Name: 白消安作为骨髓抑制剂在小鼠生成稳定的高水平骨髓嵌合体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 了解如何使用白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定的骨髓嵌合体。该方法无需全身照射，通过尾静脉注射移植表达绿色荧光蛋白的供体骨髓细胞，并利用流式细胞术进行嵌合度分析，适用于研究骨髓细胞在中枢神经系统中的积累动态。

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本工作得到了肌萎缩侧索硬化症研究Ronald Peter Griggs纪念奖学金（授予KP）以及加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大肌萎缩侧索硬化症协会和加拿大肌肉萎缩症协会联合资助的神经肌肉研究合作项目基金（JNM-69682，授予CK和FMR）的支持。此外，还获得了美国肌萎缩侧索硬化症协会（57969）的额外资助。我们谨向加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市BC癌症机构Terry Fox实验室/病理学系的R. Keith Humphries博士以及西蒙弗雷泽大学动物护理单元的工作人员表示感谢。

注意：伦理声明：本实验方案已通过西蒙菲莎大学动物护理委员会（UACC；许可证编号：1037K-12 和 1060K-03）的审查和批准，符合加拿大动物护理委员会、美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》以及欧洲经济共同体理事会指令的相关规定。
1. 特殊注意事项
注意：白消安具有细胞毒性。请根据材料安全数据表和机构指南进行操作和处置。
<ol>
	<li>所有操作均须在层流罩内无菌进行。</li>
	<li>使用前，将器械用适当的包装材料（如撕剥袋）包裹后高压灭菌，以实现灭菌。</li>
	<li>尽管与照射预处理相比，使用白消安预处理的感染风险较低，但在移植后的前 2 周内，仅可在层流罩内操作动物。</li>
</ol>
2. 受体小鼠的预处理
<ol>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将白消安稀释至 3 mg/ml。 
	注意：每次注射前均需在当日现配异环磷酰胺的稀释液。</li>
	<li>通过腹腔注射，每天向受体小鼠给予 20 mg/kg 的稀释白消安。</li>
	<li>每日腹腔注射20 mg/kg白消安，直至总剂量达到60-100 mg/kg（即， 对于80 mg/kg的总剂量，需连续4天每天给予20 mg/kg的白消安。</li>
</ol>
3. 供体骨髓细胞的分离
注意：本方案已成功用于从最多5只供体小鼠中分离和制备骨髓细胞。通常每只小鼠的细胞产量约为3000万至4000万个骨髓来源树突状细胞（BMDCs），足以移植到12至16只受体小鼠。如果需要使用更多的供体小鼠，则可能需要相应调整方案。
<ol>
	<li>在白消安预处理的最后一天，使用 CO2（或机构认可的其他安乐死方法）处死一只 GFP 供体小鼠（年龄为 1 至 6 个月）。为避免移植物并发症，应使用与受体同品系且性别相同的供体小鼠。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠。提起腹部皮肤，使用手术剪从腹腔向上沿腿部向脚踝方向剪开皮肤。握住脚部，用力将皮肤从脚踝向髋部拉，以暴露腿部组织。</li>
	<li>修剪股骨周围的肌肉和脂肪组织，暴露髋关节。</li>
	<li>轻轻拉住脚部以伸展腿部，将手术剪紧贴髋关节，剪断股骨头近端上方部位，注意不要切断股骨本身。</li>
	<li>为保持无菌，用手握住脚部，用已灭菌的纱布擦拭骨表面，清除残留组织。</li>
	<li>通过剪开膝关节分离股骨和胫骨，将股骨放入含有无菌 PBS 的培养皿中，置于冰上孵育。</li>
	<li>在腓骨与胫骨连接处剪断，移除并丢弃腓骨。将胫骨放入与股骨相同的无菌培养皿中，置于冰上孵育。</li>
	<li>对另一条腿重复步骤 3.2–3.7，如有需要，可使用额外的供体小鼠。在取出所有骨骼后，使用高温珠灭菌器对手术器械进行灭菌&#160;，或在后续步骤中使用一套新的无菌器械。</li>
	<li>对于股骨，用镊子夹住股骨，用手术剪小心“削去”远端末端，尽可能少地去除骨组织以暴露骨髓腔。</li>
	<li>用 3 ml 无菌 PBS 充满注射器，并安装 23 G&#160;针头。小心将针头插入骨髓腔，将骨髓冲洗至无菌培养皿中。务必用针尖刮擦髓腔内壁，以确保所有目标细胞均被释放。提取完成后，应确认红色骨髓已不可见，骨组织呈白色。</li>
	<li>对后续的股骨重复步骤 3.9–3.10，将所有骨髓收集至同一培养皿中。</li>
