Name: 在人类疾病中使用大纪元无线传输系统的小型啮齿动物模型的长期连续监测脑电图 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习在啮齿动物模型中使用无线脑电图传输系统进行长期连续监测的方法。该技术可实现长达六个月的高质量癫痫研究记录，减少有线系统带来的伪影和压力。

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本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所 R43/R44 NS064661 项目资助。

遵循机构关于动物护理的指南进行手术器械灭菌，并根据需要修改方案，以符合相关指南要求，并获得您所在机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1.&#160;手术准备
<ol>
	<li>清洁并准备发射器，以确保手术安全和无菌。将发射器从防静电包装中取出，使用70%乙醇喷洒或浸泡。用无菌生理盐水冲洗发射器，并将其置于浸有无菌生理盐水的无菌棉垫之间，或保持其完全浸没在无菌生理盐水中。</li>
	<li>收集并灭菌手术所需器械；采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。手术器械列表请见材料与试剂表。</li>
</ol>
2. 外科植入术
<ol>
	<li>麻醉动物，并根据IACUC批准的方案维持麻醉。在手术开始时及手术过程中，每15分钟检查一次足趾夹捏反射。无反应表明麻醉深度足够。
	<ol>
		<li>对于幼鼠，使用异氟烷（4%）与氧气混合进行麻醉2 （100%）。对于成年动物，使用氯胺酮（100 mg/kg）联合赛拉嗪（10 mg/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定立体定位仪框架中的位置。将耳棒尖端插入外耳道。不要过度拧紧耳棒，因为幼鼠颅骨非常柔软。固定麻醉鼻罩。
	<ol>
		<li>手术过程中，将动物置于设定为 37 °C 的加热垫上以保持体温。对于成年动物，需在眼睛上涂抹润滑眼膏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消毒切口部位并保持无菌手术区域。
	<ol>
		<li>用70%乙醇和碘伏交替擦拭头皮，从头皮中央开始，逐渐向外做越来越大的同心圆。</li>
		<li>用手术巾覆盖动物，并在覆盖后的动物上进行手术。通过使用无菌手术巾铺设手术区域，并用70%乙醇喷洒设备，以维持无菌手术环境。</li>
		<li>穿戴无菌外科手套和手术衣（或根据机构要求穿戴）。为协助维持无菌区域，应使用手术助手。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在动物头部两眼稍后处沿中线做一长约2厘米的皮肤切口。使用手术刀时需格外小心，因幼鼠颅骨仍较柔软。应作单一切口以减少出血并促进更快愈合。</li>
	<li>暴露颅骨。准备一个清洁干燥的区域，以最大限度地增强发射器与颅骨之间的结合力。使用动脉瘤夹夹住头皮。
	<ol>
		<li>轻轻从四个角将头皮从中线处剥离。观察颅骨上的解剖标志，例如前囟（bregma）和后囟（lambda）。请注意，此年龄段动物的颅骨骨缝尚未融合。使用Paxinos立体定位坐标图谱确定钻孔的准确位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Dremel型工具配合球钻钻头，在期望的记录位置钻出两个直径大于300 µm的钻孔。将参考电极的钻孔位置置于颅骨λ点后方的小脑区域上方。</li>
	<li>确保发射器上的导线与颅骨钻孔位置对齐。如果电极导线未对齐，很可能污染电极的胶水，从而导致信号质量下降。为对齐导线，请检查发射器的安装位置，并轻轻弯曲电极，使其与预定的颅骨钻孔位置对齐。</li>
	<li>修剪电极导线。使用手术剪将电极修剪至所需长度。电极插入深度对于实验所需的记录类型至关重要（即，将电极置于硬脑膜上方以记录脑电图，或使用立体定位坐标针对特定脑结构进行操作。</li>
	<li>在发射器底部均匀涂抹氰基丙烯酸酯，覆盖整个区域，注意避免涂到电极上。氰基丙烯酸酯胶水为电绝缘体，若电极被胶水污染，将导致无信号输出。
	<ol>
		<li>若记录深部脑区结构，将发射器安装至套管固定器上，并将其置于立体定位仪的Z轴控制臂中。通过立体定位仪将发射器下降至适当深度，并在发射器周围涂抹氰基丙烯酸酯凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在放置发射器前彻底干燥颅骨，以确保粘合剂形成牢固的粘结。将涂有氰基丙烯酸酯的发射器贴附到颅骨上，注意使电极与相应的颅骨钻孔对齐。
	<ol>
		<li>尽量避免损伤主要血管结构。将发射器轻轻按压固定在位，持续一分钟。施加轻微压力，使发射器与颅骨之间形成牢固结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在发射器与颅骨界面处涂抹额外的氰基丙烯酸酯，用量应足以完全密封该界面。为确保贴合良好且粘结牢固，需尽量增大胶水与颅骨接触的表面积。围绕发射器周围环形涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂，确保颅骨和发射器壁均被覆盖。</li>
	<li>通过注射器将化学促凝剂（0.1 ml）滴加在植入式发射器基部周围的氰基丙烯酸酯周围。促凝剂应少量使用，注意避免接触邻近组织。 
	注意：使用化学加速剂可加快氰基丙烯酸酯的固化，确保发射器与颅骨之间快速形成牢固结合。氰基丙烯酸酯加速剂有助于加快粘合剂的固化速度，但并非必需。</li>
