Name: 正向遗传学屏风使用巨噬细胞识别弓形虫基因的重要的抗IFN-γ依赖性细胞免疫自主 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 了解正向遗传学筛选方法在巨噬细胞中识别Toxoplasma gondii免疫逃逸基因的应用。该研究揭示宿主-病原体相互作用机制，为开发抗细胞内病原体治疗策略提供新思路。

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特别感谢 Peter Bradley 博士提供用于检测 T. gondii 线粒体的抗体。本研究工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号 AI072028 和 AI107431，授予 D.G.M.，并获得纽约医学院热带医学研究捐赠基金的慷慨支持。

注意：所有涉及动物使用的实验方案均严格遵循纽约医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定。 
注意：本文引用了化学诱变38、通过有限稀释法分离寄生虫38、从小鼠骨髓分离巨噬细胞39、在人包皮成纤维细胞（HFF）中培养T. gondii、在巨噬细胞中形成包囊以及基本免疫荧光分析（IFA）32的详细实验方案。所有细胞培养均在37 °C、5% CO2条件下，使用D10培养基（DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）进行。在细胞分离和细胞培养过程中，所有试剂均须保持无菌状态。
1. IFN-γ 和 LPS 的剂量滴定，以确定在正向遗传学筛选中用于激活感染巨噬细胞的浓度
<ol>
	<li>培养小鼠骨髓来源巨噬细胞过夜&#160;在八孔玻璃载片中以每3个浓度 &#215; 105 细胞/毫升，在250 &#956;每孔加入 D10 培养基 1 升。使用从骨髓分离后 1 至 2 周的巨噬细胞。 
	注意：购买的腔室载玻片带有促进生长的RS洗涤液。</li>
	<li>使用血细胞计数板对从T25培养瓶中培养的人包皮成纤维细胞（HFF）收获的野生型寄生虫进行计数。将寄生虫重悬至浓度为5 × 10⁶个/mL。5 每毫升 D10 培养基中加入野生型寄生虫。该浓度将导致感染复数约为 1:1，因为巨噬细胞已在过夜（O/N）培养中增殖。所有寄生虫操作均应使用聚苯乙烯或 PET 管，因为寄生虫会黏附于聚丙烯材料。</li>
	<li>移除腔室载玻片中的 D10 培养基，并替换为 250 &#956;野生型寄生虫悬液的量为每孔适量。将寄生虫悬液沿每孔内壁缓慢加入，使其自然流入孔内。在整个操作过程中，切勿让巨噬细胞干燥。</li>
	<li>用盖玻片覆盖已感染寄生虫的腔室载玻片，并置于37℃培养箱中 &#176; C in 5% CO2 孵育4小时，以使寄生虫有足够时间侵入并形成寄生泡（PV）。</li>
	<li>制备 LPS 和 IFN-γ 的稀释液&#947; 在无菌管中，用1 ml D10培养基进行剂量滴定。进行剂量滴定时，保持LPS或IFN-γ浓度恒定，改变另一种刺激物的浓度 40.
	<ol>
		<li>例如，将LPS浓度保持恒定在每毫升10 ng，并改变IFN-的浓度 &#947; （0、1 单位/毫升、10 单位/毫升、100 单位/毫升、1,000 单位/毫升）。保留 IFN- &#947; 保持IFN-γ浓度恒定在100单位/毫升，同时改变LPS的浓度（0、0.1纳克/毫升、1纳克/毫升、10纳克/毫升、100纳克/毫升）。在稀释前，将LPS储备液置于水浴超声仪中短暂超声处理2分钟（不可使用探头式超声仪），避免加热。 
		注意：建议进行超声处理，以破坏脂多糖（LPS）形成的胶束聚集体，这些聚集体可能无法正常结合至宿主细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在寄生虫与腔室载玻片中的贴壁巨噬细胞共培养开始4小时后，弃去每个腔室中的D10培养基，并更换为300 &#956;适当稀释度的 IFN- &#947; 并在D10培养基中加入LPS。设置仅含D10培养基的对照组，以评估无巨噬细胞激活条件下寄生虫的复制情况。</li>
	<li>将腔室载玻片重新盖上盖片，置于37℃培养箱中 &#176; C in 5% CO2 再孵育24至30小时。 