	<li>对于胫骨，用镊子夹住胫骨，小心“削去”原与膝关节相连的一端，以暴露骨髓腔。在可见红色骨髓终止处沿骨再作第二处切割。</li>
	<li>用 3 ml 无菌 PBS 充满注射器，并安装 25 G&#160;针头。轻轻将针头从原与膝关节相连的一端插入骨髓腔，将骨髓冲洗至含有股骨骨髓的培养皿中。用针头刮擦骨髓腔壁，以清除所有细胞。提取完成后，应确认红色骨髓已不可见，骨组织呈白色。</li>
	<li>对后续的胫骨重复步骤 3.12–3.13，将所有骨髓收集至同一培养皿中。</li>
	<li>用 1 ml 移液器吸头轻轻吹打骨髓，以解离细胞。</li>
	<li>将细胞悬液通过 40 μM 滤网过滤至无菌 50 mL 离心管中。用 PBS 冲洗培养皿，收集残留细胞，并将冲洗液一同通过滤网转移至离心管。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 3 ml 红细胞裂解液中，在冰上孵育 8.5 分钟。</li>
	<li>加入约 30 ml 无菌 PBS 以终止裂解反应。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 ml 无菌 PBS 中，置于冰上保存。</li>
	<li>取少量细胞匀浆，用 PBS 稀释（1 只小鼠按 1:100 稀释，2 只小鼠按 1:200 稀释，依此类推），使用血细胞计数板定量细胞数量。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至 8 × 106 细胞/ml，并在冰上孵育直至注射。</li>
</ol>
4. 骨髓移植
<ol>
	<li>为每只待注射的小鼠，用0.5 ml注射器（配28 G&#160;胰岛素针头）吸取300 μl稀释后的细胞悬液。务必排除注射器中任何气泡。</li>
	<li>将装有经处理的受体小鼠的鼠笼置于加热垫上，使尾静脉扩张。</li>
	<li>取出一只受体小鼠，放入固定装置中。用浸有70%乙醇的外科纱布擦拭尾部。</li>
	<li>牢固握住尾部，针尖斜面向上，轻柔地将针头插入一侧尾静脉，并注入细胞悬液。</li>
	<li>注射完成后，用外科纱布按压注射部位直至出血停止，再将小鼠放入新的清洁鼠笼中。</li>
</ol>
5. 估算骨髓嵌合体的程度
注意：移植后1周，外周血中的嵌合水平通常存在变异性，因此嵌合水平一般需在移植后至少2周进行评估。移植后3至4周内，外周血中嵌合水平应达到&#62;80%的GFP+细胞。
<ol>
	<li>配制 FACS 缓冲液（PBS 中含 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清）。 
	注意：FACS 缓冲液可在 4 °C 下保存数周。</li>
	<li>将小鼠放入固定管中，剃除后肢后侧的毛发以暴露外侧隐静脉。</li>
	<li>在腿部薄涂一层凡士林，用 25 G&#160;针头穿刺隐静脉。</li>
	<li>用肝素包被的毛细管收集约 50 μl 血液。将血液加入含有 1 ml FACS 缓冲液的微量离心管中。轻轻颠倒混匀后置于冰上保存。</li>
	<li>在小鼠放回笼子前，于注射部位覆盖外科纱布直至出血停止。</li>
	<li>将血液样本以 900 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。</li>
	<li>用 500 μl 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。冰上孵育 8.5 分钟。</li>
	<li>加入 1 ml FACS 缓冲液以终止裂解反应。</li>
	<li>将样本以 900 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。</li>
	<li>在 500 μl 红细胞裂解缓冲液中进行第二次裂解。冰上孵育 8.5 分钟。</li>
	<li>加入 1 ml FACS 缓冲液以终止裂解反应。</li>
	<li>将样本以 900 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。检查沉淀是否已变为白色。 
	注意：如果沉淀仍呈红色，在进入下一步前可能需要额外进行一次裂解步骤。</li>
	<li>用 1 ml FACS 缓冲液重悬沉淀。将样本以 900 × g 离心 5 分钟。移除并弃去上清液。</li>
	<li>用 300 μl FACS 缓冲液重悬沉淀，并通过流式细胞术定量 GFP+ 细胞（注意：在此步骤之后、流式细胞分析之前，可根据需要使用标准技术对细胞进行免疫染色）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