	<li>用无菌生理盐水彻底冲洗该区域以去除促凝剂。若未将促凝剂从切口区域冲洗干净，氰基丙烯酸酯促凝剂可能引起组织刺激。冲洗时，用1.0 ml注射器吸取无菌生理盐水，并通过注射器针头对该区域进行灌洗。通常0.5 ml生理盐水足以将促凝剂冲洗干净。</li>
	<li>在发射器基部周围缝合皮肤，但不要覆盖发射器。发射器顶部必须暴露在皮肤表面以上，以有效传输神经信号。皮肤应紧贴发射器及其周围的胶水，保持适当张力。对于幼龄动物，应使用Vicryl或丝线（软质缝线），因其皮肤较柔软，若未使用软质缝线易受损伤；对于成年动物，可使用任何合适的缝合材料。</li>
	<li>将动物从立体定位仪中取出，置于加热毯上恢复。</li>
	<li>确保动物保持温暖（37 °C）且可自主活动（即，完全恢复）后再放回母鼠笼中。通过捏起动物背部的皮肤来检查其是否脱水（若动物脱水，皮肤会保持变形状态）。如果动物脱水，应皮下注射乳酸林格氏液。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
	<ol>
		<li>为动物注射布托啡诺（0.05 mg/kg）以进行术后镇痛，并在注射部位周围皮下注射0.1 ml布比卡因。 
		注意：对于此年龄段（出生后第6天）的动物，整个操作过程应从开始到结束在5-10分钟内完成。对于年龄较大的动物，手术时间可能更长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 护理与饲养
注意：部分母鼠可能无法耐受植入设备的幼鼠。应选择能够耐受的母鼠。母鼠通过抓住发射器来移动幼鼠在笼内的位置是可以接受的。
<ol>
	<li>动物断奶后，应单独饲养，以避免被同笼动物移除设备。</li>
	<li>当动物出现痛苦迹象时，使用戊巴比妥钠致死剂量（25 mg/kg）或异氟烷（置于钟形罐中）实施安乐死。</li>
	<li>注意，某些带有金属丝插件的动物饲养笼可能会干扰植入式发射器的正常工作。&#160; 请务必检查金属丝插件的高度，确保动物不会将发射器卡在金属丝插件的“栏杆”之间。&#160; 如有需要，请咨询兽医寻求帮助。</li>
</ol>
4. 记录脑电图
<ol>
	<li>将动物单独饲养在笼中，或与同窝幼崽及母鼠共同饲养。但每个笼子中只能放置一只植入设备的动物。幼崽在记录舱内单独停留时间不得超过2小时。需监测动物是否出现痛苦或脱水迹象。</li>
	<li>将配套电源连接至接收器底座，并确认电源指示灯亮起。使用（BNC，即Bayonet Neil-Concelman）电缆将接收器底座连接至数据采集系统。</li>
	<li>将动物笼置于接收器底座上方（图2）。此时“信号”灯应亮起，表示已检测到发射器。现在可以开始记录数据。</li>
	<li>为记录数据，需将接收器底座连接至模数转换器，并将转换器连接至计算机（图1）。</li>
	<li>设置记录的采样率。确保数据被正确采样。记录时采样率应至少设置为250 Hz（推荐500 Hz）（发射器带宽为0.1–100 Hz）。</li>
	<li>保存数字化数据，并使用Matlab等信号处理软件包进行分析。</li>
</ol>
5. 脑电图分析 - 概述
<ol>
	<li>执行快速傅里叶变换（FFT），将时间域的脑电图（EEG）数据转换为0-100 Hz频率域的数据。</li>
	<li>基于Welch方法，使用256个Hann窗分段对FFT结果进行功率谱密度（PSD）估计，并以10 × log10(PSD)进行归一化。功率谱显示在目标时间段内主导EEG信号的特定频率成分。</li>
	<li>通过取每只动物在时间匹配处理条件下的PSD均值，将数据按动物分组。通过1.96 ×&#160;均值(PSD)/n的平方根计算95%置信区间，其中n为动物数量（PSD轨迹数）。绘制均值及95%置信区间，以生成跨动物队列EEG全频段内容的定量报告，例如用于比较处理组与对照组。</li>
</ol>
6. 围产期缺氧-缺血（HI）模型方案
<ol>
	<li>将 P6 - 7 天大的幼鼠置于麻醉箱（连接麻醉蒸发器供气）中，使用异氟烷麻醉（4% 异氟烷与 100% O2 混合）进行麻醉。在麻醉开始及手术过程中，每 15 分钟检查一次足趾夹捏反射。若无反应，则表明麻醉深度足够。</li>
	<li>将幼鼠仰卧位放置，暴露颈部，并交替使用 70% 乙醇和 10% 碘伏进行皮肤消毒。重复乙醇/碘伏消毒 3 次。</li>
	<li>使用剪刀在颈部正中线处做一长约 1 cm 的皮肤切口。用镊子提起皮肤后，用剪刀进行剪开。注意切口时避免损伤肌肉组织。</li>
	<li>采用钝性分离技术暴露颈动脉。进行钝性分离时，使用两把钝头镊子，将镊尖插入组织中，利用手术器械的弹簧张力将组织分开。重复操作直至暴露颈动脉。通过观察其鲜红色外观及可见搏动来确认颈动脉。</li>
	<li>使用钝头镊子将颈动脉与迷走神经分离。将钝头镊子插入动脉与神经之间，松开镊子，利用器械的弹簧作用使颈动脉与迷走神经分开。</li>
	<li>在颈动脉上放置两个相距 4–5 mm 的动脉瘤夹。操作时避免快速移动，以防夹子损伤动脉。</li>
	<li>在两个动脉瘤夹之间电凝灼断颈动脉。进行电凝时，用加热的电灼头接触夹子之间的动脉。切断动脉后，确保两端均充分电凝，以防止出血。</li>
	<li>移除动脉瘤夹，用 3 针缝合颈部切口。仅缝合皮肤，注意避免缝到肌肉组织。</li>
	<li>让动物恢复 1 小时。密切观察动物的呼吸情况及颈部是否有出血。若存在出血，则不应将该动物用于后续缺血缺氧（HI）处理（见步骤 6.10）。</li>
	<li>将动物放入温度控制在 37 °C 的恒温舱中，并持续向舱内通入 8% O2 / 92% N2 的混合气体，维持 2 小时。</li>
</ol>

