Name: 成像本地CA 2+在培养的哺乳动物细胞信号 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习使用荧光显微镜成像技术检测完整哺乳动物细胞中的局部IP3介导钙信号。该方法结合自动化算法分析钙释放事件，为研究钙通道病变和细胞信号传导提供高通量工具。

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本工作得到了美国国立卫生研究院基金的资助，I.F.S. 获得 GM 100201 项目支持，I.P. 获得 GM 048071 和 GM 065830 项目支持。

我们介绍了在人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中成像局部 Ca2+ 事件的详细步骤。这些步骤可经调整后用于多种细胞类型的细胞内 Ca2+ 信号成像8-10。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>根据细胞供应商网站上列出的说明培养待成像的细胞。</li>
	<li>成像前数天，使用 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（2–3 分钟）收获在组织培养瓶中生长的细胞。细胞脱落后，加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞以每皿 3–7 × 104 个细胞的密度接种至玻璃底成像培养皿中。当细胞达到 60% 汇合度时（2–3 天），选择用于成像实验。</li>
</ol>
2. 溶液与试剂的配制
<ol>
	<li>配制含 Ca2+ 的 HEPES 缓冲盐溶液（Ca2+-HBSS），成分为（mM）：135 NaCl、5.4 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES 和 10 葡萄糖；用 NaOH 调节至室温（RT）下 pH = 7.4。配制不含葡萄糖的 Ca2+-HBSS 并于 4 °C 保存；使用前立即向溶液中加入葡萄糖。</li>
	<li>将荧光 Ca2+ 指示剂 Cal-520（1 mM）、ci-IP3（200 µM）和 EGTA（100 mM）的膜通透性形式溶于含 20% 普流罗尼克 F-127 的二甲基亚砜（DMSO）中。将这些试剂分装至微量离心管中，避光避湿，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
3. 使用膜通透性Cal-520、ci-IP3和EGTA负载细胞
<ol>
	<li>通过将膜通透性 Cal-520 和 ci-IP3 的储备液稀释至 Ca2+-HBSS 中，分别配制终浓度为 5 µM 和 1 µM 的“上样缓冲液”。</li>
	<li>吸除培养基，并用 Ca2+-HBSS 替换培养基，重复冲洗细胞三次。</li>
	<li>移除 Ca2+-HBSS，将细胞置于上样缓冲液中，在室温避光条件下孵育 60 分钟。</li>
	<li>移除上样缓冲液，并用 Ca2+-HBSS 替换培养基，重复冲洗细胞三次。
	<ol>
		<li>如需要，可在本步骤中通过将 EGTA/AM 储备液稀释至 Ca2+-HBSS 中终浓度为 5 µM，对细胞进行染色，随后在室温避光条件下孵育 30–60 分钟。完成此孵育后，在进入步骤 3.5 前，用 Ca2+-HBSS 冲洗细胞三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞在 Ca2+-HBSS 中孵育 30 分钟，以使已加载的试剂完成去酯化。</li>
	<li>成像前立即用“新鲜”的 Ca2+-HBSS 替换原有 Ca2+-HBSS，以去除在最终孵育期间可能泄漏到浴液中的染料。</li>
</ol>
4. Ca2+ 成像采集
<ol>
	<li>在100X APO TIRF物镜（NA 1.49）上滴加一小滴浸油。</li>
	<li>将成像培养皿安装在倒置显微镜的载物台上，使用透射光将细胞调至焦点。务必固定好成像培养皿，以防止记录过程中发生移动。</li>
	<li>使用488 nm激光照射细胞，以激发Cal-520，并利用高速EMCCD相机收集发射荧光（λ &#62;510 nm）。 