	注意：孵育时间取决于野生型寄生虫菌株的倍增时间，根据菌株不同，倍增时间范围为6-12小时。应选择一个在未激活巨噬细胞发生寄生虫裂解之前的时间点，但需足够长以确保至少完成3-4次倍增。</li>
	<li>在杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS）中配制2.5%的甲醛溶液。弃去腔室载玻片中的培养基，加入300 &#956;2.5% 甲醛溶液 1 毫升，室温固定 20 分钟。</li>
	<li>将载玻片用300 μL缓冲液冲洗两次 &#956;毫升 PBS 至每孔。每次清洗时，弃去玻片上的 PBS，并沿每个玻片孔的内壁轻轻加入新的 PBS，以避免破坏贴附在玻片上的巨噬细胞。加入 300 &#956;每室加入 PBS 1 l，将盖玻片盖在腔室载玻片上，以防止染色前载玻片干燥。 
	注意：在此步骤中，载玻片可在 4 °C 下放置最多 3 天，然后再进行染色。</li>
	<li>染色方案 T. gondii 免疫荧光显微镜检测（IFA）。
	<ol>
		<li>在 PBS 中配制 0.2% Triton X-100 溶液（通透缓冲液）。将该溶液置于 37 ℃ 水浴中的离心管内 &#176;C 水浴中短暂涡旋，以确保 Triton X-100 充分溶解。弃去腔室载玻片中的 PBS，加入 300 &#956;l 的通透缓冲液。室温放置 30 分钟。</li>
		<li>配制含10%山羊血清的PBS溶液（封闭液）。弃去载玻片中的通透化缓冲液，加入300 &#956;每孔加入 l 封闭液，室温孵育 30 分钟。 
		注意：在所有染色方案中，胎牛血清可替代山羊血清。</li>
		<li>对于一步法免疫荧光染色，将荧光标记的抗体按1:1,000比例稀释 T. gondii 在封闭液中。从载玻片上移除封闭液，并加入150 &#956;每孔加入适量抗体溶液。将盖玻片重新置于腔室载玻片上，防止细胞干燥。室温下孵育1小时。 
		注意：抗体浓度必须根据来源经验性确定。抗体可直接购买荧光染料偶联物，或由用户自行偶联荧光染料。
		<ol>
			<li>对于使用未标记抗体的两步法免疫荧光染色方案 T. gondii 以及荧光标记的二抗，用150 &#956;未结合的一抗溶液 T. gondii 在室温下用封闭缓冲液封闭1小时。用300 μL缓冲液冲洗3次 &#956;PBS 加 1% 山羊血清（洗涤缓冲液）</li>
			<li>加入150 &#956;加入针对一抗来源物种的荧光标记二抗。更换腔室载玻片的盖玻片，以防止细胞干燥。室温下孵育1小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 PBS 加 1% 山羊血清（洗涤缓冲液）清洗载玻片 3 次。每次清洗时，倾去腔室载玻片中的溶液，并更换为 300 &#956;洗涤缓冲液的量。</li>
		<li>将载玻片用300 μL PBS冲洗2次 &#956;PBS 1 升</li>
		<li>根据制造商的说明，从载片式培养皿中移除腔室。</li>
		<li>使用含DAPI（4’6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐）的封片剂和22 mm × 50 mm盖玻片封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用相差显微镜和荧光显微镜观察载玻片。通过检查每个腔室孔中至少100个寄生泡（PV），确定每个空泡内的平均寄生虫数量。所选用的IFN- &#947; 且用于筛选的LPS浓度需足以抑制但不完全阻止野生型寄生虫的复制（参见 图1).</li>
</ol>
2. 分离在感染巨噬细胞激活后具有适应性缺陷的寄生虫突变体
注意：进行正向遗传学筛选需要一个随机突变的 T. gondii 突变体文库。可通过化学诱变（ENU/EMS）或插入诱变对 T. gondii 进行随机诱变27,28,38。诱变后，通过有限稀释法对寄生虫进行克隆，并在含有贴壁 HFF 细胞的 96 孔板中、200 µl D10 培养基内培养单个克隆32,38。用于显微镜筛选巨噬细胞内寄生虫的 96 孔板必须具有光学底，以实现显微观察。对染色后的 96 孔板进行相差和荧光显微镜观察时，需要配备长工作距离的倒置荧光显微镜，并配有 4、10、20 或 40X&#160;物镜。4X 物镜有助于观察整个孔，但使用 20X 物镜可获得寄生虫更佳的分辨率。