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</ol>

Lehmkuhle 博士和 Dudek 博士对 Epitel 公司拥有经济利益，该公司是 Epoch 无线生物电位记录系统的设计方。

在疾病的小动物模型中进行长期脑电图记录可能非常昂贵。通过采用简单的电路设计并注重低功耗，我们成功开发出一种发射器系统（图1和图2），可显著降低长期监测实验的成本。一次为期6个月的监测实验总成本可低至470美元，外加动物费用（约每天1.5美元，每只动物约200美元的发射器成本）。该发射器体积小巧，可在人类疾病的小动物临床前模型中实现连续、无中断的脑电图记录，而使用有线或基于射频的无线记录系统则很难实现此类记录（图4）。此外，该发射器可直接安装于颅骨上，从而缩短手术时间，减轻动物应激反应，避免因手术创伤而影响实验结果。本文展示了来自三种不同癫痫实验模型的概念验证实验结果：新生大鼠缺氧缺血模型13, 27, 28（图4）、DFP诱导的癫痫持续状态模型（图5），以及遗传性海绵状血管畸形模型中的癫痫发作（图6）。
获得无伪迹、长期脑电图记录最关键的方面，可能是确保电极能够无障碍地接触目标皮层区域（图4-6）。这包括公共参考/接地电极。对于硬膜外脑电图应用，尤其关键的是将发射器牢固地固定在颅骨上。在此过程中，由于电极本身非常短，可能无意中将氰基丙烯酸酯粘合剂涂覆到电极尖端。若电极被氰基丙烯酸酯覆盖，可能会衰减脑电信号，严重时甚至完全隔绝信号。同样，若公共参考/接地电极与动物大脑之间未能形成良好的电连接，将导致发射器内的差分放大器无法正常工作，从而产生电学上“嘈杂”的信号输出。手术后，由于颅骨钻孔周围出现水肿，信号质量可能在长达48小时内受到影响。随着水肿消退，信号通常会逐渐改善。为避免此问题，可将电极直接置于颅骨表面而不钻孔。但这种方法的缺点是更容易使电极沾染氰基丙烯酸酯，同时由于颅骨本身的低通电特性，高频脑电活动会减弱，并可能导致公共参考/接地电极被电学隔离，从而引入信号噪声。可通过使用厚度类似于小鼠或大鼠颅骨的薄木片或木 veneer 练习正确的电极放置技术。本论文所展示的结果说明了利用无线遥测技术所能获得的记录质量。
采用本文所述方法进行手术植入所需时间可短至10分钟，具体时长取决于手术的复杂程度。若需对脑深部结构（如海马CA1区）进行手术暴露，建议将发射器固定于安装在立体定位仪框架上的微操作器上。微操作器可为术者提供足够的精度，以根据小鼠29和大鼠30脑图谱中公布的立体定位坐标进行发射器植入。该操作可通过使用氰基丙烯酸盐胶将一段皮下注射针管固定在发射器上，再将该针管安装至微操作器中实现。在缝合皮肤前将发射器固定于颅骨时，微操作器对x、y和z坐标的控制可提供额外的稳定性。在发射器周围颅骨上加装骨螺钉有助于将发射器锚定于颅骨，但并非必需。然而，在某些癫痫和惊厥动物模型（如经氯化锂-匹鲁卡品处理的成年大鼠）中，骨螺钉可能更为有效。这些动物常出现自发性惊厥发作，伴随强烈的运动活动，可能在发作期间对发射器造成损伤。这些实验还可进一步增加复杂性。例如，该发射器可兼容多种创伤性脑损伤模型，如可控皮层撞击损伤31。发射器装置的耐用性已通过在出生后第7天（P7）植入发射器并随后在动物设施中长期饲养进行测试。12个月后，大多数植入物仍完整地固定在颅骨上。动物处死后，颅骨外观正常，发射器嵌入颅骨内，需施加较大力量才能取出。在研究脑深部结构时需特别注意：随着脑组织生长，电极位置保持固定，电极的最终位置预计将发生改变。在本文所述技术中，电极通常置于硬脑膜上方，从而允许脑和颅骨正常生长，同时保持电极在原始位置。发射器使用时长的限制因素主要为电池容量（i.e. 电池耗尽前的使用时间）。
一体化的独立设计（即 发射器嵌入坚硬的环氧树脂中，其外壳设计适用于与母鼠及其同窝幼鼠共同饲养的未成熟幼崽。通常情况下，将植入设备的动物与有线束缚装置共同饲养，会导致植入硬件损坏或母鼠对幼崽的同类相食现象。该发射器光滑的壁面形状使得植入后几乎不会出现硬件故障，也避免了因同类相食导致的幼崽丢失。
该系统中的低功耗电容耦合传输方案适用于多种不同的实验场景，例如置于温度控制的培养箱中，或与容积描记室等实验装置联用。同样，接收天线的形状也可根据多种不同的行为学实验环境进行调整，例如高架T型迷宫。发射器的传输距离仅为几英寸，因为发射器必须能够“驱动”（即通过电容耦合）接收天线，并依赖实验动物被饲养在标准啮齿类动物笼具中，或被覆盖于接收天线有效面积范围内的合适笼具中。发射器充当电场的一个电极，而动物的身体则作为另一个电极。在某些特定方向上，例如与接收天线相位相差90°时，电场无法驱动接收天线，从而导致信号“丢失”。这种情况较为罕见。未来对该技术的改进将实现在同一笼具内对多只动物进行信号记录，从而降低饲养成本并允许动物间的社交互动。进一步的发展方向包括增加记录通道，如温度和肌电图信号。当前设备的设计带宽针对经典脑电图（EEG）频段进行了优化，不适用于快速尖波涟漪或高频振荡的记录。未来可通过修改设备以记录信号中的高频成分，但会相应缩短电池寿命。未来还将集成多种类型的传感器，包括血压和压力-容积传感器，并可根据用户指定的脑区立体定位坐标，定制发射器电极的排布结构。