	注意：显微镜操作软件允许用户移动聚焦透镜，从而将激光束导入物镜后孔径的边缘（用于TIRF激发）或更中心的位置（用于“宽场（WF）”激发）。</li>
	<li>通过EMCCD软件，将成像区域从完整的512 × 512像素缩小，以达到捕获局部Ca2+事件所需的时间分辨率。 
	注意：例如，中心四象限采集256 × 256像素可将采集速率提高至66帧/秒。还可使用EMCCD相机的“隔离裁剪模式（Isolated Crop Mode）”功能进一步将帧率提升至500帧/秒。</li>
	<li>设置软件自动记录数秒的基础活动，随后向细胞施加一次紫外闪光，并继续记录10–30秒。 
	注意：紫外闪光通过显微镜后端口的紫外反射二向色镜引入，光源为氙弧灯。紫外闪光的持续时间和强度需根据经验调整，以诱发理想频率的局部Ca2+事件。</li>
	<li>将文件保存为图像序列，用于离线分析。</li>
</ol>
5. 自动化 Ca2+ 图像分析
注意：可以使用多种商业软件包来查看、处理和分析所采集的数据。然而，我们开发了一种算法，可快速自动识别和分析局部 Ca2+ 信号。该算法中所用空间和时间滤波器的详细描述、ΔF/F0 的生成以及信号识别与分析程序，参见文献11。该算法基于开源软件平台 Python 开发，可通过电子邮件联系通讯作者（ismith@uci.edu）获取该算法程序、示例实验数据及详细的用户操作说明。
<ol>
	<li>将待导入自定义算法的文件转换为多平面 .tiff 文件格式。</li>
	<li>找到包含分析算法的文件夹，双击运行 run.exe。</li>
	<li>选择要分析的 .tiff 文件。</li>
	<li>在弹出的对话框中选择分析参数。样本数据的默认参数参见图2A。</li>
	<li>通过将光标移动到视野中不含细胞的区域（参见图2B），或通过“设置黑电平”提示手动输入黑电平值，确定需从图像堆栈中偏移的黑电平。</li>
	<li>软件分析完成后，观察屏幕上显示的四个窗口（图2C-F）。C 为正在分析细胞的静息荧光单色图像。叠加在该图像上的白色方块为事件位置，由拟合事件的二维高斯函数的质心位置确定。</li>
	<li>单击每个事件位置，或按光标键在事件间切换。此时，窗口 D 将更新显示各位置经背景扣除、高斯平滑处理后的荧光比值变化（ΔF/F0）。 
	注：红色高亮的事件被判定为源自该特定位点，而非来自邻近位点活动的“串扰”信号。下方蓝色轨迹表示所选位点的荧光信号超过检测阈值的位置，而黑色线条标识源自该特定位点的事件（对应于红色高亮事件）。</li>
	<li>单击红色高亮事件，以更新窗口 E 和窗口 F。窗口 E 显示该事件的时间演化过程，窗口 F 显示该事件在其持续时间内的平均空间分布，以及拟合的高斯函数的空间分布。</li>
	<li>手动审查已识别的事件，以排除伪影干扰。通过右键单击红色高亮事件删除此类伪影事件。 
	注：据我们经验，单个 IP3R 通道介导的 Ca2+ 流产生的信号 ΔF/F0 约为 0.11，因此任何明显小于此值的“事件”很可能是假阳性。</li>
	<li>通过选择“保存至 Excel”导出数据，或通过围绕感兴趣细胞绘制区域并选择“保存细胞”以单个细胞为单位导出数据。 
	注：数据将保存至与原始图像堆栈相同的文件夹中。</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了利用荧光 Ca2+ 探针在培养的哺乳动物细胞中成像局部 Ca2+ 事件的实验方案。此外，还介绍了一种具有直观用户界面的算法，可自动识别和分析所获取的数据。此处描述的实验流程使用荧光 Ca2+ 探针 Cal-520，但其他多种 Ca2+ 敏感染料（如 Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8 和 Oregon Green BAPTA-1）也能有效用于 Ca2+ 微区的成像。需要注意的是，应选用这些探针的高亲和力版本（Kd 约为 200–400 nM）来成像局部 Ca2+ 微区，且这些探针的最佳负载条件需针对每种待研究的细胞类型通过实验经验确定。由于 Ca2+ 探针本身会结合 Ca2+，因而具有 Ca2+ 缓冲作用；探针浓度过高可能干扰所记录的 Ca2+ 信号，或导致探针被隔离至细胞内细胞器中，尽管本文所述的负载条件是一个良好的起始点。总体而言，对局部 Ca2+ 事件进行...