<ol>
	<li>将50 µl在96孔组织培养板中生长于汇合HFF细胞上的速殖子突变体转移至两个含有100 µl D10培养基的小鼠骨髓来源巨噬细胞（分离后1-2周）的96孔板中。 
	注意：基于寄生虫培养物体积在96孔板中进行初筛，以避免需要计数每孔转移的寄生虫数量。因此，步骤2.6中的显微镜分析是定性判断寄生虫是否普遍发生复制或未复制。步骤3描述了使用等量野生型或突变体寄生虫感染巨噬细胞，在腔室载玻片上确认突变体表型的方法。
	<ol>
		<li>直接将寄生虫加入各孔已有的D10培养基中。用野生型速殖子感染两个孔作为寄生虫复制的阳性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将感染后的细胞置于培养箱（37 °C和5% CO2）中孵育4小时，使寄生虫有足够时间侵入细胞并形成寄生泡（PV）。</li>
	<li>通过倾倒去除一个板中的培养基。使用单次手腕翻转动作将板内容物倒入含有杀寄生虫洗涤剂的废液盆中。
	<ol>
		<li>使用无菌容器和多通道移液器，向每孔加入100 µl“巨噬细胞激活培养基”。巨噬细胞激活培养基中应包含根据步骤1确定的最佳浓度的LPS和IFN-γ。同样地，去除平行对照板中的培养基，并替换为100 µl D10培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将感染后的细胞继续置于培养箱（37 °C和5% CO2）中孵育额外24-30小时。</li>
	<li>96孔板免疫荧光染色（IFA）操作流程。
	<ol>
		<li>弃去板内培养基，每孔加入100 µl含2.5%甲醛的PBS溶液。室温孵育20分钟。使用无菌容器盛放甲醛溶液，并用多通道移液器操作。</li>
		<li>弃去甲醛溶液，每孔加入100 µl PBS清洗一次。</li>
		<li>弃去液体，每孔加入100 µl透化缓冲液（含0.2% Triton X-100的PBS）。室温孵育30分钟&#160;。</li>
		<li>弃去液体，每孔加入100 µl封闭液（含10%山羊血清的PBS）。室温孵育30分钟。</li>
		<li>弃去封闭液，每孔加入50 µl以1:1,000比例溶于含1%山羊血清PBS中的荧光标记抗T. gondii抗体。加盖后室温孵育1小时，并置于摇床上。
		<ol>
			<li>也可选用未标记的一抗抗T. gondii，随后按照1.10.3.1所述方法使用荧光标记的二抗进行染色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>弃去抗体溶液，每孔加入100 µl含1%山羊血清的PBS。此清洗步骤重复3次，再单独用PBS清洗2次。每孔最后保留200 µl PBS，并盖上96孔板盖，防止孔内干燥。 
		注意：加盖后的板可用封口膜包裹，于4 °C保存最多3天，之后再进行显微镜分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用倒置荧光显微镜，配合20-40X&#160;物镜观察细胞。筛选在未激活巨噬细胞板中能够复制，但在“激活巨噬细胞”板中主要表现为无法复制（每个空泡仅含一个寄生虫）或呈现无定形、降解形态的突变体。 
	注意：每个空泡中野生型寄生虫的数量取决于所用IFN-γ和LPS的剂量，理想情况下约为每空泡4个寄生虫；该数值反映了激活刺激对生长的抑制作用，但未完全阻断复制。</li>
</ol>
3. 评估突变体，确定缺陷是否发生在感染巨噬细胞激活后寄生虫的存活或复制水平
<ol>
	<li>将选定的寄生虫突变体从96孔板（整个孔的内容物）转移至含有HFF细胞的T25培养瓶中，并使其进行复制。</li>
	<li>在8孔玻璃培养板中，以每毫升250 μl D10培养基含3 × 105 个细胞的浓度，过夜培养骨髓来源的巨噬细胞。准备一张玻片用于比较寄生虫在未激活巨噬细胞中的复制情况，另准备一张玻片用于比较感染后巨噬细胞激活后的寄生虫复制情况。</li>
