人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

本实验的总体目标是生成一个在AA位点与一个安全港位点靶向整合、可诱导表达GFP的多能干细胞（iPSC）克隆。该目标首先通过核转染技术将AAVS1 TALEN质粒与AAVS1-CAG-EGFP供体质粒高效导入iPSC中来实现。第二步，在小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上通过嘌呤霉素筛选获得AAVS1靶向的细胞克隆。

接下来，将单个表达GFP的AAVS1靶向克隆挑取至包被有Matrigel的96孔板中。最后一步中，采用E8培养基和标准的iPSC培养技术对AAVS1-GFP-iPSC克隆进行扩增。最终，通过免疫荧光显微镜和流式细胞术验证AAVS1靶向的人iPSC克隆中GFP的均一且强效表达。

该方法的可视化演示至关重要，因为菌落挑取步骤需要在显微镜下使用特殊的菌落挑取工具对目标克隆进行显微解剖，这种操作在并行指导过程中难以掌握。首先，用 PBS 将 iPSC 培养物各洗涤一次。然后向每个孔中加入 1 毫升 37 摄氏度的温和细胞解离试剂，当超过 50% 的细胞已从培养容器上解离时，在 37 摄氏度下孵育约五分钟。

使用 P 1000 移液器机械性地分散任何残留的细胞团块或贴壁细胞。然后向每孔加入 2 毫升 E8 培养基，使用 10 毫升移液器进一步将培养物解离为单细胞悬液。现在将收集的细胞合并至一个 15 毫升锥形管中，并离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于少量 E 八培养基中进行计数。通过台盼蓝排斥法确认细胞培养物的活力及其充分解离后，将 300 万个细胞分别转移至两支 15 毫升锥形管中。在细胞离心的同时，将电穿孔系统设置为适用于人胚胎干细胞系 H nine 的细胞类型特异性程序。然后，向其中一份沉淀中单独加入 10 微克同源重组供体质粒作为对照样本，向另一份沉淀中加入 10 微克同源重组供体质粒以及每种 talon 质粒各 5 微克作为实验样本。

接下来，向每个对照组和实验组细胞沉淀中加入 100 µL 室温的完全 P3 原代细胞转染溶液，并重悬细胞。将样品转移至各自的电穿孔杯中，转染后立即进行电穿孔。向每个电穿孔杯中加入 500 µL 室温的 E8 培养基，然后将转染后的 iPSC 样品逐滴转移至含有 DR4 小鼠胚胎成纤维细胞的各个 10 厘米培养皿中。在挑取克隆前，将 96 孔板的一个孔用 50 µL 基底膜基质溶液包被，然后于 4°C 过夜孵育，次日早晨使用。

当培养板达到室温后，吸除多余液体，并向每孔加入 100 微升添加了 10 微摩尔 Y 27632 的 E8 培养基。接着，将倒置显微镜放入生物安全柜中，并用 70% 乙醇轻喷进行消毒。然后将一根玻璃巴斯德吸管置于本生灯火焰上灼烧，经 70% 乙醇灭菌后，制成尖端带有微小钩状结构的克隆挑取工具。

将钩子放入生物安全柜中晾干，然后将IPSE培养物置于显微镜载物台上进行克隆挑选。在低倍镜下找到合适的菌落，使用菌落挑取工具对其进行划线并四等分。随后轻轻将四等分后的菌落从培养容器上刮下，用设置为约30 µL的P200移液器收集悬浮的IPC，并直接将细胞接种到基底膜基质上。

在收获时，IPCs 应在接种后两到四小时内贴壁。最后将挑取的菌落于 37 摄氏度培养过夜，次日早晨用完全 E 八培养基更换培养基。整个实验过程中，必须仅转染高质量的 I PSCs。

iPSC 培养物应主要包含界限清晰、呈铺路石样形态的克隆，如图中所示，分化细胞的比例不应超过培养物的10%。可通过使用小型 PAX GFP 载体评估并优化 iPSC 的转染能力，因为 PAX GFP 由于其分子量小，通常可达到最高的转染效率。转染后的 iPSC 中，A VS one C-A-G-E-G-F-P intel 的瞬时表达在转染后48至72小时达到峰值，可通过流式细胞术检测少量转染细胞来确认。转染效率可能存在较大差异。

即使在实验中，GFP阳性细胞的比例也仅为10%。在嘌呤霉素筛选后，应选择荧光表达均一的单克隆，且克隆应足够大以便挑取菌落。此外，在转入96孔板后，扩增的靶向iPSC克隆应表现出稳定且均一的GFP表达。观看本视频后，您应能充分了解如何通过核转染技术高效转染iPSC，以及如何分离AAVS1安全港位点。

使用菌落挑取工具筛选靶向 IPSE 克隆。