白消安预处理可使小鼠产生高水平的骨髓嵌合，其造血细胞易于检测。该预处理无需使用辐照设备即可完成。此外，本方案所述剂量的白消安所致的骨髓抑制耐受性良好，可最大限度减少清髓性辐照剂量引起的毒性副作用，因此可能更适合用于对清髓性辐照更为敏感的幼龄、老龄或患病小鼠的骨髓嵌合体构建。一些非清髓性移植（RIC）方案采用低剂量、非清髓性的全身照射以减轻不良反应，但这些方案仍需依赖辐照设施，且根据照射剂量的不同，所获得的嵌合水平可能低于白消安预处理所能达到的程度13。近期，也已有研究使用曲奥舒凡进行骨髓预处理8,14。与白消安类似，曲奥舒凡预处理联合骨髓移植（BMT）也能在小鼠骨髓中实现高度嵌合14。然而，曲奥舒凡在北美地区不易获得，且为达到与白消安相当的嵌合水平，所需曲奥舒凡剂量显著高于白消安（约5–10倍）14。此外，在这些有效剂量下，曲奥舒凡在小鼠中表现出的毒性副作用似乎较白消安更为明显（K. Peake, J. Manning, 和 C. Krieger，未发表观察结果）。外周血嵌合亦可通过构建连体小鼠模型实现，该方法通过外科手术将受体小鼠与供体小鼠的血液循...