记录大脑生物电位最古老且至今仍应用最广泛的技术是脑电图（EEG）。该技术在临床上用于检测神经系统异常，包括癫痫发作检测1、癫痫灶定位2以及脑震荡诊断3,4。该技术还广泛用于研究睡眠机制的基础信息，并用于诊断睡眠障碍5,6。
与癫痫的临床诊断一样，脑电图（EEG）在遗传性和获得性癫痫动物模型的转化研究中已成为不可或缺的工具。在当前的研究应用中，“有线”或“拴系式”记录是标准方法，通常在成年啮齿类动物中持续进行数周7。然而，电噪声、运动伪迹，以及拴系动物因拉扯电缆而造成自伤的风险，长期以来一直影响着这些实验的质量。因此，为了改善实验条件并提高成功率，我们需要开发新技术，以消除动物与仪器之间的有线连接。最明显的研发方向是设计和实施遥测系统，该系统能够在保证高质量记录的同时，具备较长的使用寿命，并尽量减少对实验动物的不适。减小这些设备的物理尺寸，将有助于在神经系统疾病的新生和青少年啮齿类动物模型中开展转化研究。
大鼠低通道数脑电图记录被广泛用于开发可转化为人类应用的抑制癫痫发作的新疗法。&#160;长时间对一个或多个位点进行记录，为在转化研究中利用啮齿类动物癫痫模型开辟了诸多可能性。当前该领域的许多研究旨在阻断慢性癫痫发作的发生或癫痫的发展（即，癫痫发生），此类研究需要广泛甚至持续的脑电图监测，以评估所提出疗法的有效性8；一种小型、简单的遥测系统，每个通道工作频率范围为0.1–100 Hz，具有单通道、双通道或四通道配置，将极大推动此类转化研究。脑电图记录的癫痫发作常伴随极少的行为表现（确实不伴有惊厥），这限制了基于行为学发作检测方法的应用价值。结合脑电图记录与同步视频监测的策略，可实现对每一次发作的捕捉；此外，这些分析方法还可用于对癫痫脑组织在“发作期”（即发作事件）之间出现的发作间期尖波进行定量评估9此外，获得连续高质量、低伪迹脑电图（EEG）记录的能力（无线技术通常在这方面更具优势）将有助于开发基于计算机的算法，用于研究特定的脑电波形。例如θ、γ波段）以及自动检测癫痫发作，显著降低了实验人员的工作量。
研究脑损伤后慢性癫痫的主要临床前模型是成年大鼠或小鼠，可通过化学致痫剂（即红藻氨酸或匹罗卡品）或电刺激诱发持续性癫痫状态（SE），随后发展为慢性癫痫。在此类条件下，与SE相关的严重抽搐或癫痫动物后续发生的癫痫发作可能导致动物在束缚装置上撕扯或牵拉，从而造成损伤，并使固定头帽的螺丝松动。最终，这一问题通常会导致实验终止，然而，对于旨在开发慢性癫痫新疗法的研究而言，获取长期高分辨率脑电图（EEG）记录至关重要。此外，长期植入动物的饲养、监测及数据处理在直接成本和研究人员时间投入方面均需大量资源；因此，实验的过早终止会给研究人员带来显著损失。随着这些癫痫模型的进展，癫痫发作通常会变得更加频繁且更为严重10-12，此时动物对新疗法研发的价值达到最高，但其受伤的风险也随之增加。这些动物通常每天可出现数十次惊厥性癫痫发作，且常以簇集形式发生13。
基因靶向技术在小鼠模型中的应用，可能是生物医学科学领域最重要的进展之一。这一方法使得、并将继续使得研究人员能够开发出可再现人类真实综合征的遗传性癫痫动物模型14-16。通过基因操作，可作为概念验证疗法，用于抑制癫痫发作，甚至在脑损伤后阻止癫痫的发生17-20。此类研究将极大受益于实现脑电图（EEG）的高通量连续记录的能力。目前，已可通过有线连接或遥测系统对小鼠进行记录；然而，获得高质量、无伪迹记录的技术挑战比大鼠显著更大，且通常需要使用各种形式的背包式装置，而小鼠会持续尝试移除这些装置。应激可能增加癫痫发作的严重程度、频率和/或持续时间，从而最终改变实验动物的癫痫表型，干扰研究结果。一种小型、轻量、低轮廓的微型遥测系统将有助于对人类疾病遗传性小鼠模型进行长期脑电图记录。
除了上述问题之外，在疾病幼年啮齿类动物模型中记录脑电图（EEG）还面临一系列独特的挑战。幼年动物体重可低至6 g（P8小鼠）至17 g（P6大鼠）。由于连接线带来的应激增加，以及限制了母体对幼崽的自然哺育，几乎无法实现连续多日的有线EEG记录。在断奶前，幼崽必须持续由母体抚养。母体会倾向于破坏幼崽身上任何外置的连接装置，甚至可能终止幼崽生命，有时甚至会终止整窝幼崽的生命。此外，幼年啮齿类动物的颅骨结构使得难以将电极基座以机械稳定的方式固定于颅骨上。这些针对幼年啮齿类动物特有的挑战，要求开发一种新型解决方案，以实现稳定、长期的脑电记录。本文重点介绍使用一种新型微型无线发射器进行EEG植入与记录的方法，并通过三个原理验证实验示例展示该微型无线遥测系统的应用：1）缺氧-缺血幼年大鼠幼崽模型；2）使用DFP处理成年小鼠以诱导癫痫持续状态及后续自发性癫痫发作；3）成年小鼠血管性海绵状畸形的遗传模型，该模型可导致癫痫发作和死亡。
微型无线遥测系统的设计旨在满足四个主要要求：（1）手术植入创伤最小化；（2）兼容幼鼠与其母鼠及同窝幼鼠共同饲养；（3）设备功耗低，从而实现连续数月监测而无需再次手术植入；（4）能够记录高质量的脑电图（EEG）波形，并将运动伪迹降至最低。无线发射器重量小于&#60;0.6、2.3 和 4 g，体积小于&#60;0.3、0.8 和 1.4 cm3&#160;，具体取决于所用电池，其底面尺寸为 5 × 7、7 × 9 或 7 × 12 mm，可使用氰基丙烯酸酯凝胶轻松固定于动物颅骨上。设备无需骨螺钉锚定即可牢固固定于颅骨，减少了颅骨钻孔数量和手术时间。该设备在此配置下可对来自海马等深部脑结构的两通道脑电图（EEG）或局部场电位进行持续超过2周、2个月或6个月的放大记录。无线发射器的小型化设计降低了感染风险，提高了动物活动能力，最终减少发病率与死亡率，从而减少了实验所需的时间、经费及动物数量。所有电子元件和电池均封装于医用级环氧树脂中，使设备具备防水和耐用特性，防止母鼠啃咬导致设备失灵。与射频发射器不同，该遥测系统采用电容耦合方式，在发射器与位于动物笼下方的接收天线之间传输信号，使用户可将动物饲养于标准啮齿类动物笼具中。多通道记录功能支持多模态生物电信号的同步采集，例如心电图（ECG）和脑电图（EEG）。共病动物模型将受益于在行为过程中同步记录生物电位的能力21-23。将行为学与脑电图监测相结合，将为科研人员提供更强大的研究工具，用于基础研究和临床前研究。