钙离子（Ca2+）广泛调控多种生物过程，包括基因表达、分泌以及突触可塑性的持久性变化1。Ca2+ 能够以如此多样化的方式发挥作用，其机制之一在于细胞可产生不同空间和时间模式的 Ca2+ 信号。例如，细胞质中 [Ca2+] 的全局性升高可触发平滑肌组织的收缩2，而较小且局限性的瞬时升高（局部 Ca2+ 微区）则可促进对学习和记忆至关重要的基因表达3。
游离胞质[Ca2+] 在静息状态下维持在约 100 nM，但在 Ca²⁺ 内流后可迅速上升至数微摩尔2+ 进入细胞质中的 Ca2+-位于质膜上的可通透离子通道以及Ca²⁺的释放2+ 来自细胞内储存库。我们的实验室专注于研究肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R），可形成 Ca2+ 位于内质网（ER）膜上的释放通道。当IP结合后3 和 Ca2+ 到受体的胞质激活位点，IP3R通道开放以释放Ca2+ 滞留于内质网腔内。Ca²⁺的释放2+ 可能仍空间性地局限于一小簇 IP3Rs 以生成细胞质局部的 Ca 微区2+ (Ca2+ 喷雾4）或根据邻近的免疫沉淀（IP）簇的接近程度3Rs 可能通过募集多个钙火花位点，以钙信号传导的方式在细胞内传播2+诱导的 Ca2+-释放（CICR）5,6.
荧光小分子Ca指示剂的引入2+ 罗杰·蔡斯开发的指示剂染料7，结合先进的显微成像技术，极大地促进了我们对Ca2+ 信号传导。显微镜所用相机的最新进展如今已能够对瞬时局部Ca2+ 事件（如钙火花）的成像达到前所未有的空间和时间分辨率。目前可用的EMCCD相机能够以128 × 128像素进行成像 &#62;500 帧/秒-1 （fps），新一代互补金属氧化物半导体（CMOS）相机提供了更高的像素分辨率，以及更快的成像速度，但代价是噪声水平略有升高。结合全内反射（TIRF）显微镜技术，现在已能够对单个Ca2+ 通道事件8,9。该方法可同时对数百个通道/事件进行成像，同时生成大规模数据集（约 每分钟1Gb的数据量使得手动处理、视觉识别和分析变得不切实际，因而对自动化算法的开发提出了迫切需求。
此处，我们介绍用于成像局部 Ca2+ 使用荧光 Ca 指示剂在完整哺乳动物细胞中检测信号2+ 指示剂。我们进一步展示了一种在开源环境 Python 中开发的算法，该算法可自动识别和分析局部 Ca2+ 通过全内反射荧光显微镜（TIRF）和传统的宽场落射荧光显微镜（WF）成像的事件。尽管我们在IP的背景下描述这些方法3生成的 Ca2+ 信号，它们易于用于研究胞质中[Ca2+] 来源于多种Ca2+位于细胞表面膜或细胞内细胞器中的可通透离子通道8-10.

<table><tbody><tr><td>人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest 公司</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-异丙叉基-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-硝基-4,5-二甲氧基)苄基-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-肌醇 1,4,5-三磷酸六(丙氧基甲基)酯</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% 普流罗尼克 F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻底成像培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

