Name: 转染，选择和人类诱导多能干细胞集落采摘TALEN靶向用GFP基因进入AAVS1安全港 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 了解利用TALEN技术将GFP基因靶向整合至人类诱导多能干细胞AAVS1安全港位点的方法。该方案通过核转染、嘌呤霉素筛选和集落挑取，建立稳定表达GFP的iPSC克隆系，为基因功能研究提供可靠的细胞模型。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）共同基金以及国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所的院内研究计划资助。

1. 基底膜基质的制备与塑料器皿的包被
<ol>
	<li>将 -20 °C 保存的冻存基底膜基质原液置于冰上，并在 4 °C 过夜解冻。</li>
	<li>解冻后，用移液器将 2 mg 基底膜基质分装至预冷的离心管中。分装后储存于 -20 °C，待需要时使用。</li>
	<li>制备包被基底膜基质的培养板时，将一份分装样品置于冰上解冻，直至离心管中最后一块冰完全消失（通常在约 2 小时内）。</li>
	<li>解冻后，将基底膜基质加入 12 ml&#160;冰冷（4 °C）的 DMEM/F12 培养基中，配制成基底膜基质包被溶液。</li>
	<li>将基底膜基质溶液加入适当的培养容器中。对于 6 孔板，每孔加入 1 ml&#160;。轻轻晃动培养板，确保基底膜基质溶液完全覆盖每个孔的表面。</li>
	<li>用 Parafilm 密封包被有基底膜基质的培养板/培养皿，并在使用前于室温孵育 1 小时。或者，可将包被后的培养板/培养皿储存于 4 °C，并在包被后 2 周内使用。 
	注意：向包被有基底膜基质的培养板/培养皿中额外加入 DMEM/F12，以防止干燥。使用前，将储存于 4 °C 的培养板/培养皿置于生物安全柜中，使其恢复至室温至少 30 分钟。</li>
	<li>在加入培养基和细胞前，彻底吸除基底膜基质。</li>
</ol>
2. E8 培养基的制备
<ol>
	<li>通过将 E8 添加剂在 4 °C 下过夜解冻来制备 E8 培养基。</li>
	<li>从 500 ml&#160;的储存液中移除 10 ml&#160;基础 E8 培养基并弃去。</li>
	<li>将整瓶 10 ml&#160;的 E8 添加剂直接加入 490 ml&#160;的基础 E8 培养基中。切勿将完全配制的 E8 培养基置于 37 °C 水浴中预热，因为反复的温度变化会降解完全 E8 培养基中的 bFGF。</li>
	<li>在添加添加剂后的 2 周内使用完全配制的 E8 培养基。</li>
</ol>
3. iPSCs 的解冻
<ol>
	<li>从液氮中取出一管冷冻的诱导多能干细胞（iPSCs），置于干冰上。</li>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻该管，轻轻摇动直至仅剩微小冰晶。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒管壁，并转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将1 ml&#160;室温E8培养基逐滴直接加入该管中。</li>
	<li>使用2 ml移液器将细胞悬液逐滴转移至含有9 ml&#160;E8培养基的15 ml锥形离心管中。转移过程中频繁轻柔旋转离心管，以确保细胞与培养基迅速充分混匀。</li>
	<li>在200 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于适量含有10 μM Y-27632的E8培养基中。</li>
	<li>将细胞接种至适当数量的基底膜基质包被的培养板孔中，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜。建议每6孔板每孔接种至少0.2 × 106个iPSC，以促进解冻后的快速恢复。</li>
</ol>
4. iPSC 的维持与常规传代
<ol>
	<li>每天更换 E8 培养基。</li>
	<li>使用倒置显微镜观察细胞形态和融合度。高质量的诱导多能干细胞（iPSC）以扁平、边界清晰的克隆形式生长；单个克隆呈现“鹅卵石样”外观。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 70% 时进行传代。</li>
	<li>通过将 0.9 g NaCl 和 500 μl&#160;0.5 M EDTA 加入 500 ml&#160;DPBS 中配制 EDTA 传代溶液。充分混匀以溶解 NaCl，并通过真空过滤灭菌。传代前将一份溶液置于 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>传代时，吸除用过的培养基，并用等体积的预热传代溶液洗涤细胞一次。吸除溶液后，加入足量 EDTA 传代溶液以覆盖细胞表面（每 6 孔板每孔加 1 ml&#160;）。</li>
	<li>将细胞置于倒置显微镜下观察 iPSC 克隆。通常在 2 至 5 分钟内可见克隆内部出现孔洞及边缘翘起。</li>
