白消安作为骨髓抑制剂在小鼠生成稳定的高水平骨髓嵌合体

该程序的总体目标是用普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的骨髓细胞替换受体小鼠的骨髓隔室。在没有照射的情况下。这是通过首先用连续腹膜内注射骨髓抑制化合物 busalan 来调节受体小鼠来实现的。

接下来，从普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞。最后，通过尾静脉注射将供体骨髓细胞移植到条件良好的受体小鼠中。最终，从移植的小鼠中收集血液并通过流式细胞术进行分析以估计骨髓钟声的范围。

与全身照射等现有方法相比，该技术的主要优点是可以在没有全身照射的细胞毒性作用且不需要专门的设施和设备的情况下建立高度的骨髓钟声。这种方法不仅可以深入了解骨髓衍生细胞在中枢神经系统中的积累，还可以用于研究造血谱系发育、免疫生物学和白血病等研究课题。为了调节受体小鼠，根据文本方案制备稀释的白消安，并使用 IP 注射剂每天向受体小鼠施用每公斤 20 毫克。

根据机构指南对小鼠实施安乐死后，在层流罩下，用 70% 乙醇喷洒小鼠。提起腹部的皮肤，用手术剪刀从腹腔切开皮肤，沿着腿部向上延伸到支撑脚的脚踝。用力将皮肤从脚踝拉向臀部，露出腿部组织。

修剪掉股骨上的肌肉和脂肪，露出髋关节，同时轻轻拉动脚部。要伸展腿部，请将剪刀压在骨盆骨上，剪在股骨头的正上方，注意不要剪断股骨本身。为了帮助保持无菌，请用脚握住腿，用剪刀和高压灭菌器组织清洁股骨上的任何残留组织，以摩擦骨骼表面。

通过切开膝关节将股骨和胫骨分开，并将股骨放入含有 PBS 的培养皿中，在冰上孵育。接下来，通过在腓骨与胫骨连接的点切割来去除并丢弃腓骨。然后清洁胫骨。

切开红骨髓末端的胫骨，取出脚，将胫骨与股骨一起放入培养皿中，在冰上孵育。用镊子固定股骨，用手术剪刀小心地从骨头上刮掉远端。根据需要去除尽可能少的骨头，以用 3 毫升无菌 PBS 暴露髓腔。

填充注射器并连接 23 号针头。小心地将针头插入髓腔，并将骨髓冲洗到无菌培养皿中。使用针尖刮擦髓腔，以确保在提取后去除所有所需的细胞。

确保红色骨髓不再可见，并且骨骼现在显示为白色。用镊子固定胫骨，用手术剪刀小心地剃掉胫骨附着在膝盖上的一端。要暴露髓腔，请在注射器中注入 3 毫升无菌 PBS，并连接 25 号针头。

小心地将针头插入髓腔，然后将骨髓冲洗到股骨的混合骨髓培养皿中。使用 1 毫升移液器吸头，轻轻地对骨髓进行 tri 以分离细胞。将细胞悬液通过 40 微米篮式过滤器放入无菌 50 毫升离心管中。

使用 PBS 冲洗培养皿以获得任何剩余的细胞，并将缓冲液通过过滤器转移到离心管中。将 PBS 加入试管中，最终体积为 30 至 40 mL，并以 450 倍 G 和 4 摄氏度离心 5 分钟。然后取出并丢弃上清液。

用 3 mL 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，在冰上孵育 8.5 分钟。随后，加入约 30 毫升无菌 PBS 以淬灭裂解缓冲液离心机并丢弃上自然体。使用 1 毫升无菌 PBS 重新沉淀并保持在冰上。

用 PBS 稀释少量细胞匀浆，并使用血细胞计数器对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至 8 乘以 10 至每毫升 6 个细胞，并在冰上孵育直至注射。要进行骨髓移植，请将 300 微升稀释的细胞悬液添加到 0.5 毫升注射器中。

对于要注射的每只鼠标，请务必去除所有气泡。将装有条件受体小鼠的小鼠笼放在加热垫上，让侧尾静脉扩张。将受体小鼠放入适当大小的约束装置中，用浸泡有 70% 乙醇的手术纱布擦拭尾巴，牢牢握住尾巴，斜面向上，轻轻地将针头插入其中一个侧尾静脉，并注射细胞悬液。

将手术纱布放在注射部位，直到出血停止。在将小鼠引入新的干净笼子之前，在骨髓移植后大约两到三周，将小鼠放入约束管中并剃掉后腿的皮毛以露出外侧大隐静脉。接下来，在腿部涂上一层薄薄的凡士林，并使用 25 号针头用肝素涂层的毛细管刺穿大隐静脉。

收集约 50 微升血液，然后使用手术纱布止血。出血停止后，将鼠标放回笼子。将血液加入含有 1 毫升传真缓冲液的微量离心管中。

倒置混合试管并储存在冰上，以 900 倍 G 离心血样 5 分钟。去除并丢弃上清液后，使用 500 μL 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀并在冰上孵育 8.5 分钟。随后，加入 1 毫升传真缓冲液以淬灭裂解缓冲液，并以 900 倍 G 离心 5 分钟。

裂解并旋转第二次后，根据文本方案，检查沉淀现在是否为白色。如果它是红色的，请第三次重复溶出步骤。将沉淀悬浮在传真缓冲液中，并使用流式细胞术定量 GFP 阳性细胞的比例。

该图显示了每周定量的外周血中以 100 毫克/千克 busalan 为条件的小鼠接受同基因骨髓移植的小鼠和以每公斤 80 毫克 busalan 条件接受不成功的同种异体骨髓移植的小鼠的外周血中的嵌合体水平。大于 80% 的攀爬者水平通常在骨髓移植后 3 至 4 周确定，此处显示的是外周血的代表性事实数据，显示骨髓移植后 3 周骨髓移植成功和不成功。该流式细胞术数据表明，高度的钟声在骨髓中保持至少一年，并且用载体调节不足以诱导骨髓钟声。

虽然使用每公斤 60 至 100 毫克的剂量所达到的骨髓铃声水平没有显着差异，但白消安 GFP 阳性细胞以剂量依赖性方式在中枢神经系统内积累。该图说明了野生型小鼠中 GFP 阳性骨髓衍生的细胞在脊髓腰部区域内的积累，并且在更大程度上在神经退行性疾病萎缩性侧索硬化症的小鼠模型中积累。实施此程序时，重要的是使用同性别的同基因受体和供体小鼠，以尽量减少移植排斥的可能性遵循此程序。

可以利用流式细胞术和免疫组化等其他方法来研究骨髓衍生细胞进入中枢神经系统的机制。