<table><tbody><tr><td>无菌外科手套</td><td>Protective Industrial Products</td><td>100-3201 PF</td><td>无粉无菌乳胶外科手套</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>15号手术刀片</td><td>FST</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>磨骨工具</td><td>Ram Products, Inc.</td><td>Microtorque II</td><td></td></tr><tr><td>精细磨头</td><td>FST</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>动脉瘤夹</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5422</td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>FST</td><td>11022-14</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>McKesson</td><td>24-103</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>WPI</td><td>521725</td><td>Olsen-Hegar 持针钳</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯凝胶</td><td>Henkel</td><td>Loctite 4541</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯促进剂</td><td>Henkel</td><td>Loctite 7452</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl RB-1 J304</td><td></td></tr><tr><td>电凝笔一次性头端</td><td>Bovie</td><td>AA01</td><td>细头</td></tr><tr><td>手术托盘</td><td>FST</td><td>20311-21</td><td></td></tr><tr><td>Epitel 接收基座</td><td>Epitel Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Epitel 无线发射器</td><td>Epitel Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Biopac 数据采集系统</td><td>Biopac</td><td>MP-150</td><td></td></tr><tr><td>PC兼容计算机</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用epoch无线发射器系统在人类疾病的小型啮齿动物模型中进行长期连续脑电图监测

Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System

许多人类进行性神经系统疾病（如癫痫）需要使用能够缓慢发展出疾病的临床前动物模型，以便在疾病发展的各个阶段测试干预措施。这类动物模型在幼年啮齿类动物中尤其难以实现，而幼年啮齿类动物是研究这些疾病的经典模式生物。由于幼年啮齿类动物体型微小，且在断奶前依赖母体，因此在癫痫及其他神经系统疾病的幼年动物模型中进行连续脑电图（EEG）记录面临技术挑战。因此，不仅迫切需要改进临床前研究，以更准确地识别适合转化至临床应用的治疗方法，同时也需要开发新型设备，以实现对幼年啮齿类动物的连续EEG记录。本文介绍了专为幼年大鼠或小鼠设计的一种新型微型遥测系统的技术原理，并演示其使用方法，该系统同样适用于成年动物。

我们开发并实施了从单只成年啮齿类动物记录脑电图（EEG）的概念，如图1所示。为满足机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审批要求，该设计必须能够良好地融入现有的机构动物设施；因此，该系统被设计为可在标准动物设施中轻松安装，且无需额外占用空间：动物饲养在常规的“动物设施配发”饲养笼中，该笼置于一个集成法拉第笼的接收器内，以减少电噪声干扰。每个接收器基座的信号通过导线传输至连接计算机的数字化仪（图1）。根据用户数据采集系统的性能，仅需一台计算机即可同时采集最多32只动物的数据。此类装置功耗低、产热少，适用于气候受控的动物设施。数据可在显示器上实时显示，便于实验监测，并可长期存储于外接硬盘（10 TB 存储单元）中。
为了尽量减少同窝幼仔造成的损伤以及母鼠对幼仔的食仔行为，我们测试了多种发射器外形。最终设计为穹顶状圆柱体，这种形状使大鼠难以啃咬和损坏。图 2A 展示了成年大鼠颅骨上的单个发射器，图 2B 展示了高密度（32 只动物）接收底座和记录装置的早期版本，标准啮齿类动物饲养笼可放置于其中。功耗效率是一个极为重要的考虑因素；我们选择电容耦合作为数据传输协议。以下设计可根据电池容量实现长达 6 个月以上的连续脑电图（EEG）记录（图 2A）。出生后第 12 天（P12，图 3A）的小鼠和出生后第 6 天（P6，图 3B）的大鼠均能很好地耐受该发射器。使用氰基丙烯酸酯将发射器粘附于颅骨，可使动物在携带发射器的情况下正常生长至成年（图 3C），同时持续采集脑电图数据。
发射器和无线接口独特的微型外形使其适用于新生期和围产期状况的动物模型研究。图4展示了P7 Sprague-Dawley幼鼠在经历缺氧缺血性（HI）梗死（颈动脉结扎后暴露于8% O2混合气体中2小时）后，亚急性癫痫发作活动的双通道脑电图（EEG）记录13。HI处理导致结扎侧颈动脉同侧大脑半球出现大面积损伤。此处记录显示，在受损大脑的双侧半球均出现两次广泛性癫痫发作。黑色轨迹代表病灶对侧半球的脑电活动，蓝色轨迹显示同侧半球（即病灶区域）的脑电活动。尽管癫痫活动在大脑双侧半球均存在，但同侧半球表现出脑电背景抑制，提示持续存在的脑损伤21。
可通过向成年大鼠注射有机磷酸酯DFP诱导癫痫持续状态22,23. 数据在 图 5 显示重复的脑电图放电，提示癫痫持续状态（参见时间扩展 图 5A、B在样本迹线下方，采用非线性混合效应模型分析了12小时内癫痫持续状态的时间进程，该模型可量化随时间变化的癫痫发作强度。癫痫持续状态的严重程度由伽马频段（20–60 Hz）的脑电图（EEG）功率定义。此处，上述功率值在12只动物中取平均，并在12小时内以95%置信区间绘图。数据显示，在DFP处理后的第一小时内伽马功率显著升高，并在连续监测的12小时内持续维持。以下所述的分析方法可对急性癫痫持续状态的严重程度进行定量评估，而该现象以往主要依赖行为学指标进行分析。我们在此将该分析技术作为示例提供，因其利用经典EEG频段的功率计算，且已在本实验室的临床前研究中广泛用于评估抗惊厥药物的疗效。24-26无线遥测技术能够进行连续、不间断的无线记录，其最有价值的方面可能是记录低发生率的异常自发事件的能力。这类数据表明了无线发射器系统的广泛应用价值。