	<li>小心吸除 EDTA 传代溶液。</li>
	<li>使用 10 ml&#160;移液器，在高压下将 4 ml&#160;E8 培养基（若使用 6 孔板）直接吹入每个待传代的孔中。</li>
	<li>收集 iPSC 细胞团，并根据 1:8 至 1:12 的传代比例将其分种至适当数量的孔中。避免过度吹打，以免细胞团过度解离，导致细胞存活率降低。</li>
	<li>将培养板放入培养箱后，轻轻前后及左右摇晃数次，以使细胞均匀分散。</li>
</ol>
5. 转染用小鼠胚胎成纤维细胞和诱导多能干细胞的制备
<ol>
	<li>48 小时&#160;转染前，将iPSCs以约1:6的比例传代至四个或更多个包被有基底膜基质的6孔板孔中，使其在两天后达到70%融合度。</li>
	<li>次日，将DR4 MEFs解冻并接种于MEF培养基中，该培养基由添加了10% FBS和1×MEM-NEAA的DMEM（高糖）组成。</li>
	<li>将DR4 MEFs以约2 x 10⁵个细胞接种至两个10 cm培养皿中4 细胞/厘米²2 并在37 °C下孵育过夜。</li>
	<li>转染当天，于转染前30分钟将MEF培养基更换为添加了10 μM Y-27632的E8培养基&#160;在对iPSCs进行转染之前。</li>
	<li>可选: 若需对转染后的iPSCs进行流式细胞术分析，从4 °C取出包被有基底膜基质的培养板，置于室温下。</li>
	<li>可选: 4 小时&#160;转染前，向转染前的iPSC培养物中添加Y-27632，使其终浓度为10 μM。</li>
</ol>
6. 使用电穿孔系统对iPSCs进行温和细胞解离试剂处理及转染
<ol>
	<li>从 4 °C 取出 P3 原代细胞转染溶液，室温平衡约 30 分钟。使用前将全部 100 μl&#160;补充剂加入转染溶液中。</li>
	<li>将温和细胞解离试剂在 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>从 -20 °C 取出 AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）以及 AAVS1-CAG-EGFP 供体质粒。</li>
	<li>将 iPSCs 从培养箱中取出，用 DPBS 洗涤一次。</li>
	<li>每孔加入 1 ml&#160;温和细胞解离试剂，37 °C 培养 5 分钟，或直至超过 50% 的细胞从培养容器上解离。</li>
	<li>使用 p1000 移液器将细胞上下吹打数次，以使残留细胞完全解离，并打散 iPSC 细胞团。</li>
	<li>每孔加入 2 ml&#160;E8 培养基，使用 10 ml&#160;移液器上下吹打数次，进一步将细胞团解离为单细胞。 
	注意：若细胞团未充分解离，转染效率将显著下降。</li>
	<li>将 iPSCs 收集至 15 ml&#160;离心管中，100 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用少量 E8 培养基重悬细胞。</li>
	<li>加入如 0.4% 台盼蓝等活细胞染料后，使用血细胞计数板对细胞计数。计数时确保细胞充分解离（每“团”1–3 个细胞）。</li>
	<li>将 3 × 106 个细胞分装至两个 15 ml&#160;离心管中，再次以 100 × g 离心 3 分钟。 
	注意：低速离心可减少细胞应激，并便于电穿孔前 iPSCs 的重悬。</li>
	<li>将电穿孔系统设置为适用于人胚胎干细胞系 H9 的细胞类型特异性程序（程序 CB-150）。</li>
	<li>离心后，吸除细胞沉淀的上清液。向其中一个沉淀中加入 10 μg HR 供体质粒作为对照样本；向另一个沉淀中加入 10 μg HR 供体质粒以及每种 TALEN 各 5 μg（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）作为实验样本。</li>
	<li>用 100 μl&#160;P3 原代细胞转染溶液分别重悬每个细胞沉淀，并转移至电穿孔杯中。</li>
	<li>进行转染操作后，立即向每个电穿孔杯中加入 500 μl&#160;室温 E8 培养基。</li>
	<li>将转染后的 iPSCs 逐滴转移至一个含有第 5.4 步制备的 DR4 MEF 饲养层的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>可选：若需通过流式细胞术分析转染效率，可将每次实验的数滴细胞加入一个已包被基底膜基质的 6 孔板的单个孔中。</li>
	<li>重复步骤 6.15–6.17 完成两个样本的处理。次日，用 DPBS 洗涤细胞两次，并将培养基更换为 NutriStem，该培养基在饲养层上培养 iPSCs 的效果优于 E8。</li>
	<li>瞬时 EGFP 表达在转染后 48 至 72 小时&#160;达到峰值；可根据需要评估转染效率。</li>
</ol>
7. 靶向iPSCs的嘌呤霉素筛选
<ol>
	<li>72小时后开始嘌呤霉素筛选&#160;转染后当iPSCs达到70%融合度时。</li>