	<li>收集速殖子阶段的寄生虫，并用血细胞计数板计数。将5 × 104&#160;T. gondii 寄生虫加入含有巨噬细胞的D10培养基的孔室中，培养4小时。设置一个孔加入野生型亲本寄生虫作为对照。同时接种另一张相同的重复玻片，使用同一寄生虫克隆但不添加激活培养基，以监测寄生虫在未激活巨噬细胞中的复制情况。</li>
	<li>弃去其中一张重复孔板玻片中的D10培养基，替换为250 µl“激活培养基”；弃去另一张重复孔板玻片中的D10培养基，替换为250 µl新鲜D10培养基。将“激活”和“未激活”巨噬细胞玻片均加盖后置于37 °C、5% CO2 条件下继续孵育24–30小时。</li>
	<li>按照步骤1所述方法对玻片进行固定、通透和封闭处理，用于IFA染色及寄生虫分析。在保持孔室结构完整的情况下进行IFA染色。
	<ol>
		<li>使用溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）抗体或Lysotracker，以及T. gondii 抗体对细胞进行共染色，以评估感染巨噬细胞的激活是否诱导了突变体寄生虫泡（PV）与溶酶体的融合 （图4）。</li>
		<li>使用针对寄生虫/PV内特定区室或细胞器的抗体，通过IFA染色识别在巨噬细胞激活后早期即可观察到的突变寄生虫的结构改变28。 
		注：此类结构改变可能有助于揭示突变体在巨噬细胞激活后存活/复制能力缺陷的潜在机制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用100倍相差油镜结合荧光显微镜观察玻片。
	<ol>
		<li>通过统计100个随机选择的寄生虫泡中每个泡内的寄生虫数量，评估寄生虫的复制能力。每组至少重复两次，每次计数100个寄生虫泡，以供统计分析。</li>
		<li>结合荧光分析和相差显微镜观察寄生虫的一般形态。使用100倍相差油镜观察寄生虫。健康的寄生虫应被紧密包裹在贴合良好的寄生虫泡内；若寄生虫泡形态不规则、空间扩大，且具有折光性强的边缘，或寄生虫本身呈无定形状态，则提示寄生虫死亡，而不仅仅是复制缺陷（图1和图3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 评估突变寄生虫对感染巨噬细胞活化的敏感性是否与已知的抗菌介质相关
<ol>
	<li>从野生型 C57/BL6 小鼠、iNOS-/- 小鼠、gp91-phox-/- 小鼠或 Irgm1/Irgm3-/- 小鼠中分离骨髓来源的巨噬细胞32。</li>
	<li>将相应的骨髓来源巨噬细胞以每毫升 3 × 105 个细胞的浓度，在 8 孔玻璃培养皿中用 250 μl D10 培养基过夜培养。</li>
	<li>按照步骤 3 所述进行寄生虫攻击、IFA 染色及分析。</li>
	<li>确定在缺乏活性氧、活性氮物质或特定免疫相关 GTP 酶的情况下，突变寄生虫在感染巨噬细胞激活后存活与复制的能力是否恢复28。</li>
	<li>使用药理学试剂（如一氧化氮供体），评估特定抗菌介质本身是否足以损害 HFF 细胞或未激活巨噬细胞中的突变寄生虫，或其是否仅在与其他巨噬细胞激活介质协同作用时才发挥作用28。</li>
</ol>
5. 评估突变寄生虫的缺陷是否影响慢性感染
<ol>
	<li>从在含有HFF细胞的T25培养瓶中培养的野生型、突变体或靶基因敲除的弓形虫中分离速殖子。速殖子必须从新鲜裂解的HFF培养物中获取。</li>
	<li>使用血细胞计数板对寄生虫进行计数。将寄生虫重悬于汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，浓度为每毫升适合以200微升体积接种亚致死剂量寄生虫的浓度 &#956;通过腹腔（IP）注射。</li>
	<li>使用1 ml结核菌素注射器和25 G针头&#160;针头用于以200注入寄生虫 &#956;腹腔内（IP）注射l体积。剂量取决于寄生虫的野生型株系和小鼠基因型。 
	注意：无论寄生虫剂量如何，I 型基因型的寄生虫在感染急性期对小鼠均具有致死性，因此在未使用化学治疗的情况下，不适用于慢性感染的研究。 T. gondii 以抑制寄生虫增殖。</li>
	<li>在寄生虫攻击后第30天，通过吸入二氧化碳处死小鼠2 从加压罐中取出后，在非拥挤的环境中（标准大小的小鼠笼中最多容纳5只小鼠）进行颈椎脱位处死。</li>
	<li>使用既定方法从小鼠中分离脑组织41-43.