近年来，人们对小胶质细胞以及骨髓（BM）来源细胞（BMDCs）在中枢神经系统（CNS）中的作用产生了广泛兴趣，无论是在疾病状态下还是在正常衰老过程中均如此。小胶质细胞作为CNS的固有免疫细胞，目前已被证实是在胚胎发生期间由原始髓系前体细胞进入CNS后发育形成的。1小胶质细胞在其成年期仍保留着骨髓单核细胞系的某些特征。尽管有证据表明，在健康成年动物中，骨髓来源细胞对小胶质细胞群体的贡献极小1，骨髓来源树突状细胞（BMDCs）在多种神经退行性疾病进展中所起的作用仍不明确。这一不确定性因以下事实而加剧：目前尚无普遍认可的免疫组织化学标志物可用于区分在中枢神经系统（CNS）内积聚的BMDCs与内源性常驻小胶质细胞，因而难以鉴别二者。为了实现对BMDCs的监测 体内我们采用一种骨髓移植（BMT）方案，将受体小鼠内源性骨髓细胞替换为供体小鼠的骨髓细胞，后者在β-actin启动子调控下普遍表达绿色荧光蛋白（GFP）。该方案可通过免疫组织化学方法确定受体小鼠体内GFP+骨髓来源细胞（BMDCs）的定位与形态，并可通过荧光激活细胞分选（FACS）进一步分离这些细胞，继而开展后续生物化学检测。 
为了成功进行骨髓移植（BMT），需要清除受体的骨髓（BM）细胞（称为骨髓消融），以在受体骨髓内产生微环境空间，从而允许供体细胞植入。通常通过全身γ射线照射实现骨髓消融，该方法可诱导DNA双链断裂，导致细胞死亡，尤其影响活跃分裂的细胞，如造血祖细胞2,3。照射方案的设计旨在诱导足够的骨髓细胞死亡，若受体动物未能通过BMT获得充分的供体细胞植入，则会导致动物死亡（即所谓“致死性照射”）。然而，照射需要专门的设施和设备，以及并非所有研究机构都具备的兽医和动物饲养资源。此外，骨髓消融性照射可能对其他组织造成潜在致命性损伤，并且由于免疫抑制，照射后的动物更易发生继发性感染3。因此，已开发出减低强度的预处理方案（即所谓“RIC”方案），旨在尽量减少预处理方案在患者中可能产生的毒性副作用，尤其适用于儿童和老年人等高风险人群4。
某些 RIC 方案依赖于白消安等化疗药物来对骨髓腔室进行预处理。白消安是一种双功能 DNA 烷基化试剂，临床上常作为放疗的替代方案5,6。值得注意的是，白消安可通过腹腔（IP）注射安全地给予小鼠，且无需放疗小鼠所需的特殊设施和设备。在本实验室中，白消安预处理已被广泛使用7，并在其他多项近期研究中得到应用8–11。当使用 60–100 mg/kg 剂量时，可在外周血和骨髓中建立高水平的稳定嵌合状态（>80% GFP+ 细胞）7。重要的是，在此剂量下，骨髓消融并不完全，因此小鼠无需接受支持性骨髓细胞即可存活（K. Peake, J. Manning, C. Lewis, 和 C. Krieger，未发表观察结果）。此外，在骨髓抑制性的白消安预处理条件下，供体细胞可迅速重建外周血中的髓单核细胞。然而，外周血淋巴细胞被供体细胞取代的过程较慢，这凸显了与全身照射相比，60–100 mg/kg 剂量的白消安缺乏免疫抑制作用7。
我们已成功利用白消安诱导的嵌合体来研究野生型小鼠以及肌萎缩侧索硬化症（ALS）7和阿尔茨海默病等神经退行性疾病小鼠模型中的骨髓来源细胞（BMDCs）。已有观察表明，在特定条件下，大量表达GFP的BMDCs可在中枢神经系统（CNS）中积聚7,12。重要的是，与采用照射进行清髓性预处理类似，经白消安预处理后进行骨髓移植（BMT），足以使GFP阳性BMDCs在野生型小鼠及神经系统疾病小鼠的中枢神经系统内发生积聚7–11。由于治疗神经退行性疾病的主要障碍之一是难以将治疗性分子从循环系统递送至中枢神经系统以发挥有益作用，这提示了一种可能性：即可以对BMDCs进行基因改造以表达治疗性分子，并将其作为载体，将治疗剂递送至经白消安预处理受体的中枢神经系统，这一机制目前正在被我们深入研究。尽管我们发现，与白消安预处理相比，采用照射进行清髓性预处理可在中枢神经系统中诱导更高水平的GFP阳性BMDCs积聚7，但照射在神经退行性疾病患者及中枢神经系统疾病小鼠模型中可能具有显著的毒性。
尽管我们以及许多其他研究者已采用骨髓移植（BMT）模型来研究神经退行性疾病中的骨髓来源细胞（BMDCs），但将受体小鼠的骨髓腔几乎完全替换为可明确识别的骨髓细胞群体，是研究造血系统多个方面的宝贵工具。这涵盖了一系列广泛的研究领域，包括造血谱系发育、白血病、器官移植、移植物抗宿主病以及免疫生物学。

<table><tbody><tr><td>白消安注射液（Busulfex）</td><td>Otsuka Canada Pharmaceutical Inc.</td><td>DIN 02240602</td><td>使用前用无菌 PBS 将白消安（busulfan）稀释至 3 mg/mL。白消安具有细胞毒性，应按照化学品安全技术说明书（MSDS）及机构指南进行操作和处置。</td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液（ACK Lysing Buffer）</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>可使用其他裂解缓冲液替代，但孵育时间可能需要相应调整</td></tr><tr><td>胎牛血清（Fetal Bovine Serum）</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr></tbody></table>

