从人皮肤中分离淋巴细胞用于表型分析 离体 细胞培养

本实验的总体目标是从人皮肤活检组织中高效分离出皮肤常驻T细胞。首先使用圆形活检打孔器获取人皮肤活检组织，然后在培养皿中将每块皮肤活检组织切成四个较小的片段。

随后，通过机械法和酶解法将皮肤组织解离，以制备单细胞悬液。最后，通过流式细胞术对皮肤驻留淋巴细胞进行分析，并进行体外培养。最终，可分离出足够数量的活的人皮肤驻留淋巴细胞，并通过免疫染色和流式细胞分选（FACS）分析进行检测。

该方法将有助于解答皮肤学和皮肤肿瘤免疫学中的关键问题，例如，皮肤中的常驻T细胞如何影响疾病的发生发展。本实验操作将由我实验室的博士研究生Xuehui He进行演示。

按照文本方案，在配制培养基后，向无菌六孔培养板的三个孔中各加入两毫升完全培养基。然后，使用直径四毫米的圆形活检打孔器获取皮肤活检组织，将其置于RPMI 1640完全培养基中，并在室温下放置不超过四小时，或在4°C条件下过夜保存。

在组织活检样本孵育的同时，标记一个蓝色盖子的消化管，并加入五毫升完全培养基。接着，使用无菌工具将活检组织放入第一孔中进行冲洗。将组织转移至第二孔，冲洗后，再在第三孔中重复此过程一次。

将充分冲洗的皮肤活检组织转移至无菌培养皿中，在样本上加入100微升完全培养基。然后，使用一次性无菌不锈钢手术刀小心刮除皮下脂肪组织。在另一个新的无菌培养皿中，将每份皮肤活检组织切成四个较小的片段。

然后将样品转移至已准备好的解离管中，管内含有5 mL完全培养基。盖紧管盖，并将其倒置固定在自动组织解离仪的套筒上。确保所有样品材料均位于转子区域。

接下来，通过运行程序 M spleen zero one 开始解离过程，以适当的旋转速度解离活检组织 56 秒。处理完成后，将解离管从解离仪上取下，并确保所有解离后的材料均收集于管底。

向解离管中加入 150 µL 的胶原酶 I A，将样本置于 37 °C 摇水浴中孵育 60 分钟。然后，向解离管中加入 100 µL 的 DNase，并充分混匀。将解离管连接至自动组织解离仪的套管上，运行程序 M spleen zero one，再次解离活检组织。

然后，将一个70微米的尼龙细胞筛置于50毫升离心管顶部，并将解离后的样本材料加入细胞筛中，以去除细胞团块和组织碎片。用5毫升完全培养基冲洗细胞筛一次。随后，将滤液在450 × g、20 ± 2摄氏度条件下离心10分钟，然后吸除上清液。

再重复洗涤步骤一次后，使用 300 µL 完全培养基重悬细胞沉淀。此时单细胞悬液已准备好用于进一步分析。进行细胞内细胞因子染色时，使用 PMA、离子霉素和布雷菲德菌素 A 刺激细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时，然后进行流式细胞术分析。

为了进行皮肤驻留T细胞的多克隆激活，将100微升单细胞悬液分装至圆底96孔板中。加入抗CD3、抗CD28磁珠包被的微珠、重组人细胞因子IL-2和IL-1B。使用带有标签的密封盖盖住培养板，于37摄氏度、5%二氧化碳及100%湿度条件下孵育。

然后，当培养基颜色变为黄色时，更换培养基。在细胞培养的第8天可观察到清晰的细胞克隆。为了进行FACS分析，将目标细胞转移至V型底96孔板中。

在450 × g、20 ± 2摄氏度条件下离心2分钟。然后吸除上清液。加入100 µL预先配制的荧光780偶联可固定活力染料，对细胞进行染色，于4摄氏度孵育30分钟。

然后，加入 100 µL FACS 缓冲液，离心后吸除上清液。接下来，从文本方案提供的列表中选择细胞表面标志物单克隆抗体，使用 FACS 缓冲液配制抗体溶液。结合非染色样本使用抗体的同型对照来确定设门参数。

现在，向每个孔中加入25 µL已配制好的小鼠抗体混合液，并避光保护。在20 °C下孵育20分钟。加入100 µL FACS缓冲液，离心后吸除上清液。

根据文本方案中用于 foxp3 染色的缓冲液配制方法，向各管中加入 100 µL 固定和透化缓冲液以重悬沉淀。充分混匀后，在 4°C 下孵育 30 分钟。随后，向每孔中加入 100 µL 透化缓冲液，离心后吸除上清液。

再次洗涤细胞并选择正确的抗体后，向每个孔中加入 20 µL 已配制好的单克隆抗体混合液，避光，于 4 °C 孵育 30 分钟。使用破膜缓冲液再次洗涤细胞。然后，加入 110 µL FACS 缓冲液重悬沉淀，并将细胞悬液转移至微量 FACS 管中。

最后，如果需要精确的细胞数量，在进行流式细胞术检测前，立即向每个样本加入10 µL充分混匀的荧光微球悬浮液。如图所示，从健康个体皮肤来源的单细胞悬液中鉴定出了不同类型的CD45阳性白细胞，包括CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞以及CD11c阳性树突状细胞。

而观察到的B细胞、NK细胞或巨噬细胞较少。此外，该方法可用于分析人皮肤活检组织中CD4阳性CD25阳性foxp3阳性细胞。例如，通过固定和透化后的细胞内染色，可检测CD25阳性T细胞中转录因子foxp3的表达。

如本实验所示，为避免背景自发荧光以及排除具有自发荧光的细胞群体，建议使用与BV421（Brilliant Violet 421）荧光染料偶联的抗人CD45小鼠抗体，以圈定淋巴细胞群体。该图显示，人类皮肤中大部分常驻细胞为CD3阳性的T细胞。对于细胞活力分析，建议使用可固定型活力染料，以区分活细胞与死细胞或正在死亡的细胞。

为进一步进行功能分析，通过采集银屑病患者皮损部位仅4毫米的皮肤活检样本，研究发现活检来源的T细胞可产生IL-17a和干扰素γ。该结果是在佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）和离子霉素刺激4小时，并在布雷菲德菌素A存在的条件下获得的。最后，该图显示，来自银屑病个体的T细胞产生与银屑病相关的细胞因子IL-17a和干扰素γ的能力显著更高。请务必注意，操作人体组织和实验室试剂可能存在潜在危险。

始终需要考虑安全措施。