	<ol>
		<li>将小鼠仰卧放置。用70%乙醇喷洒头部以消毒区域。</li>
		<li>使用锋利的剪刀剪断脑干。用解剖剪从脑干基部开始，在颅骨右侧进行浅层侧向剪切，然后对左侧重复相同操作。用镊子轻轻掀开颅骨，以暴露脑组织。</li>
		<li>轻轻抬起脑组织，将剪刀置于脑组织与颅底之间，剪断嗅神经以游离脑组织。用无菌镊子或刮勺取出脑组织，放入含有10 ml无菌PBS的细菌培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌手术刀沿左右半球之间的中线将脑组织切成两半。</li>
	<li>将一半脑组织加入含有1 ml PBS的小研钵中。使用研杵和研钵将脑组织研磨成细小的组织悬液，使其能够通过宽孔径的20–200 μl移液器吸头 &#956;l 移液器吸头 
	注意：如果需要进行组织病理学切片，应将另一半脑组织在2.5%甲醛中固定1小时。</li>
	<li>加入100 &#956;将脑组织裂解液加入1.7 ml微量离心管中。向含有脑组织裂解液的管中加入1 ml含2.5%甲醛的PBS溶液，以固定脑悬液用于染色。室温孵育30分钟。</li>
	<li>在微量离心机中以 8,000 x g 离心裂解液 5 分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>加入1 ml通透/封闭缓冲液（含10%胎牛血清、0.2% Triton X-100的PBS）至裂解液中，室温孵育30 min。</li>
	<li>以 8,000 × g 离心裂解液 5 分钟，弃上清液。</li>
	<li>加入200 &#956;1 mL FITC标记的双花扁豆凝集素（DBA），使用PBS加10%山羊血清将凝集素稀释至1:100。用移液器轻轻重悬裂解液。室温孵育1小时。 
	注意：DBA 是一种配体，可结合于寄生虫包囊壁上的 CST1。</li>
	<li>在8,000 × g离心5分钟，弃上清液。向沉淀中加入1 ml PBS，室温孵育5分钟。重复PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，用移液器吸除上清液。</li>
	<li>使用宽孔径 20-200 &#956;l 移液器吸头吸取 5 &#956;取染色后的脑组织裂解液各1升，置于显微镜载玻片上。用25 × 25 mm的盖玻片封片，制成脑组织裂解液的湿封片。每5升样本制备3个重复玻片 &#956;每份脑裂解液1升</li>
	<li>统计每个5中的包囊数量 &#956;使用10倍物镜通过荧光显微镜对等份样品进行观察 （图6）. 
	注意：某些包囊较大（约含8个或更多虫体），而某些则非常小（每个包囊含1-2个虫体）。统计每张玻片上的包囊总数，但需分别记录大包囊与小包囊的数量。</li>
	<li>在三个不同的 5 &#181;l 分装并乘以总稀释倍数 x&#160;2（仅将一半脑组织制成裂解液）以估算每脑的总囊肿数。</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本方案提供了一种无偏倚的方法，通过激活小鼠骨髓来源的巨噬细胞并结合正向遗传学手段，分离出在抵抗感染巨噬细胞激活方面存在生存缺陷的 T. gondii 突变株。突变株在巨噬细胞激活后的表型通常可分为两大类：1）寄生虫形态完整，但在每个寄生泡（PV）中无法增殖至超过一个个体；2）寄生虫出现降解现象，可能存在于较大且形态不规则的寄生泡中。突变株在未激活的 naïve 巨噬细胞中表现出与野生型寄生虫相似的表型，这一事实证明该方案可特异性地用于鉴定那些抵抗巨噬细胞激活能力受损的突变株。建议在筛选过程中使用原代骨髓来源的巨噬细胞，而非 RAW 264.7 巨噬细胞系，因为在骨髓来源的巨噬细胞中，寄生虫的形态及每个空泡内的寄生虫数量更易于观察。
所述筛选方法结合正向遗传学，为解析寄生虫基因及最终揭示对细胞自主免疫特定介质抵抗至关重要的遗传通路提供了多功能工具。此类正向遗传学研究对于鉴定寄生虫基因具有重要意义，这些基因可作为线索，用于逐步解析在体外及致病过程中抵抗特定抗菌介质的重要寄生虫通路。T. gondii 中既往正向遗传学方法面临的主要困难在于确定每个突变...