白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定高水平骨髓嵌合体

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

骨髓移植（BMT）常用于将受体小鼠的骨髓（BM）腔室替换为来自供体小鼠、表达特定生物标志物的骨髓细胞。该技术可识别受体小鼠体内来源于供体的造血细胞，并可用于通过多种生物化学技术分离和表征供体细胞。传统的BMT通常依赖全身照射进行清髓性预处理，以在受体小鼠的骨髓腔室内创造生态位空间，供供体细胞植入。本文所述方案则采用化疗药物白消安进行骨髓抑制性预处理。与需要特殊设施的照射处理不同，白消安预处理通过腹腔注射给药，每次20 mg/kg，直至总剂量达到60–100 mg/kg。此外，清髓性照射可能产生毒性副作用，并要求供体细胞成功植入以维持受体小鼠存活；相比之下，采用该剂量范围的白消安预处理通常耐受性良好，小鼠可在无供体细胞支持的情况下存活。供体骨髓细胞从小鼠股骨和胫骨中分离获得，这些小鼠全身性表达绿色荧光蛋白（GFP），随后将细胞注射至经预处理的受体小鼠尾侧静脉。骨髓嵌合水平通过BMT后外周血中GFP+细胞数量的定量来评估。移植后3–4周，外周血中通常可观察到嵌合水平&nbsp;>80%，且该状态可稳定维持至少1年。与照射预处理类似，白消安预处理联合BMT亦可使供体骨髓来源的细胞在中枢神经系统（CNS）中聚集，尤其在神经退行性疾病小鼠模型中更为明显。相较于全身照射，白消安介导的CNS细胞聚集可能更具生理相关性，因为白消安处理毒性较低，且中枢神经系统炎症反应较轻。我们推测，这些细胞可经基因工程改造，用于向中枢神经系统递送治疗性分子。

给予小鼠60-100 mg/kg剂量的白消安通常耐受性良好。然而，动物在预处理阶段通常会出现体重下降（约5-10%），因此可能需要通过添加辐照葵花籽等零食来补充饮食，以促进进食。使用60-100 mg/kg白消安，应能稳定实现外周血和骨髓中>80%的GFP+细胞嵌合水平7。本实验室已成功利用该方案构建了100多只外周血和骨髓中GFP+细胞比例>80%的嵌合小鼠，在使用同基因型供体与受体的情况下，几乎所有骨髓移植（BMT）均获得成功。图1展示了经100 mg/kg白消安处理并成功接受同基因型BMT的小鼠（n = 3）以及经80 mg/kg白消安处理但BMT失败的异基因型移植小鼠（n = 3）外周血中嵌合水平的每周定量结果。通常在BMT术后3-4周内即可建立>80%的嵌合水平。图2为显示成功与失败BMT的外周血代表性流式细胞术（FACS）数据。图3表明，该嵌合状态在骨髓中至少可维持一年（n = 3），而仅使用溶剂对照进行预处理不足以诱导骨髓嵌合（n = 3）。尽管使用60-100 mg/kg白消安剂量所达到的骨髓嵌合水...

我们描述了一种通过白消安预处理使受体小鼠的骨髓被普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠骨髓细胞所替代的实验方案，该方法无需进行照射。该技术可用于研究骨髓细胞在中枢神经系统中的聚集情况。