	<li>对于 NCRM5 诱导多能干细胞，从 0.5 μg/ml 开始进行嘌呤霉素筛选&#160;嘌呤霉素（半剂量）稀释于NutriStem培养基中。对于某些iPSC系，最佳嘌呤霉素浓度可能在0.25至1 μg/ml之间。</li>
	<li>在 NutriStem 培养基中培养 iPSCs，添加 0.5 μg/ml&#160;嘌呤霉素处理3天，每天更换培养基。</li>
	<li>3天后，将嘌呤霉素的浓度增加至1 μg/ml。</li>
	<li>在1 μg/ml条件下培养iPSCs&#160;嘌呤霉素筛选再持续 7 到 8 天，或直至出现足够大的独立克隆用于挑取。</li>
</ol>
8. 靶向诱导多能干细胞的克隆挑选与扩增
<ol>
	<li>使用基底膜基质对96孔板进行包被：将50 μl&#160;包被溶液（将2 mg基底膜基质稀释至12 ml&#160;DMEM/F12中）加入每个孔。使用前将板置于4 °C过夜保存。</li>
	<li>将包被有基底膜基质的板恢复至室温后，吸除基底膜基质溶液，并向每孔加入100 μl&#160;添加了10 μM Y-27632的E8培养基。</li>
	<li>将倒置显微镜放入生物安全柜中，并用70%乙醇轻轻喷洒以灭菌。</li>
	<li>在本生灯上拉制玻璃巴斯德吸管，制备出尖端带有微小“钩状”结构的理想克隆挑选工具。用70%乙醇灭菌后置于超净台内晾干。</li>
	<li>从培养箱中取出含有目标iPSC克隆的培养皿，置于超净台内的显微镜下。</li>
	<li>使用克隆挑选工具沿克隆边缘画圈，以挑选iPSC克隆。</li>
	<li>利用克隆挑选工具的“钩”轻轻刮取并从孔板表面移除iPSC克隆。对于较大的克隆，可用克隆挑选工具在其上划“X”形切口，将其分为四等份，有助于再接种后的细胞生长。</li>
	<li>待细胞团块脱离并自由漂浮后，使用设定为约30 μl&#160;的P200移液器收集iPSC细胞。直接将细胞接种至96孔板中。</li>
	<li>可选步骤：使用设定为约5 μl&#160;的P20移液器将iPSC细胞收集至EP管中，然后加入50 μl&#160;温和细胞解离试剂，在37 °C消化5 min&#160;。消化完成后，向EP管中加入500 μl&#160;E8培养基以稀释温和细胞解离试剂，并在标准台式微量离心机中以200 × g离心5 min。随后吸除大部分上清液，保留约30 μl&#160;液体用于重悬细胞，并将细胞转移至96孔板。 
	注意：该方法有助于细胞团块的解离及所选克隆的快速扩增。</li>
	<li>继续进行克隆挑选，直至收集到足够数量的iPSC克隆（建议每次实验收集约20–30个克隆）。</li>
	<li>完成克隆挑选后，将96孔板放入培养箱中培养过夜。次日更换为完全E8培养基，继续培养至细胞融合度约为70%。</li>
	<li>按照步骤4.5–4.10所述，将细胞从96孔板传代至24孔板，再传代至6孔板。 
	注意：当使用小于6孔板的孔板时，EDTA溶液和E8培养基的体积应按比例减少。</li>
	<li>通过连接PCR和Southern印迹分析评估靶向效率，以确认靶向载体的整合以及随机插入载体的缺失16。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+insulator+in+AAVS1%2C+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+by+AAVS1+Transcription+Activator-Like+Effector+Nucleases.+Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells%3A+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li>
<li>Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stembook.org/node/1438">http://www.stembook.org/node/1438</a> (2008-2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功生成AAVS1安全港定点靶向人iPSCs最关键的步骤包括：（1）通过转染将TALEN和供体质粒高效递送至iPSCs；（2）优化转染前iPSCs的单细胞解离以及转染后的铺板密度；（3）根据iPSC细胞系的生长情况优化药物筛选的剂量和时间；（4）仔细分离并挑选靶向克隆，转移至新的培养板/孔中。与Hockemeyer论文10中使用的类似方法相比，本实验方案采用了一对开源的AAVS1-TALEN、不同的iPSC解离试剂以及不同的转染装置来递送TALEN和供体质粒，从而在实现高转染效率和高靶向效率的同时，减少了实验所用iPSC的数量。
为了在人源iPSCs中实现高效的基因编辑，首先必须优化基因编辑试剂（DNA/RNA）的递送效率，同时平衡递送方法和试剂对iPSCs造成的急性细胞死亡。目标是在维持可接受的低细胞死亡水平的前提下，最大化递送效率。由于AAVS1-TALEN质粒易于大量制备，且在药物筛选的辅助下可在人源iPSCs中实现&#62;50%的同源重组效率，因此无需从TALEN质粒体外转录生成mRNA。递送的主要挑战来自较大的供体质粒，本实验中该质粒约为10 kb...

