溶液中的氧气，以防止脂质体发生氧化，例如步骤 1.10、2.6 和 2.11 所述。脂质的氧化会导致脂质流动性降低，从而阻碍膜表面蛋白的自由移动及其参与突触结构的形成。同样重要的是，必须通过冻干法彻底去除脂质体中的氯仿（步骤 1.2）。在测定脂质双分子层中蛋白质密度时，首先需将硅珠分散成均匀的悬浮液，并确保无聚集体存在；如有必要，可对硅珠进行超声处理。在构建支持性脂质双层（SLB）的过程中，前期步骤（5.1–5.8）尤为关键，包括盖玻片的清洗、液滴的放置以及盖玻片的固定。上述任一步骤出现失误，均可能导致实验必须重新开始（从第 5 节的起始处）。因此，建议在实验前多准备一些清洗好的盖玻片，以备意外发生时节省时间。
非聚集现象是使用该系统时最常见的问题。如果在最后一步观察细胞时未能发现任何荧光突触结构，可采取以下若干措施。可在腔室中加入针对相应细胞表面受体的另一种染色剂，以验证细胞是否未与脂双层形成突触。尽管细胞可能非特异性地黏附于玻璃盖玻片或脂双层表面，但参与突触形成的表面蛋白应明显聚集于细胞-脂双层界面平面，而未参与结合的表面蛋白则应在细胞周边呈现弥散性染色。若此方法仍不奏效，应检查所用细胞 通过 通过流式细胞术确保希望研究的特定标志物在细胞表面有足够丰度的表达。某些表面蛋白已知在长期培养中会下调表达。 体内 培养。
尽管本方案详细描述了如何可视化自然杀伤细胞（NK细胞）突触的形成过程，但通过在步骤5.11中替换主要配体，SLB系统可用于研究任何免疫细胞的突触形成。也可同时加入多种配体。此外，无需一定使用链霉亲和素-生物素系统将表面蛋白固定于双层膜中，镍-NTA与组氨酸之间的相互作用同样可行。然而，由于链霉亲和素与生物素之间的结合具有极高的强度和特异性，本实验室更倾向于使用该系统。在步骤5.13中，加入双层膜的细胞浓度也可根据需要偏离规定密度，同时可调整后续孵育时间，以观察处于不同成熟阶段的突触结构。该过程甚至可进行活细胞成像，尽管这自然排除了观察细胞内结构的可能性（除非这些结构已预先标记荧光融合标签；本实验室使用若干此类改造的细胞系）。由于本方案具有高度的可定制性，研究者可结合基本的SLB技术与STED成像，广泛探究免疫学、细胞生物学及生物化学领域的众多问题，包括脂质基本动力学15、突触形成16、细胞内信号传导17以及肿瘤细胞转移18。

免疫突触（IS）处于细胞活化与功能的关键节点1。它是抗原提呈和细胞介导免疫发生的主要媒介。早期关于突触形成的显微研究采用的是细胞-细胞共轭系统2。该方法的主要局限在于，大多数共轭结构只能以“侧视”方式被观察，从而限制了对突触结构本身的全面观察。1999年，Dustin 实验室通过采用玻璃支撑的脂质双层（SLB）技术克服了这一局限3，该技术早前由 McConnel 实验室首创4,5。该方法摒弃了抗原提呈细胞（APCs），转而使用玻璃支撑的平面脂质层，蛋白质可被锚定其上并在二维空间自由移动。利用这一技术，Dustin 及其同事得以通过高分辨率荧光显微镜直接从下方观察免疫突触，首次实现了对 IS 结构的“面对面”观测。
利用SLB系统，对突触间隙（IS）的可视化细节仅受限于当前成像技术的局限性6-8。采用标准照明技术时，根据瑞利判据（Rayleigh’s criterion）9，其最小分辨率（即两个可区分的独立物体之间的最小距离）已达到&#60; 200 nm。该极限阻碍了对构成突触的精细分子级结构的成像；在超分辨率成像技术发展之前10-12，这些结构的可视化仅限于通过电子显微镜对固定细胞进行成像。
随着多种超分辨率技术的出现，例如SIM（结构光照明显微镜）、PALM（光激活定位显微镜）、STORM（随机光学重建显微镜）以及STED10-12，研究人员现在能够以前所未有的细节研究这些突触结构，从而对突触间隙（IS）获得了日益清晰的认识。STED显微镜的优势此前已有描述13。本文介绍了配备新型660 nm耗尽激光器的STED显微镜进行的超分辨率成像。与传统的592 nm耗尽激光器相比，660 nm激光器可提供更广泛的荧光染料选择（参见 http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/），特别是这些红色荧光染料。
已有其他出版物描述了在抗体包被的玻璃载玻片上对自然杀伤（NK）细胞突触进行STED成像的方法13,14。本文将支持性脂质双层（SLB）系统与超分辨率STED显微镜技术相结合，用于研究NK细胞突触。与抗体包被的载玻片相比，该技术的优势在于其为一种流动性的镶嵌结构，其中嵌入的表面蛋白可在平坦的二维表面（x-y平面）内自由移动。这种方法更真实地模拟了靶细胞的有机且可移动的表面，从而更准确地重现具有生理相关性的免疫突触的形成过程。
本实验方案的目的是通过结合支持性脂质双层（SLB）系统与超分辨率受激发射损耗（STED）显微镜技术，为终端用户提供详细的自然杀伤（NK）细胞免疫突触成像操作指南。本方案将指导用户完成以下关键步骤：脂质体的制备、嵌入蛋白质的双层膜构建、脂质双层上蛋白质密度的测定，以及利用STED显微镜获取超分辨率图像。这些技术不仅限于免疫学领域，还可广泛应用于多种学科研究中。