骨髓移植（BMT）常用于用表达不同……的骨髓（BM）细胞替代受体小鼠的骨髓（BM）腔室

本实验的总体目标是在不进行照射的情况下，用普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的骨髓细胞替换受体小鼠的骨髓腔室。该目标通过首先使用骨髓抑制化合物白消安对受体小鼠进行连续腹腔注射处理来实现。接下来，从普遍表达绿色荧光蛋白的供体小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞。最后，通过尾静脉注射将供体骨髓细胞移植到经过预处理的受体小鼠体内。最终，采集移植后小鼠的血液，通过流式细胞术分析，以评估骨髓嵌合程度。与全身照射等现有方法相比，该技术的主要优势在于，能够在不产生全身照射的细胞毒性作用且无需特殊设施和设备的情况下，实现高水平的骨髓嵌合。该方法不仅有助于研究骨髓来源细胞在中枢神经系统中的聚集，还可用于研究造血谱系发育、免疫生物学以及白血病等科学问题。为准备受体小鼠，应根据文本方案配制稀释的白消安，并通过腹腔注射方式每日向受体小鼠给予20毫克/千克剂量。根据机构指南对小鼠实施安乐死后，在超净工作台内用70%乙醇喷洒小鼠。提起腹部皮肤，使用手术剪从腹腔向上沿腿部至脚踝处（握住足部）剪开皮肤。用力将皮肤从脚踝向髋部拉下，暴露腿部组织。轻轻牵拉足部，剥离股骨上的肌肉和脂肪，暴露髋关节。为伸展下肢，将剪刀抵住骨盆，于股骨头稍上方处剪断，注意避免剪到股骨本身。为保持无菌操作，用手握住足部以固定下肢，用剪刀清除股骨上残留的组织，并用经高压灭菌的纱布擦拭骨面。通过膝关节处剪切，分离股骨和胫骨，并将股骨置于含有PBS的培养皿中，冰上孵育。接着，在腓骨与胫骨连接处剪切，去除并弃去腓骨。然后清洁胫骨。在红骨髓末端处剪断胫骨以去除足部，并将胫骨放入培养皿中与股骨一同置于冰上孵育。用镊子夹住股骨，使用手术剪小心削除骨的远端。尽量少去除骨组织，以充分暴露骨髓腔，随后加入3 mL无菌PBS。用注射器吸取液体后，安装一个23号针头。小心地将针头插入髓腔，将骨髓冲洗至无菌培养皿中。使用针尖刮擦髓腔，以确保在提取后彻底去除所有目标细胞。确保红骨髓已不可见，且骨骼现呈白色。用镊子夹住胫骨，使用手术剪小心修剪胫骨与膝关节连接的一端。为暴露骨髓腔，用注射器吸取3 mL无菌PBS，并安装一根25号针头。小心将针头插入髓腔，并将骨髓冲洗至装有股骨骨髓混合液的培养皿中。用1毫升移液器枪头轻轻吹打骨髓，以解离细胞。将细胞悬液通过40微米筛网滤器转移至无菌的50毫升离心管中。使用 PBS 冲洗培养皿，以收集残留的细胞，并将缓冲液通过滤膜转移至离心管中。向离心管中加入 PBS，使最终体积达到 30 至 40 毫升，在 450 ×g 及 4°C 条件下离心 5 分钟。随后移除并弃去上清液。用3毫升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，在冰上孵育8.5分钟。随后加入约30毫升无菌PBS以终止裂解反应，离心并弃去上清液。用1毫升无菌PBS重悬沉淀，置于冰上保存。用 PBS 稀释少量细胞匀浆，使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至每毫升含 8 × 10⁶ 个细胞，并置于冰上孵育直至注射。进行骨髓移植时，将 300 µL 稀释后的细胞悬液加入 0.5 mL 注射器中。对于每只待注射的小鼠，务必去除所有气泡。将装有经处理的受体小鼠的笼子置于加热垫上，使尾部侧静脉扩张。将一只受体小鼠放入合适大小的固定装置中，用浸有70%乙醇的外科纱布擦拭尾部，牢固握住尾部，针尖斜面向上，轻柔地将针头插入一侧尾静脉，然后注入细胞悬液。在注射部位覆盖无菌纱布，直至出血停止。在骨髓移植后约两到三周，将小鼠转移至新的清洁笼具前，将小鼠放入固定管中，剃除后肢毛发以暴露外侧隐静脉。接着，在腿部涂抹一层薄薄的凡士林，使用25号针头穿刺隐静脉，并插入经肝素包被的毛细管。采集约 50 微升血液，然后使用外科纱布止血。待出血停止后，将小鼠放回笼中。将血液加入含有 1 毫升裂解缓冲液的微量离心管中。轻轻颠倒混匀离心管，将血液样本置于冰上，并在900 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，加入500 µL红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，冰上孵育8.5分钟。随后，加入1 mL FACS缓冲液以终止裂解反应，再在900 × g条件下离心5分钟。根据文本方案，在裂解并再次离心后，检查沉淀是否已变为白色。如果呈红色，则需重复裂解步骤第三次，重新悬浮。将沉淀重悬于fax缓冲液中，并使用流式细胞术定量GFP阳性细胞的比例。该图表显示了经100毫克/千克白消安处理并成功接受同基因型骨髓移植的小鼠，以及经80毫克/千克白消安处理并接受失败的异基因型骨髓移植的小鼠，其外周血中嵌合体水平的每周定量结果。移植后三至四周，嵌合体水平通常超过80%。此处展示的是骨髓移植后三周外周血中成功与失败骨髓移植的代表性流式细胞术数据。这些流式细胞术数据表明，高水平的嵌合状态在骨髓中至少可维持一年，而仅使用载体处理不足以诱导骨髓嵌合。尽管使用60至100毫克/千克剂量的白消安在骨髓嵌合水平上无显著差异，但GFP阳性细胞在中枢神经系统中的积累呈现剂量依赖性。该图展示了在野生型小鼠脊髓腰段区域，GFP阳性骨髓来源细胞的积聚情况，而在肌萎缩侧索硬化症这一神经退行性疾病小鼠模型中，该积累更为显著。在实施该操作时，重要的是使用同性别、同系的受体与供体小鼠，以尽量减少移植排斥的可能性。完成此操作后。其他方法，如流式细胞术和免疫组织化学，可用于研究骨髓来源细胞进入中枢神经系统的机制。