将人类体细胞重编程为类似胚胎干细胞的诱导性多能干细胞（iPSCs）的能力最初由Takahashi发现 等 2007年1经转导表达四种转录因子（即所谓的山中因子 Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4）的逆转录病毒的人类真皮成纤维细胞，在形态、增殖能力、基因表达和表观遗传状态方面均显示出与人类胚胎干细胞（hESCs）高度相似的特征；关键的是，诱导性多能干细胞（iPSCs）也具有分化为三个胚层各类细胞的能力1iPSCs 的增殖潜能和分化能力使其成为极具吸引力的工具；通过重编程患有特定疾病的患者的细胞，iPSCs 既可用于 体外 疾病模型系统及潜在治疗手段。
为实现iPSCs在临床应用中的全部潜力，必须首先解决若干问题，其中包括iPSCs的致瘤性潜能 体外 培养的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）、重编程及细胞维持过程中使用异种衍生物，以及对移植细胞进行追踪的需求 体内 都是多能干细胞临床应用的关键障碍（Hentze 综述） 和在.2). 解决移植后追踪已分化细胞的需求，理想方案是采用一种无论在何种应用中均不受沉默和花斑效应影响的可视标记。当外源DNA被导入安全港位点时，整合型转基因的强健且持续表达最容易实现；也就是说，这些基因组位点能够支持整合载体的充分转录，同时最大限度减少对邻近基因表达的干扰3一个自发现以来已被深入表征的位点是腺相关病毒整合位点1（AAVS1），位于蛋白磷酸酶1调节亚基12C（PP1R12C）基因的第一个内含子中。PPP1R12C) 基因。该位点不仅能够在长期培养过程中维持外源转基因的持续且稳定的表达， 体外 分化3，还能保护邻近基因免受转录干扰4；这两个特征被认为源于AAVS1位点两侧存在内源性染色质绝缘子元件5.
在过去的十年中，基因组编辑工具的不断进步极大地提高了在任何细胞类型中进行遗传操作的便捷性和效率。早期成功的实验依赖于极低水平的内源性同源重组（HR），通过引入供体实现胚胎干细胞（ESCs）中的基因靶向6,7；而位点特异性核酸酶（如锌指核酸酶ZFNs）的应用显著提升了同源重组效率，其机制是通过产生双链DNA断裂来促进重组过程，从而大幅提高了此类实验的成功率8,9。随后，植物病原菌xanthomonas属中的转录激活样效应因子（TALEs）以及原核生物中成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统被重新开发为高效的位点特异性设计核酸酶，使得多能干细胞中的基因靶向成为一种可及且实用的技术方法10-13。
最近一项研究报道了一种利用转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）将绿色荧光报告基因盒高效稳定整合到人诱导多能干细胞（iPSCs）AAVS1 安全位点的简便方法14。这些经靶向修饰的iPSCs在定向分化为心肌细胞并移植至心肌梗死（MI）小鼠模型后仍能维持其荧光表达，充分证明了此类稳定表达荧光的多能干细胞的应用价值14。为获得靶向整合的克隆，研究采用了一种基因捕获策略：通过剪接受体（SA）和2A自剪切肽序列，使嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC）基因受内源性PPP1R12C启动子的调控；因此，只有在AAVS1位点成功整合了供体质粒的iPSC才能表达PAC，从而可通过嘌呤霉素抗性进行筛选（图1，15）。本实验方案详细描述了上述研究中报道的构建AAVS1-GFP iPSCs的具体步骤14，包括使用TALENs和9.8 kb供体质粒转染iPSCs，将4.2 kb DNA片段整合至AAVS1安全位点，基于嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞，以及挑取单克隆进行扩增。本文所述技术可广泛应用于多种基因组编辑实验中。