<img alt="带有小鼠、脑电图信号、天线和计算机分析设置的遥测系统示意图。" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：Epoch 记录系统的示意图。 无线记录系统由两个部分组成：1）安装在颅骨上的无线发射器，用于放大生物信号；2）放置在标准啮齿类动物饲养笼下方的接收板。接收底座输出的信号为模拟信号，包含经解调并放大至最大 4 V 峰峰值的生物信号。该信号随后可输入数据采集系统进行记录。
<img alt="Lab animal setup; rodent in enclosure, video monitoring system for research observation." src="/files/ftp_upload/52554/52554fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：发射器与接收器。 这种特定的无线发射器（A）重4 g，且排开 &lt;1.4 cm3 体积小，占地仅7 x 12 mm，可轻松安装于大鼠和小鼠颅骨上。该发射器可放大两通道生物电位信号，持续工作长达6个月，之后电池耗尽。使用更大容量电池可延长记录时间。将动物置于标准啮齿类动物笼具中，并放置在Epoch接收器上方B右侧展示的是早期两个独立记录装置的示例，每个装置均可同时记录16只动物的信号，表明每个记录装置占用空间较小（2英尺×4英尺，约60 cm×120 cm）。
<img alt="用于行为学和神经活动神经科学研究的植入脑部电极的大鼠。" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：在大鼠和小鼠中植入无线发射器。 该发射器可对出生后第12天（P12）及以上的小鼠进行长达6个月的连续脑电图（EEG）记录（上图）。中间的照片显示一只出生后第7天（P7）的大鼠幼崽已植入微型发射器。随着动物发育成熟，发射器牢固地固定在颅骨上。底部的动物为出生后第280天（P280），其在出生后第7天（P7）时植入了假发射器。该系统可实现从P7至断奶期多个年龄段动物的同步、连续脑电图记录，从而减少临床前长期脑电监测研究所需的动物窝数。
<img alt="地震波分析；信号图比较；随时间变化的振幅；地震研究。" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：通过遥测系统记录双通道缺氧-缺血诱发的癫痫发作。 使用无线遥测系统对P7大鼠幼崽在颈动脉结扎（缺血）期间接受8% O2处理（缺氧）后记录到的异常脑电图进行双通道记录。（A）和（B），为波形的放大视图。两个半球均出现癫痫样放电活动（黑色、蓝色），其中发生缺血性梗死的半球（蓝色）表现出明显的脑电抑制。
<img alt="使用伽马功率图进行脑电图信号分析，显示伽马频段的时间与相对功率关系。" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5：在成年大鼠中记录癫痫持续状态。 使用微型无线遥测系统对成年大鼠给予二异丙基氟磷酸酯（DFP）处理后，进行表面脑电图（i.e.，硬脑膜）记录。上方轨迹图中的阴影区域（A 和 B）为下方轨迹图中波形的放大视图。通过无线发射器记录的数据可进一步在频域中进行分析，从而实现对动物群体的统计学比较。（C）数据为DFP诱导癫痫持续状态后12小时内伽马频段（20–60 Hz）功率的平均值及95%置信区间（N = 12）。
<img alt="脑电图癫痫发作图、异常放电、波形分析、神经学研究。" src="/files/ftp_upload/52554/52554fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6：血管性海绵状畸形转基因小鼠模型中癫痫发作及脑电图变化的记录。 我们在此记录了一只正在发生癫痫发作活动的转基因小鼠（A）的脑电图。最初，脑电图呈现正常模式（1）；在癫痫发作即将开始前，出现一段发作前期抑制期（2）；随后发生一连串五次癫痫发作（3）。癫痫发作结束后，信号中仍可见异常的发作期放电（4）。对照动物未出现癫痫发作，也无任何异常脑电图特征（B）。