刚地弓形虫（T. gondii） 是一种专性胞内寄生的原虫病原体，可引起弓形虫病，在免疫功能低下个体中构成健康威胁。它也是研究其他感染人类的顶复门病原体的模式系统，包括 隐孢子虫与环孢子虫弓形虫病最常通过摄入被寄生虫缓殖子或卵囊阶段污染的食物或水而获得。摄入后，这些阶段会转化为速殖子阶段，速殖子在宿主细胞内复制并进行系统性播散。T细胞和IFN-&#947; 以及较少量的一氧化氮 1-4对于控制感染至关重要，但无法彻底清除疾病，因为部分速殖子会转化为缓殖子阶段，并被保护在组织包囊内，从而导致长期的慢性感染。事实上，目前尚无对疾病慢性包囊阶段有效的治疗药物。严重的弓形虫病通常是由于持续性感染重新激活所致，此时寄生虫的缓殖子阶段会重新转化为快速增殖的速殖子阶段，表现出原发性和急性感染的特征。
在先天免疫反应面前实现早期存活，对于使寄生虫达到足够的数量并扩散至远端部位以建立慢性感染至关重要。 T. gondii 已进化出多种策略以对抗宿主防御机制，这些策略可能有助于其在感染早期进行复制和播散。首先， T. gondii 在寄生虫侵入过程中形成一种独特的寄生泡（PV），与其它胞内病原体相比，该寄生泡在很大程度上与宿主细胞的内吞和外排过程相分离 5-9同样，与其他成功入侵细胞内的病原体一样 T. gondii 通过改变宿主细胞的转录因子（包括在调控细胞活化中起重要作用的转录因子），对宿主细胞基因表达进行重编程，从而修饰宿主细胞以创造利于自身生长的环境 10-15ROP16 16-19GRA15 20，GRA16 21 和GRA24 22 已被证明在调控感染宿主细胞的转录反应和细胞信号级联中具有重要作用 T. gondii最近利用具有不同表型的寄生虫株系进行遗传杂交的研究已成功鉴定了多种寄生虫基因，这些基因是寄生虫基因型依赖性性状的基础，包括逃避与免疫相关的GTP酶（IRGs） 16,19,23-26在小鼠中，免疫相关GTP酶（IRGs）对于控制弓形虫II型和III型基因型至关重要，而毒力极强的I型基因型已进化出逃逸小鼠IRGs的机制。然而，显然弓形虫还进化出了除IRGs以外逃逸其他抗菌介质的机制，其中部分机制可能在不同弓形虫基因型间保守存在。 27,28此外，关于细胞自主免疫中抵抗病原体的关键效应分子，目前所知甚少。 T. gondii 在人类弓形虫病期间，对细胞自主性免疫效应分子具有抗性的寄生虫基因，可能在速殖子向缓殖子转化过程中也具有重要作用，而该转化过程亦可由宿主免疫反应所触发。例如，高水平的一氧化氮可抑制感染性巨噬细胞中寄生虫的增殖，同时也可促进速殖子向缓殖子转化，从而诱导包囊形成30-32.
T. gondii 的功能性基因组数据库 ToxoDB 是该领域的重要资源，可提供寄生虫基因组的序列信息，并支持访问已发表和未发表的基因组规模数据，包括群体注释、基因表达和蛋白质组学数据33。与许多原生动物病原体类似，其基因组的大部分由假定基因组成，这些基因缺乏基于同源性的信息，因而难以推断其潜在功能。因此，正向遗传学是一种强大的工具，可用于鉴定在免疫逃逸、包囊转化以及其他对寄生虫致病性和不同发育阶段转换至关重要的新基因。正向遗传学的另一优势在于，它可作为一种相对无偏倚的方法，用于探究在致病过程中（包括免疫逃逸和包囊形成）发挥重要作用的寄生虫基因。近年来，突变谱分析的高通量测序技术不断改进，使其成为利用化学诱变和插入诱变进行正向遗传学研究中鉴定相关寄生虫基因的首选方法34-37。
识别弓形虫的脆弱环节至关重要 T. gondii 可被利用来增强针对该寄生虫的细胞自主免疫机制的有效性，特别是那些可能对耐药的包囊阶段也具有活性的机制。为实现这一目标，一种 体外 小鼠巨噬细胞感染与激活模型被用于鉴定那些特异性损害 T. gondii 感染巨噬细胞激活后的适应性缺陷，但在未激活巨噬细胞中无此缺陷。该巨噬细胞筛选方法被用于分析一个突变体文库 T. gondii 插入突变体以最终鉴定 T. gondii 对一氧化氮抵抗至关重要的基因 27,28一组突变体的分离 T. gondii 对感染巨噬细胞活化抵抗能力受损的突变体，尤其是对一氧化氮表现出显著敏感性的突变体，证实了该筛选方法在鉴定寄生虫基因方面的实用性，这些基因对于抵抗细胞自主性免疫介质（除小鼠IRG蛋白介导的已知抵抗机制之外）具有重要作用 28插入突变相较于化学诱变具有若干优势，例如可在每个寄生虫克隆中产生数量有限的随机突变，且理论上更易于确定突变位点。然而，鉴定质粒插入寄生虫基因组的具体位置仍具有挑战性。 T. gondii 插入突变体在实际操作中，许多情况下出人意料地难以实现 37将质粒插入基因也可能破坏基因功能，这与化学诱变通常仅导致单核苷酸改变的情况不同。然而，与插入诱变相比，使用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）或乙基甲磺酸（EMS）进行化学诱变可能更有利于分析更大范围的寄生虫基因组，因为它在每个突变体中可产生多个单核苷酸多态性（估计为10–100个）34,38此外，全基因组分析技术的最新进展使得利用下一代测序技术鉴定突变寄生虫表型最可能相关的候选基因成为可能。 34,38无论采用何种诱变方法，最终都需要通过基因敲除和互补实验来验证该寄生虫基因在抵抗巨噬细胞激活中的作用，以满足分子柯赫氏法则的要求。
通过遗传学手段对寄生虫和巨噬细胞进行基因操作，以解析基因功能，这一点至关重要，因为许多通过正向遗传学在T. gondii以及其他病原体中鉴定出的基因仍被归类为假想基因，其序列与其他已知功能蛋白几乎没有或完全没有同源性。本文概述了一种通用方法，可用于确定突变体中被破坏的基因是否对已知或未知的细胞自主免疫介质具有抵抗作用。对宿主抗菌因子的初步分析，是通过评估野生型和突变型寄生虫在野生型小鼠巨噬细胞与特定基因敲除小鼠巨噬细胞中的存活情况来进行的，这些基因敲除包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、gp-91 phox（NADPH氧化酶）以及特定的免疫相关GTP酶（IRGs）。该分析可判断所鉴定的寄生虫基因是否分别对一氧化氮、活性氧中间产物或免疫相关GTP酶的抵抗具有重要作用，或是否涉及未知的免疫机制28。如本实验方案所述，使用IFN-γ和LPS共同激活感染的巨噬细胞，主要可筛选出对一氧化氮抵抗具有重要作用的寄生虫基因28。使用在不激活巨噬细胞条件下即可诱导一氧化氮产生的药理学试剂（一氧化氮供体）进一步证实，所鉴定的大多数基因主要参与对一氧化氮本身的抵抗，而非一氧化氮与其他伴随巨噬细胞激活产生的介质协同作用下的抵抗28。