<table><tbody><tr><td>Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV，10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>置于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>置于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>基础培养基置于 4 &amp;deg;C 保存，补充剂置于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>室温保存。溶解于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 后，置于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC 处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - 学术用途</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>置于液氮中保存。</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>置于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>限定型胎牛血清，美国来源</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>置于 -20 &amp;deg;C 保存。在 4 &amp;deg;C 过夜解冻后分装。分装后保存于 -20 &amp;deg;C，待用。</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>置于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector 核心单元&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>电穿孔系统的一部分</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X 单元&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>电穿孔系统的一部分</td></tr><tr><td>P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（24 次反应）</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>收到后，取出原代细胞溶液和补充剂，置于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>置于 -20 &amp;deg;C 保存。在 4 &amp;deg;C 过夜解冻，使用前将分装液在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF 培养基</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>置于 -20 &amp;deg;C 保存。在 4 &amp;deg;C 过夜解冻</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）</td><td>Addgene</td><td>52637 和 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP 同源重组供体质粒</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>嘌罗霉素二盐酸盐</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>置于 -20 &amp;deg;C 保存。用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制 1 mg/ml 的工作液并分装。</td></tr><tr><td>一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR（带制冷），120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &amp;times; 750 ml 摆动桶转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

人类诱导性多能干细胞中利用talen技术将gfp基因靶向aavs1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

靶向转基因添加可在避免病毒载体介导的随机整合所导致的基因沉默和插入突变的同时，实现持久的基因表达。本方案描述了一种基于已验证的开源TALENs和类似基因捕获（gene-trap-like）供体质粒，在人iPSC中实现通用且高效的靶向转基因添加平台。重要的是，基因编辑效率受限于基因编辑载体的递送效率。因此，本方案首先聚焦于转染前iPSC的制备，以实现高效的核内递送。当使用温和的细胞解离试剂将iPSC解离为单细胞，并采用优化的程序进行转染时，可使超过50%的细胞摄取大尺寸的基因编辑载体。由于AAVS1位点位于一个活跃基因（PPP1R12C）的内含子中，因此采用与剪接受体（splicing acceptor, SA）连接的嘌呤霉素抗性基因（PAC）来筛选靶向整合的iPSC，同时排除仅发生随机整合或未转染的细胞。该策略显著提高了获得靶向克隆的概率，也可应用于其他活跃基因的靶向实验。在根据特定iPSC系调整剂量进行嘌呤霉素筛选两周后，即可通过手动解剖较大的孤立克隆，将其分割为较小片段，并转移至较小孔板中的新鲜培养基中，以进行后续扩增及遗传学和功能筛选。研究人员可依据本方案，快速获得多个GFP报告基因iPSC细胞系，这些细胞系可用于体内（in vivo）和体外（in vitro）成像以及细胞分离研究。

该实验方案的示意图见图2，其中诱导性多能干细胞（iPSCs）在不同培养基中培养的时间段分别以绿色（E8培养基）或蓝色（NutriStem培养基）标出。仅可转染高质量的iPSCs；在常规维护过程中应仔细检查培养皿，确保iPSC培养物主要由具有铺路石样形态的独立克隆组成（图3A）；分化细胞所占比例不应超过10%。iPSCs的转染效率通过小尺寸质粒pMax-GFP进行评估和优化（图4A-B），由于pMax-GFP体积较小，其转染效率通常代表了可达到的最高水平。例如，我们使用pMax-GFP实现了68.6%的转染效率（图4B）。为靶向AAVS1安全位点，iPSCs需使用温和的单细胞解离试剂传代，并与AAVS1-TALENs和AAVS1-CAG-EGFP共转染（质粒结构见图1A）。转染后的iPSCs接种于适当密度的DR4 MEFs上（图3B）。AAVS1-CAG-EGFP的瞬时表达在转染后48至72小时达到峰值（图3C</stro...