<table><tbody><tr><td>18:1 (&amp;Delta;9-顺式) PC (DOPC)&lt;br/&gt; 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Avanti&amp;nbsp;</td><td>850375C</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>18:1 生物素帽PE&lt;br/&gt; 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(帽-生物素)（钠盐）</td><td>Avanti&amp;nbsp;</td><td>870273C&amp;nbsp;</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>压缩氩气</td><td>Airgas&amp;nbsp;</td><td>UN1006</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>冷冻干燥仪</td><td>Labconco&amp;nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>冷冻干燥管</td><td>Labconco&amp;nbsp;</td><td>7540200</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>层析柱</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9856</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9759</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>辛基-&amp;beta;-D-吡喃葡萄糖苷</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>O1008</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>透析管</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>132676</td><td>脂质体的制备</td></tr><tr><td>96孔V型底聚苯乙烯板（未处理）</td><td>Corning</td><td>3896</td><td>抗体密度测定</td></tr><tr><td>非功能化二氧化硅微球</td><td>Bangs Laboratories&amp;nbsp;</td><td>SS06N</td><td>抗体密度测定</td></tr><tr><td>FACS管</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-959-2A&amp;nbsp;</td><td>抗体密度测定</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF微球</td><td>Bangs Laboratories</td><td>可变</td><td>抗体密度测定</td></tr><tr><td>酪蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C0875</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>含1% HSA的HEPES缓冲盐水</td><td>自制</td><td></td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>链霉亲和素&amp;nbsp;</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>434301</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>荧光标记的生物素化蛋白&amp;nbsp;</td><td>自制</td><td></td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&amp;nbsp;</td><td>80608</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>25x75 mm 玻璃盖玻片</td><td>ibidi&amp;nbsp;</td><td>10812</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>过氧化氢（30%）</td><td>Fisher Scientic&amp;nbsp;</td><td>BP2633</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>258105</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>B20656</td><td>脂双层的制备</td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>54826-001</td><td>用于成像</td></tr><tr><td>类型F浸油</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>用于成像</td></tr><tr><td>Leica TCS STED显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于成像</td></tr></tbody></table>

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

玻璃支撑的平面脂双层系统已被应用于多种学科领域。该技术最有用的应用之一是研究免疫突触的形成，因为玻璃支撑的平面脂双层能够在形成水平界面的同时模拟靶细胞的表面。近年来超分辨成像技术的进步，进一步使科学家能够更清晰地观察突触结构的精细细节。在本研究中，采用了一种先进的技术——受激发射损耗显微术（stimulated emission depletion, STED），用于研究自然杀伤（NK）细胞在支撑脂双层上的突触结构。本文提供了一套易于遵循的实验方案，详细说明了以下内容：如何准备原始合成磷脂以用于构建玻璃支撑的脂双层；如何确定特定浓度的蛋白质在脂双层结合位点上的占据密度；如何构建含有针对NK细胞活化受体CD16抗体的支撑脂双层；以及最终如何利用STED超分辨显微镜对人NK细胞在该脂双层上的行为进行成像，重点关注穿孔素阳性裂解颗粒和NK突触处丝状肌动蛋白的分布情况。因此，通过将玻璃支撑的平面脂双层系统与STED技术相结合，我们展示了该联合技术的可行性与应用价值，并实现了对NK免疫突触内细胞内结构的超分辨观察。

