白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定高水平骨髓嵌合体

本实验的总体目标是在不进行照射的情况下，用普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的骨髓细胞替换受体小鼠的骨髓腔室。该目标通过首先使用骨髓抑制化合物白消安对受体小鼠进行连续腹腔注射处理来实现。

接下来，从普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞。最后，通过尾静脉注射将供体骨髓细胞移植到经过预处理的受体小鼠体内。最终，采集移植后小鼠的血液，通过流式细胞术分析，以评估骨髓嵌合程度。

与全身照射等现有方法相比，该技术的主要优势在于，能够在不产生全身照射的细胞毒性作用且无需特殊设施和设备的情况下，实现高水平的骨髓嵌合。该方法不仅有助于研究骨髓来源细胞在中枢神经系统中的聚集，还可用于研究造血谱系发育、免疫生物学以及白血病等科学问题。为准备受体小鼠，应根据文本方案配制稀释的白消安，并通过腹腔注射方式每日向受体小鼠给予20毫克/千克剂量。

根据机构指南对小鼠实施安乐死后，在超净工作台内用70%乙醇喷洒小鼠。提起腹部皮肤，使用手术剪从腹腔向上沿腿部至脚踝处（握住足部）剪开皮肤。用力将皮肤从脚踝向髋部拉下，暴露腿部组织。

轻轻牵拉足部，剥离股骨上的肌肉和脂肪，暴露髋关节。为伸展下肢，将剪刀抵住骨盆，于股骨头稍上方处剪断，注意避免剪到股骨本身。为保持无菌操作，用手握住足部以固定下肢，用剪刀清除股骨上残留的组织，并用经高压灭菌的纱布擦拭骨面。

通过膝关节处剪切，分离股骨和胫骨，并将股骨置于含有PBS的培养皿中，冰上孵育。接着，在腓骨与胫骨连接处剪切，去除并弃去腓骨。然后清洁胫骨。

在红骨髓末端处剪断胫骨以去除足部，并将胫骨放入培养皿中与股骨一同置于冰上孵育。用镊子夹住股骨，使用手术剪小心削除骨的远端。尽量少去除骨组织，以充分暴露骨髓腔，随后加入3 mL无菌PBS。

用注射器吸取液体后，安装一个23号针头。小心地将针头插入髓腔，将骨髓冲洗至无菌培养皿中。使用针尖刮擦髓腔，以确保在提取后彻底去除所有目标细胞。

确保红骨髓已不可见，且骨骼现呈白色。用镊子夹住胫骨，使用手术剪小心修剪胫骨与膝关节连接的一端。为暴露骨髓腔，用注射器吸取3 mL无菌PBS，并安装一根25号针头。

小心将针头插入髓腔，并将骨髓冲洗至装有股骨骨髓混合液的培养皿中。用1毫升移液器枪头轻轻吹打骨髓，以解离细胞。将细胞悬液通过40微米筛网滤器转移至无菌的50毫升离心管中。

使用 PBS 冲洗培养皿，以收集残留的细胞，并将缓冲液通过滤膜转移至离心管中。向离心管中加入 PBS，使最终体积达到 30 至 40 毫升，在 450 ×g 及 4°C 条件下离心 5 分钟。随后移除并弃去上清液。

用3毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，在冰上孵育8.5分钟。随后加入约30毫升无菌PBS以终止裂解反应，离心并弃去上清液。用1毫升无菌PBS重悬沉淀，置于冰上保存。

用 PBS 稀释少量细胞匀浆，使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至每毫升含 8 × 10⁶ 个细胞，并置于冰上孵育直至注射。进行骨髓移植时，将 300 µL 稀释后的细胞悬液加入 0.5 mL 注射器中。

对于每只待注射的小鼠，务必去除所有气泡。将装有经处理的受体小鼠的笼子置于加热垫上，使尾部侧静脉扩张。将一只受体小鼠放入合适大小的固定装置中，用浸有70%乙醇的外科纱布擦拭尾部，牢固握住尾部，针尖斜面向上，轻柔地将针头插入一侧尾静脉，然后注入细胞悬液。

在注射部位覆盖无菌纱布，直至出血停止。在骨髓移植后约两到三周，将小鼠转移至新的清洁笼具前，将小鼠放入固定管中，剃除后肢毛发以暴露外侧隐静脉。接着，在腿部涂抹一层薄薄的凡士林，使用25号针头穿刺隐静脉，并插入经肝素包被的毛细管。

采集约 50 微升血液，然后使用外科纱布止血。待出血停止后，将小鼠放回笼中。将血液加入含有 1 毫升裂解缓冲液的微量离心管中。

轻轻颠倒混匀离心管，将血液样本置于冰上，并在900 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，加入500 µL红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，冰上孵育8.5分钟。随后，加入1 mL FACS缓冲液以终止裂解反应，再在900 × g条件下离心5分钟。

根据文本方案，在裂解并再次离心后，检查沉淀是否已变为白色。如果呈红色，则需重复裂解步骤第三次，重新悬浮。将沉淀重悬于fax缓冲液中，并使用流式细胞术定量GFP阳性细胞的比例。

该图表显示了经100毫克/千克白消安处理并成功接受同基因型骨髓移植的小鼠，以及经80毫克/千克白消安处理并接受失败的异基因型骨髓移植的小鼠，其外周血中嵌合体水平的每周定量结果。移植后三至四周，嵌合体水平通常超过80%。此处展示的是骨髓移植后三周外周血中成功与失败骨髓移植的代表性流式细胞术数据。这些流式细胞术数据表明，高水平的嵌合状态在骨髓中至少可维持一年，而仅使用载体处理不足以诱导骨髓嵌合。

尽管使用60至100毫克/千克剂量的白消安在骨髓嵌合水平上无显著差异，但GFP阳性细胞在中枢神经系统中的积累呈现剂量依赖性。该图展示了在野生型小鼠脊髓腰段区域，GFP阳性骨髓来源细胞的积聚情况，而在肌萎缩侧索硬化症这一神经退行性疾病小鼠模型中，该积累更为显著。在实施该操作时，重要的是使用同性别、同系的受体与供体小鼠，以尽量减少移植排斥的可能性。完成此操作后。

其他方法，如流式细胞术和免疫组织化学，可用于研究骨髓来源细胞进入中枢神经系统的机制。