培养的哺乳动物细胞中局部 ca2+ 信号的成像

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

细胞质 Ca2+ 离子几乎在所有细胞类型中调节着细胞活动的诸多方面，控制着从基因转录、电兴奋性到细胞增殖等广泛的生命过程。Ca²⁺的多样性和特异性2+ 信号源自Ca介导的机制2+ 信号在不同的时间和空间尺度上发挥作用，其范围从持续数分钟的全细胞振荡和波动，到局部瞬时的Ca2+ 微区（Ca2+ 持续数毫秒的钙火花）。电子倍增CCD（EMCCD）相机的最新进展现在使得局部钙信号的成像成为可能2+ 以128 × 128像素空间分辨率、在以下速率下采集信号 &#62;500 帧/秒-1 （帧/秒）。该方法具有高度并行性，可在单次实验中同时监测数百个通道或胞吐位点。然而，所产生的数据量巨大（约 每分钟1 Gb）使得局部Ca²⁺的视觉识别与分析2+ 事件变得不切实际。本文中，我们描述并演示了局部免疫沉淀（local IP）的获取、检测与分析步骤3介导的 Ca2+ 完整哺乳动物细胞中加载Ca后的信号2+ 使用宽场落射荧光（WF）和全内反射荧光（TIRF）显微镜检测指标。此外，我们介绍了一种在开源软件环境 Python 中开发的算法，该算法可自动识别和分析这些局部 Ca2+ 信号。该算法可定位 Ca2+ 以亚像素分辨率进行释放；允许用户查看数据；并以兼容 Excel 的表格形式输出荧光比率信号的时间序列，以及相应的幅度和动力学数据。

图1A 显示了负载 ci-IP3 的人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中静息状态下 Cal-520 荧光的明场（WF）图像。对这些细胞施加持续 100 毫秒的紫外光脉冲以光释放 i-IP3，可在特定位置诱导瞬时的 Ca2+ 释放“蓬松信号”（puffs）（如 图1A 中白色圆圈所示）。在这些位点测得的荧光轨迹显示，由于 IP3R 的瞬时开放，信号迅速上升，随后因 Ca2+ 从释放位点缓慢扩散而呈现显著更慢的下降相（图1B 和 图1C）。图1B 中以红色高亮的事件是算法判定为起源于所选位点的 Ca2+ 信号；未高亮的事件则代表从邻近位点扩散而来的污染性 Ca2+ 信号。
为了实现对局部 Ca2+ 信号更高分辨率的成像，可进一步用慢速 Ca<...

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

细胞质中的 Ca2+ 离子调控几乎所有细胞类型中细胞活动的多个方面，控制着从基因转录到……等一系列广泛的过程。

本实验的总体目标是演示如何利用基于相机的成像技术，在完整的哺乳动物细胞中获取、检测和分析由局部IP₃介导的钙信号。该目标通过以下步骤实现：首先将细胞培养于玻璃底培养皿中，随后加载细胞膜通透性的荧光钙离子指示剂CAL-520和笼锁型IP₃。第二步是将盖玻片放置在倒置显微镜的载物台上，并用488纳米的光照射样品，以激发钙离子敏感性荧光染料Cal five 20。接着，通过向细胞施加短暂的紫外光脉冲来诱导局部钙信号。该光解作用使IP三从其笼锁前体中释放出来，从而能够结合三磷酸肌醇受体，并介导内质网中的钙离子释放。最后一步是将图像序列导入自行编写的算法中，以启动对记录数据的自动分析。该算法最终能够以亚像素分辨率快速定位钙释放位点，允许用户审查数据，并以兼容 Excel 的格式输出荧光比值信号的时间序列以及振幅和动力学数据。这种方法可同时对数百个通道或事件进行成像，但相比传统方法会产生大量数据，这些海量数据使得手动处理、视觉识别和分析变得极为困难。本次实验操作将由我实验室的博士后 Jeff Locke 演示。开始实验前，通过将膜通透性染料 CAL 520 和 CI IP3 的储备液分别稀释至钙离子 HBSS 中，配制上样缓冲液，使其终浓度分别为 5 µM 和 1 µM。接着，吸除培养基，用钙离子 HBSS 清洗细胞 3 次。然后去除含钙的HBSS，将细胞在室温避光条件下于上样缓冲液中孵育60分钟。随后，去除上样缓冲液，并用含钙HBS溶液洗涤细胞3次，以阻断钙波，便于研究局部钙信号。接着，在室温避光条件下，将细胞在含5微摩尔EGTA am的含钙HBSS中孵育30至60分钟。孵育结束后，用含钙的HBSS缓冲液冲洗细胞三次。随后，将细胞在含钙的HBSS缓冲液中继续孵育30分钟，以使加载的试剂充分完成D酯化，此步骤应在成像前立即进行。最后一次孵育结束后，更换为新鲜的含钙HBSS缓冲液，以去除可能在孵育过程中泄漏到浴液中的染料。在此步骤中，将一滴浸油置于100 XAPO油镜物镜上。然后将成像培养皿安装在倒置显微镜的载物台上。使用透射光将细胞调至焦点。接下来，用蓝色激光照射细胞。为了激发CAL五二零，使用高速E-M-C-C-D相机收集发射的荧光。使用E-M-C-C-D软件。将成像视野从完整的 512 × 512 像素缩小，以便以必要的时间分辨率采集数据，从而捕捉局部钙信号事件。设置软件自动记录数秒的基础活动，然后向细胞施加紫外闪光，以诱发所需频率的局部钙信号事件，并继续记录 10 至 30 秒。最后，将文件保存为图像序列，用于离线分析。在此步骤中，将图像文件转换为多平面TIFF文件格式。找到包含自定义编写分析算法的文件夹，双击运行exe文件，然后选择要分析的TIFF文件。在打开的对话框中选择分析参数。通过将光标移动到视野中不含细胞的区域，或通过“设置黑平”提示手动输入黑平值，来确