图1 显示抗体在脂质双层上的密度结果。其原理是利用标准微球绘制MESF与MFI之间的标准曲线 通过 流式细胞术（A）。利用标准曲线将样品系列的平均荧光强度（MFI）转换为MESF。脂双层上的抗体密度与抗体浓度呈线性相关（B）。 图2 显示自然杀伤细胞在玻璃支撑的平面脂双层上的三色STED图像。脂双层上的抗CD16抗体发生聚集，触发F-actin的形成，以及穿孔素在免疫突触焦点区域穿透F-actin网格的极化与渗透过程。利用该联合方法，可在SLB中清晰观察到荧光标记抗CD16形成的微簇，其分布直接反映了NK细胞表面CD16的簇状分布。与传统的共聚焦图像相比，由于STED成像消除了周围荧光背景，CD16中心簇的结构在STED图像中更易分辨。此外，肌动蛋白细胞骨架的超微结构也以显著提高的分辨率呈现。该结果与先前的观察一致16,17在STED图像中，可见穿孔素阳性的裂解颗粒定位于F-actin密度较低的区域，这一关键细节在共聚焦图像中大多无法分辨。
<img alt="荧光分子计数与MFI及抗体密度随浓度变化的对比图" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 脂质双层上3G8抗体的密度。 (A) 标准品系列中MESF与MFI之间的线性相关性。 (B) 样品蛋白稀释系列中蛋白密度与浓度之间的线性相关性，显示在脂质包被的二氧化硅微珠上，单位面积内荧光标记的蛋白单体数量随浓度增加的变化情况。
<img alt="STED 与共聚焦显微镜示意图，抗 CD16、穿孔素、F-肌动蛋白、合并图像、细胞结构分析。" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在平面脂双层上自然杀伤细胞突触的 STED 成像。 初代自然杀伤细胞在含有生物素标记并荧光标记的抗 CD16（红色）的 SLB 上受到刺激，固定、透化后，用鬼笔环肽（蓝色）和抗 F-肌动蛋白抗体（绿色）染色。先在常规共聚焦模式下对单个细胞成像，再在 STED 模式下成像。共聚焦与 STED 图像均使用 Huygens 软件进行去卷积处理。比例尺：1 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。