本文展示了在人类疾病新生啮齿类动物模型中，使用无线技术实现脑电图（EEG）监测的方法。通过遥测技术，无需繁琐的连接线，从而允许动物表现出自然行为。

使用Epoch无线发射器系统在人类疾病的小型啮齿动物模型中进行长期连续脑电图监测

许多人类进行性神经系统疾病（如癫痫）需要能够缓慢发展出疾病的临床前动物模型，以用于测试……

本实验的总体目标是有效植入颅外发射器，以在大鼠和小鼠等啮齿类动物中记录高质量的脑电图（EEG）。首先需暴露并干燥颅骨表面，第二步是在颅骨上钻孔，用于插入发射器、电极以及所需的任何骨螺钉。接下来，插入骨螺钉并调整发射电极的位置。最后一步是插入电极，并使用丙烯酸类粘合剂将发射器固定在颅骨上。最终，通过数据采集视频和回放软件，持续24小时不间断地监测脑电图（EEG）活动，以捕捉所有脑电事件，如癫痫发作和发作间期尖波。该方法的可视化演示至关重要，因为植入步骤难以掌握。由于啮齿类动物颅骨的尺寸，导致手术过程复杂但可训练。本演示的主要目标是简化该植入过程，使其易于重复操作。我们最初萌生这一方法的想法，是在尝试对癫痫动物模型进行长期脑电图记录时遇到了困难。在发生惊厥性发作期间，有线记录容易产生电学伪迹，并对电极-颅骨界面造成不良应力。由于动物啃咬连接线或抓挠植入物，有线记录系统可能会发生故障。该无线系统可解决所有这些问题，同时提供长达六个月的连续无间断脑电图（EEG）记录。在手术准备过程中，务必对发射器进行彻底灭菌，用70%乙醇浸泡，再用无菌生理盐水冲洗，并将其浸入无菌生理盐水中，直至使用时取出。最后的准备工作是确保手术部位的所有物品均已灭菌。使用70%乙醇喷洒并擦拭周围区域和设备。在动物麻醉后，必须确认其对脚趾夹捏无反应，方可开始手术操作。每15分钟操作一次。应先将麻醉后的动物固定在立体定位仪中，使用耳杆固定，但不要过度拧紧，因为幼鼠的皮肤非常柔软。固定后，安装鼻罩以输送 3% 异氟烷。为保持动物体温，将其置于 37 °C 的加热垫上。对于成年动物，还需润滑眼睛。现在对切口部位进行消毒。首先，用70%乙醇清洁头皮，然后用碘伏以环形动作擦拭皮肤。接着，将动物覆盖无菌手术巾。操作开始时需非常谨慎，在耳后稍靠后的位置沿中线切开头皮。将切口延长约两厘米。幼鼠的颅骨非常柔软。此外，应一次性完成切口，以促进更快愈合。因此暴露颅骨。接下来，使用动脉瘤夹夹住颅骨，暴露并干燥用于安装发射器的区域。需要注意的是，幼鼠的颅骨骨缝尚未闭合。然后干燥将要安装发射器的颅骨区域。为了获得牢固的粘合效果，使用电灼笔止住颅骨上的出血。接下来，利用解剖学标志和脑图谱确定用于记录的颅骨钻孔位置。随后使用Dremel钻头和球形钻头，在记录位置钻出两个直径不超过300微米的孔。接下来，在小脑上方且位于人字缝后方钻一个颅骨孔。对于参考电极，请检查发射器的导线是否与颅骨孔对齐。若未对齐，请检查发射器的安装情况，并使用尖头镊子轻轻弯曲电极，使其与孔位对齐。现在使用手术剪将电极修剪至所需长度。电极应延伸至硬脑膜上方用于脑电图记录，或深入至特定脑结构。现在，在不涂覆电极的情况下，将足量的氰基丙烯酸酯涂抹于发射器上，使其完全覆盖。只需注意不要将胶水沾到电极上。如果发射器将用于采集表面信号，将其轻轻放入孔洞中，并稍施压力固定约一分钟。如果需要从深部脑结构采集信号，则将发射器安装在套管固定器上，并将其置于立体定位臂上。将发射电极插入钻孔时，必须避免胶水污染，否则会导致信号质量下降。接下来，添加更多氰基丙烯酸酯凝胶以增强发射器的固定。将胶水以环形方式涂抹于发射器壁上，注意不要覆盖天线。然后用注射器在发射器底部周围施加100微升化学促凝剂。防止其接触周围组织。为彻底清除加速剂，需用0.5 mL无菌生理盐水充分清洗该区域。现在缝合发射器周围的皮肤，但不要覆盖发射器。发射器的顶部应暴露在体外。为了确保良好的信号传输，请使用薇乔线或丝线缝合。处理幼小动物时，发射器周围皮肤应与发射器及周围的胶粘剂保持适当紧贴。现在将动物从固定架转移到温暖的毯子上以进行恢复，术后护理的详细信息在文本方案中提供。将单只已植入动物转移到记录室中。每次只能监测一只已植入动物，但可让其他未植入动物与其一同放置。设置记录仪时，先将电源连接至接收器底座。然后通过 BNC 接口将底座连接到数据采集系统。现在将笼子放置在信号接收器底座上。信号灯应被点亮。现在可以记录数据。首先，将接收器底座连接至模数转换器，并将转换器连接至计算机。使用软件设置，将记录的采样率设为每秒 500 次。发射器发送的脑电图信号频率范围为 0.1 至 100 赫兹，在两端均以每 VE 八分贝的滚降率衰减。设置高于奈奎斯特频率的合适采样率至关重要。我们推荐每秒采样 500 次。在动物记录过程中，需观察其是否出现应激和脱水的迹象。幼崽在舱室内的停留时间不应超过两小时。该发射器设计为对机体损伤最小的外形，并具有较长的电池寿命，根据电池容量的不同，可连续记录长达六个月。出生12天及以上的幼鼠对发射器耐受良好，出生6天的幼鼠也同样耐受良好。氰基丙烯酸酯与颅骨的粘连并未阻碍动物的发育，允许在整个发育至成年期间持续进行数据采集。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数分钟内完成。请记住，在此操作过程中，保持电极不被胶水污染至关重要。在此步骤之后，还可进行其他方法，如定量癫痫发作检测分析，以回答更多问题，例如癫痫持续状态的时间进程和严重程度。该技术将为癫痫研究人员研究新生儿惊厥及围产期卒中的啮齿类动物模型铺平道路。

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