第一步和第二步描述了一项正向遗传学筛选方法，旨在分离在感染骨髓来源巨噬细胞激活后具有适应性缺陷的寄生虫突变体 体外第一步描述了通过剂量滴定分析，以经验性确定IFN的剂量 &#947;&#160; 以及用于巨噬细胞激活的LPS，以减少寄生虫复制，但不会完全抑制野生型寄生虫的复制 T. gondii 用于构建寄生虫突变体文库的亲本菌株。第二步描述在96孔板中对突变克隆进行巨噬细胞内的正向遗传筛选。第三步概述一种方法，用于确认在96孔板筛选中鉴定出的每个突变体的表型，并评估各突变体的缺陷是否影响寄生虫在巨噬细胞激活后的存活、增殖或包囊形成。第四步描述利用特定抗菌通路基因敲除小鼠来源的骨髓衍生巨噬细胞，鉴定该寄生虫突变体特异性敏感的免疫效应分子。第五步概述一种方法，用于确定该寄生虫突变体是否在 在体内 通过检测感染小鼠脑内包囊的产生来评估致病性。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;目录&lt;br/&gt; Id=29101&amp;amp;productId=3255471&amp;amp;差异&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; = Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; 弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病的致病原，为一种专性胞内原虫病原体。该寄生虫可侵入并几乎在任何温血脊椎动物的细胞类型中进行复制。在寄生虫侵入宿主细胞过程中，其会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫即在此泡内复制。尽管依赖干扰素的先天性免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）的正向遗传学筛选方法，用于鉴定在激活的巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活的巨噬细胞中具有正常侵袭和复制能力的寄生虫突变体。因此，该筛选可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解（常发生于无定形的空泡中）。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的寄生虫基因。本文提出了一种正向遗传筛选的通用方法，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特异性巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可能促进寄生虫从速殖子阶段向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文还提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法。&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;目录&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=11737973&amp;amp;缺陷&lt;br/&gt; type=0&amp;amp;highlightProductsItemsFlag&lt;br/&gt; = Y&amp;amp;fromSearch=1&amp;amp;searchType=&lt;br/&gt; 弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病的致病原，为专性细胞内寄生的原生动物病原体。该寄生虫可侵入并几乎在任何温血脊椎动物的细胞类型中进行复制。在寄生虫侵入宿主细胞过程中，其会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫即在此泡内进行复制。尽管依赖干扰素的先天免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）的正向遗传筛选方法，用于鉴定在激活的巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活的巨噬细胞中具有正常侵袭和复制能力的寄生虫突变体。因此，该筛选可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解（常发生于无定形的空泡中）。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的寄生虫基因。本文提出了一种正向遗传筛选的通用方法，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特异性巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可能促进寄生虫从速殖子阶段向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文还提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法。&amp;amp;hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH3002802&amp;nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&amp;amp;langId=-1&amp;amp;目录&lt;br/&gt; Id=29104&amp;amp;productId=2434305&amp;amp;缺陷&lt;br/&gt; 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使用巨噬细胞进行正向遗传学筛选，以鉴定在抵抗干扰素-γ依赖性细胞自主免疫中起重要作用的toxoplasma gondii基因