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白消安作为骨髓抑制剂在小鼠生成稳定的高水平骨髓嵌合体

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

本方案描述了一种无需处死小鼠即可进行股骨骨髓（BM）连续取样的操作流程。该方法可支持对小鼠骨髓组成进行长期的纵向研究，并能够连续获取骨髓内的细胞，用于离体（ex...

活体小鼠股骨骨髓穿刺

目前对于疫苗的作用机制总体上仍缺乏深入了解。本文提出结合反向遗传学与骨髓嵌合小鼠模型，以深入研究疫苗诱导的早期宿主免疫应答，特别关注树突状细胞与T细胞免疫反应。...

在嵌合小鼠模型中通过鼻内给予重组流感疫苗以研究黏膜免疫

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利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方案描述了生成具有自发性自身免疫生发中心的混合型小鼠骨髓嵌合体的方法，其中自身反应性淋巴细胞携带一种光激活型绿色荧光蛋白（PA-GFP）报告基因。该系统能够将组织中细胞的定位与后续的分子及功能分析相联系。...

通过光激活在混合嵌合型自身免疫模型中探究单个自身反应性生发中心

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

我们描述了三种骨髓移植（BMT）方法：全身照射骨髓移植、屏蔽照射骨髓移植以及无预处理的骨髓移植方法（过继性BMT），用于小鼠模型中克隆性造血的研究。...

小鼠骨髓移植操作用于克隆性造血研究

本文描述了一种利用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植模型，作为评估和监测靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞相关毒性的策略。...

利用急性淋巴细胞白血病患者来源的异种移植小鼠模型评估嵌合抗原受体T细胞相关毒性

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利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

体内骨类器官法用于获取治疗性造血干细胞/祖细胞

了解如何使用白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定的骨髓嵌合体。该方法无需全身照射，通过尾静脉注射移植表达绿色荧光蛋白的供体骨髓细胞，并利用流式细胞术进行嵌合度分析，适用于研究骨髓细胞在中枢神经系统中的积累动态。

白消安作为骨髓抑制剂在小鼠中建立稳定高水平骨髓嵌合体

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