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Research

科研

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Biology

生物学

成像本地CA<sup&gt; 2+</sup&gt;在培养的哺乳动物细胞信号

内质网在蛋白质生物合成和钙稳态中起关键作用。我们已建立一个实验系统，可用于研究Ca2+泄漏通道的作用，并表征其可能的调控机制。该系统包括siRNA介导的基因沉默和活细胞Ca2+成像。...

活细胞钙成像结合siRNA介导的基因沉默技术鉴定内质网膜上的Ca2+渗漏通道及其调控机制

星形胶质细胞内 Ca²⁺ 的特性与功能2+ 纹状体中的信号仍未能得到充分研究。本文描述了利用血清型2/5的腺相关病毒（AAV2/5）在纹状体星形胶质细胞中表达基因编码钙指示剂的方法，以及可靠地对钙信号进行成像的操作流程。2+ 纹状体星形胶质细胞内的信号 原位.

使用基因编码钙指示剂对成年小鼠纹状体星形胶质细胞中的细胞内 Ca2+ 信号进行成像

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。...

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca2+ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca2+ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析2+...

时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。...

局部钙信号的分离2+ 通过膜靶向Ca在培养细胞中的信号2+ 指示剂

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

当前方法描述了一种用于高分辨率、亚区室钙成像的非比率测量法 体内 在 秀丽隐杆线虫 使用 readily available 遗传编码钙离子指示剂.

神经元钙处理的亚细胞成像 在体

本方案详细描述了在清醒小鼠上丘（SC）中成像钙反应的实验流程，包括在野生型小鼠中利用双光子显微镜对单个神经元活动进行成像，同时保持皮层完整；以及在部分皮层缺失的突变型小鼠中利用宽场显微镜对整个上丘进行成像。...

小鼠上丘钙成像

本文提供了一种全面的实验方案，利用荧光显微镜检测原代小鼠和人T细胞中的初始局部Ca2+信号（即Ca2+微区）。该方案可为研究免疫细胞内Ca2+信号通路及其功能的科研人员提供重要参考。...

成像初始Ca2+微区在原代T细胞中的研究

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

学习使用荧光显微镜成像技术检测完整哺乳动物细胞中的局部IP3介导钙信号。该方法结合自动化算法分析钙释放事件，为研究钙通道病变和细胞信号传导提供高通量工具。

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca²⁺ 信号的成像

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