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii 是弓形虫病的病原体，为一种专性细胞内寄生的原虫病原体。该寄生虫几乎可在任何温血脊椎动物的细胞类型中入侵并复制。在寄生虫侵入宿主细胞的过程中，会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫在其中进行复制。尽管依赖干扰素（IFN）的先天免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）进行正向遗传筛选的方法，旨在鉴定在巨噬细胞激活后于感染巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活巨噬细胞中入侵和复制能力正常的寄生虫突变体。因此，该筛选方法可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解，后者常发生于形态不规则的空泡中。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的相关寄生虫基因。本文提出了一种通用的正向遗传筛选策略，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特定巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可促进寄生虫由速殖子向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法学。

Toxoplasma gondii 可在未经激活的巨噬细胞中自由复制，其倍增时间根据寄生虫株系的不同，介于 6–12 小时之间。图 1 展示了在未经激活与已激活的骨髓来源巨噬细胞中寄生虫的代表性图像。图 2 展示了在 HFF 宿主细胞中，每个寄生虫空泡（PV）分别含有 2、4、8、16 和 32 个寄生虫时的总体形态。在本实验方案中，允许寄生虫先进入未经激活的巨噬细胞并形成初始的寄生虫空泡（PV），随后向感染的巨噬细胞施加强效激活刺激物 LPS 和 IFN-γ。在此模型中，野生型寄生虫的复制速度减慢，但在激活后的约 24 小时内仍可继续复制；在此期间，巨噬细胞逐渐增强对寄生虫复制的抑制能力。该筛选实验的设计基于一种改良的竞争模型，即巨噬细胞强效激活所需时间与野生型寄生虫或寄生虫突变体在 PV 内持续复制时间之间的竞争。筛选的第一步是选择用于激活感染巨噬细胞的 LPS 与 IFN-γ 剂量。该剂量需通过实验确定，方法为评估在固定剂量 IFN-γ 与一系列 LPS 浓度组合下，或固定剂量 LPS 与一系列 IFN-γ 浓度组合下激活的巨噬细胞中寄生虫的复制...

正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞，特别是巨噬细胞，来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma gondii基因。

使用巨噬细胞进行正向遗传学筛选，以鉴定在抵抗干扰素-γ依赖性细胞自主免疫中起重要作用的Toxoplasma gondii基因

弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病的致病原，为一种专性细胞内寄生的原虫病原体。该寄生虫可侵入并在几乎所有温血脊椎动物的细胞内复制。在寄生虫侵入宿主细胞过程中，其通过独立于吞噬作用的机制，利用宿主细胞膜形成寄生泡（parasitophorous vacuole, PV），并在其中进行复制。尽管干扰素（IFN）依赖的先天性免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）的正向遗传学筛选方法，用于鉴定在巨噬细胞激活后其适应性受损、但在未激活巨噬细胞中侵袭和复制能力正常的寄生虫突变体。因此，该筛选方法可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解（常发生于无定形的空泡中）。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定其抵抗细胞自主性免疫诱导介质所特需的寄生虫基因。本文提出了一种通用的正向遗传筛选策略，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，本文还描述了一种评估寄生虫突变体所敏感的特异性巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可能促进寄生虫由速殖子阶段向缓殖子阶段转化，从而维持慢性感染。因此，本文也提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

正向遗传学屏风使用巨噬细胞识别<em&gt;弓形虫</em&gt;基因的重要的抗IFN-γ依赖性细胞免疫自主

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通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

正向遗传学是一种强大的方法，可用于揭示Toxoplasma从宿主细胞中逸出的分子机制。本文提供了化学诱变寄生虫、富集诱导逸出缺陷突变体以及验证克隆突变体表型的实验方案。...

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本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。...

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