玻璃支撑的平面脂双层系统已被应用于多种学科。该技术最有用的应用之一是……

本实验的总体目标是演示如何在支撑脂质双层上成功捕获自然杀伤（NK）细胞免疫突触的超分辨率图像。该目标通过在腔室载玻片中构建含有抗NK细胞活化受体CD 16抗体的玻璃支撑平面脂质双层来实现。随后将先前分离的NK细胞加入该平面脂质双层中，接着使用f actin和穿孔素对细胞进行染色。最后一步是使用 STEAD 显微镜对形成的 NK 细胞突触进行成像，最终实现对支撑脂双层上 NK 细胞突触的成像。STEAD 技术能够以更高分辨率显示 NK 细胞突触，从而可视化肌动蛋白细胞骨架的超微结构以及位于低 F-肌动蛋白密度区域上方的穿孔素阳性溶细胞颗粒。该技术的主要优势在于，玻璃支撑的平面脂质屏障可以模拟靶细胞的质膜，以及该平面脂质屏障上的蛋白质分布。它们能够进行侧向移动，从而更真实地模拟免疫突触的形成过程。这一技术有助于解答免疫学领域的关键科学问题，使研究者能够以高分辨率、可控的方式观察突触的形成过程，这是目前商用显微镜技术或其他显微方法所无法实现的。一名博士后研究员和一名研究生将演示组装玻璃支撑的平面脂双层的实验步骤。首先，在烧杯中将30%过氧化氢与硫酸按1:3的比例混合，配制100毫升的piranha溶液。将两片矩形1.5号盖玻片放入该溶液中，浸泡20至30分钟以进行清洗。同时，取出一管先前配制好的400 µM DOPC脂质和一管先前配制好的80 µM生物素化PE脂质。将DOPC和生物素化PE以1:1的比例加入新微离心管中，加入氩气进行脱氧处理后，置于冰上运输至氩气罐。具体体积可根据实验需求调整，但最小体积不应低于2 µL。每次使用后，将混合管和各个试剂管中的脱氧氧化物取出，并将梯度管放回冰箱。清洁完成后，用蒸馏水彻底冲洗盖玻片。将盖玻片取出，静置空气中干燥数分钟，然后吸取1.5 µL脂质体混合物，以单滴形式分装至一张八孔载玻片的一个孔腔中。每泳道使用两滴样品是常规做法，但并非必需。现在，迅速而高效地将干燥的盖玻片覆盖在液滴上，确保液滴之间留有足够间距，以免盖玻片盖上后液滴相互融合。此外，需确保液滴保持圆形且轮廓清晰，不与腔室壁的边缘接触。用力按压每个泳道之间及周围区域，确保盖子之间形成严密的防水密封。使用记号笔标记液滴的位置。然后向腔室中通入100微升5%的水相casing溶液，以封闭双层膜。尽量确保流室中无气泡。然后向每条通道注入100 µL浓度为333 ng/mL的链霉亲和素。在室温下孵育10至15分钟后，用含有1%人血清白蛋白的3 mL HEPES缓冲盐水冲洗每条通道。为去除过量的链霉亲和素，加入100微升生物素化荧光标记的抗CD16抗体，其蛋白浓度按文本方案中先前确定的浓度配制，并在避光条件下孵育20至30分钟。随后用3毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐溶液冲洗每条通道，再次洗涤。然后将100微升浓度为25纳摩尔的D-生物素溶液流经反应室，以结合任何残留的过量链霉亲和素，从而消除链霉亲和素与细胞发生非特异性结合的可能性。随后计数人NK细胞，并将其重悬于含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水中，调整浓度至每毫升50万个细胞。每道加入3毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水，洗涤芯片通道以去除D-生物素。待细胞重悬至目标浓度后，向每道加入100微升。将培养 chamber 置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中孵育 30 至 60 分钟。孵育结束后，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 至 20 分钟。通过向每条通道中加入三毫升磷酸盐缓冲液清洗，以去除多聚甲醛。然后加入 400 µL 封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。接着，加入 2 µL 稀释的荧光标记鬼笔环肽（Phin）和荧光标记抗穿孔素（perforin）单克隆抗体，对 F-肌动蛋白和穿孔素进行染色，在室温下孵育 1 小时，随后通过向腔室中注入 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤。此时腔室已准备好，可开始成像。开启稳态显微镜的所有必要硬件模块。启动图像分析软件，并同时启用共振扫描和稳态模块。完成这些设置后，等待约三到五分钟，直至软件初始化完成。单击屏幕顶部的配置选项卡，选择激光器配置。然后打开白光和稳态592纳米激光器。选择100倍物镜，并将592纳米耗尽激光与激发激光束对准。选择激光配置模块，关闭592纳米耗尽激光，打开660纳米耗尽激光。将载玻片放置在物镜上方的载物台上。使用白光灯和目镜，将结合在划定双层区域上的细胞调至焦点。然后直接返回配置选项卡右侧的采集选项卡。单击切换至白光选项卡，接着打开该模块，并将激发激光线拖动至适当的波长。在选择所需的检测器并设置检测范围后，单击左侧采集工具栏中的“连续扫描”按钮，以在左侧工具栏底部弹出连续扫描对话框。这允许用户为不同颜色分别添加多个序列，每个序列对应不同的激发光束。在各帧之间点击，然后为每种额外的颜色设置激发频率检测器和检测范围。当所有参数优化完成后，点击“开始”以启动采集过程。在玻璃支撑的平面脂双层上，NK细胞免疫突触的三色稳态图像显示，红色显示的抗CD16抗体在脂双层上聚集，触发F-肌动蛋白的形成，并促使穿孔素（蓝色显示）在F-肌动蛋白网格的焦点区域发生极化和穿透。通过这种联合方法，可以在玻璃支撑的脂双层中清晰地观察到荧光标记的抗CD16形成的微簇，这直接反映了NK细胞上CD16的聚集情况。与传统的共聚焦图像相比，由于背景荧光显著降低，稳态图像中CD16中心簇的环状结构更易于分辨。此外，肌动蛋白细胞骨架的超微结构得以显著提高的分辨率呈现。与先前的观察结果一致，perin 阳性的溶细胞性颗粒位于 F 肌动蛋白密度较低的区域。在 STED 图像中，这一关键细节在共聚焦图像中大多丢失。一旦掌握，若操作得当，完成该技术大约需要四小时。需要记住的是，在组装样品腔室时，应通过反复用氩气置换氧气来保持样品的无氧状态，并迅速将盖玻片盖在样品上，然后将其浸入外壳溶液中。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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用于免疫突触与运动突触研究的支撑性平面双层膜的构建

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

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用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

本方案描述了一种利用平面脂质双层研究原代多克隆人T细胞形成突触界面能力的技术。我们采用该技术展示了来源于淋巴结和外周血的人原代T细胞在突触形成能力上的差异。...

外周血和淋巴组织来源的人原代T细胞突触界面评估

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。...

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

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在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

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