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。

人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

靶向转基因添加可在规避病毒载体引起的基因沉默和插入突变的同时，实现持久的基因表达。

本实验的总体目标是生成一个在AA位点与一个安全位点靶向整合、可诱导表达GFP的多能干细胞（iPSC）克隆。该目标首先通过核转染技术，将AAV供体质粒与TALONs及A-VS-one-C-A-G-E-G-F-P供体质粒高效导入iPSC中来实现。在第二步中，利用嘌呤霉素在小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上筛选出AAV靶向整合的细胞。接下来，将单个表达GFP的AAVS1靶向克隆挑取至包被有Matrigel的96孔板中。最后一步中，采用E8培养基和标准的iPSC培养技术对AAVS1-GFP-iPSC克隆进行扩增。最终，通过免疫荧光显微镜和流式细胞术验证AAVS1靶向的人iPSC克隆中GFP的均一且强效表达。该方法的可视化演示至关重要，因为菌落挑取步骤需要在显微镜下使用特殊的菌落挑取工具对目标克隆进行显微解剖，这种操作在并排教学中难以掌握。首先用 PBS 将 iPSC 培养物洗涤一次。然后向每个孔中加入 1 毫升 37 摄氏度的温和细胞解离试剂，在 37 摄氏度孵育约 5 分钟，当超过 50% 的细胞已从培养容器上解离时即可。使用 P 1000 移液器机械性地分散任何残留的细胞团块或贴壁细胞。然后向每孔加入 2 毫升 E8 培养基，使用 10 毫升移液器进一步将培养物解离为单细胞悬液。现在将收集的细胞合并至一个 15 毫升锥形管中，并离心沉淀细胞。将沉淀重悬于少量 E 八培养基中进行计数。通过台盼蓝排斥法确认细胞培养物的活力及其充分解离后，将 300 万个细胞分别转移至两个 15 毫升锥形管中。在细胞离心的同时，将电穿孔系统设置为适用于人胚胎干细胞系 H nine 的细胞类型特异性程序。随后，向一个沉淀中单独加入 10 微克同源重组供体质粒作为对照样本，向另一个沉淀中加入 10 微克同源重组供体质粒以及每种 talon 质粒各 5 微克作为实验样本。接下来，向每个对照组和实验组细胞沉淀中加入 100 µL 室温的完全 P3 原代细胞转染溶液，并重悬细胞。将样品转移至各自的电穿孔杯中，转染后立即进行电穿孔。向每个电穿孔杯中加入 500 µL 室温的 E8 培养基，然后将转染后的 iPSC 样品逐滴转移至含有 DR4 小鼠胚胎成纤维细胞的各个 10 厘米培养皿中。在挑取克隆前，向 96 孔板的一个孔中加入 50 µL 基底膜基质溶液进行包被，然后将该板在 4°C 下过夜孵育，次日早晨使用。当培养板达到室温后，吸除多余液体，并向每孔加入 100 微升添加了 10 微摩尔 Y 27632 的 E8 培养基。接着，将倒置显微镜放入生物安全柜中，并用 70% 乙醇轻喷进行消毒。然后将一根玻璃巴斯德吸管置于本生灯火焰上灼烧，用 70% 乙醇灭菌后制成尖端带有微小钩状结构的克隆挑取工具。将钩子放入通风橱中晾干，然后将IPSE培养物置于显微镜载物台上进行克隆挑选。在低倍镜下找到合适的菌落，使用菌落挑取工具对其进行划分并分为四等份。随后轻轻刮取已分好的四分之一菌落，用设置为约30 µL的P200移液器收集悬浮的IPC，并直接将细胞接种到底层基膜基质上。在收获时，IPCs 应在铺板后两到四小时内贴壁。最后将挑取的菌落于 37 摄氏度培养过夜，次日早晨用完全 E 八培养基更换培养基。整个实验过程中，必须仅转染高质量的 I PSCs。iPSC 培养物应主要包含界限清晰、呈铺路石样形态的克隆，如图中所示，分化细胞的比例不应超过培养物的10%。可通过使用小型 PAX GFP 载体评估并优化 iPSC 的转染能力，因为 PAX GFP 由于其分子量小，通常可达到最高的转染效率。转染后的 iPSC 中，A VS one C-A-G-E-G-F-P intel 的瞬时表达在转染后48至72小时达到峰值，可通过流式细胞术检测少量转染细胞来确认。转染效率可能存在较大差异。即使在实验中，GFP阳性细胞的比例也仅为10%。在嘌呤霉素筛选后，应选择表现出均一荧光且克隆足够大的单克隆进行挑取。此外，当靶向的iPSC克隆扩增至96孔板格式时，应表现出稳定且均一的GFP表达。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过核转染法高效转染iPSCs，以及如何分离AAVS1安全位点。使用菌落挑取工具筛选靶向 IPSE 克隆。

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