Name: 增加肺动脉脉动流改善缺氧性肺动脉高压的仔猪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 了解利用新型脉动导管增强肺动脉可塑性以缓解缺氧性肺动脉高压的研究方法。本研究使用缺氧仔猪模型评估治疗效果，为心血管疾病创新治疗策略提供重要见解。

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作者无任何利益冲突需要披露。

注意：本研究已获得伦理委员会编号 CEEA34.PB.103.12 的批准。
1. 猪仔作为动物模型的应用
<ol>
	<li>将动物分为两组（每组 n = 6），在性别、年龄（15 ± 3 个月）和体重（30 ± 10 kg）上相匹配（对照组和慢性低氧（CH）组）。将 CH 组置于低气压舱（0.4 atm）中饲养 3 周，对照组置于正常常压（1 atm）条件下饲养。</li>
	<li>使用一个由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的低压舱，其底面积为2平方米，高度为1.6米，如图所示。 图1.</li>
	<li>持续监测并维持温度为 18 °C、压力为 0.4 atm。通过真空泵确保充分通风，使空气更新速率达到 8 m3 每小时</li>
	<li>将两只动物放入相应窝垫的舱室内。每48小时，将舱内压力恢复至常压条件半小时，在此期间于密闭舱室中对两只动物进行清洁，以防止其逃逸。该诱导肺动脉高压的方法已得到广泛验证。 13.</li>
	<li>动物麻醉
	<ol>
		<li>用硫喷妥钠（10 mg/kg）静脉注射诱导仔猪麻醉，并通过持续吸入异氟烷（1.5%～3.5%）维持麻醉状态。向仔猪眼部滴加两滴卡波姆凝胶，以防止角膜干燥。</li>
		<li>将动物置于左侧卧位，前肢屈曲并固定，以暴露胸部。先用肥皂和水清洁皮肤，再使用电动剃须刀剃除可能阻碍超声波穿透胸部的毛发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超声心动图</li>
	<li>通过超声心动图对肺动脉高压（PAH）的进展进行纵向、无创监测。使用3 MHz探头每周进行一次超声检查。通过将3个电极分别放置于右前爪、左前爪及胸部右侧来记录心电图。</li>
	<li>使用多普勒探头在三个不同切面（长轴、短轴和心尖）记录二维和M型成像数据。右手持探头，置于左侧第4与第5肋间，缓慢上下移动并左右旋转，直至获得不同心脏结构的清晰图像。即 室间隔）。声学窗口因动物而异，具体取决于心脏在胸腔内的位置。</li>
	<li>同时记录每次事件的ECG，持续至少10个心动周期，以便进行离线分析。舒张末期定义为心动周期中与ECG上Q波起始点相对应的时刻。收缩末期与T波起始点相对应。</li>
	<li>通过心尖切面多普勒超声测量二尖瓣和三尖瓣血流。将多普勒探头置于胸骨柄末端，取样区域位于瓣膜上方，以记录通过瓣膜的血流。</li>
	<li>通过多普勒血流测定法记录心动周期中的血流速度，以获取经二尖瓣和三尖瓣以及主动脉瓣和肺动脉瓣的血流速度-时间积分。使用超声仪的视频图形阵列，以每秒25帧的帧率存储图像，以获得超声仪提供的静态图像或序列图像。</li>
	<li>根据国际建议，使用测量仪器以及超声心动图设备内置软件所提出的表面积轮廓，测量心脏心腔的尺寸和表面积 14.</li>
	<li>通过短轴切面的TM（时间-运动）记录，测量右心室在舒张期和收缩期的游离壁厚度 14.</li>
	<li>在短轴切面中，于肺动脉瓣尖处测量肺动脉主干根部直径 14.</li>
	<li>在心电图 Q 波起始处的舒张期和 T 波顶点处的收缩期，于纵向切面的 M 型运动中测量左心室室间隔和后壁的厚度。 14.</li>
	<li>测量左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室收缩末期内径（LVESD）。采用公式 FS (%) = (LVEDD - LVESD) / LVEDD 计算缩短分数（FS）。测量主动脉直径以及右心房和左心房的表面积。</li>
	<li>根据二尖瓣和三尖瓣血流的流速-时间积分，测量以下指标：E波和A波的最大振幅、E波减速时间半值、血流持续时间、流速-时间指数 14.</li>
	<li>根据肺动脉的多普勒测量结果，测量以下参数：最大流速、上升半时间、血流持续时间及其积分 14.</li>
	<li>使用辛普森法评估左心室容积 15 方法</li>
	<li>将每只仔猪的数据存储在数据库中，以便后续对整个群体进行统计分析。</li>
</ol>
2. 右心导管检查
<ol>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>在放置脉动导管之前，将猪置于低压舱中3周，以诱导肺动脉高压。</li>
		<li>术前禁食24小时（固体食物禁食24小时，水禁食8至12小时）。</li>
		<li>右心导管检查（RHC）前24小时，由经验丰富的兽医进行麻醉前临床检查，评估黏膜颜色、毛细血管再充盈时间、使用听诊器检查肺部和心脏的整体功能，以及使用直肠温度计测量体温。</li>
		<li>在麻醉诱导前15至30分钟&#160;，肌肉注射咪达唑仑（0.5 mg/kg）和盐酸吗啡（0.1 mg/kg）。在诱导期间每4至6小时重复注射一次盐酸吗啡（0.05至0.5 mg/kg，肌肉注射）。</li>
		<li>通过静脉注射硫喷妥钠（10 mg/kg），先以5 mg/kg剂量进行初始推注，随后分次部分注射直至起效。之后通过面罩手动通气，直至完成气管插管。</li>
		<li>仔猪插管
		<ol>
			<li>用普莫卡因凝胶润滑导管。将金属导丝插入导管内以增加其硬度，便于插管操作。</li>
			<li>轻触眼睑以确认深度麻醉。使用喉镜抬高舌头，直视声门进行插管，避免损伤声带。充盈导管气囊以防止反流相关问题。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>控制呼吸频率为每分钟10–12次；潮气量为7–10 ml/kg，通气压力为25至30 cm H2O，吸气相持续2秒，呼气末正压为5 cm H2O。</li>
		<li>使用异氟烷在100%氧气中进行麻醉（诱导浓度3–5%，氧流量2–3 L/min；维持浓度1.5–2.5%，氧流量1 L/min）。参照步骤1.5.1，在角膜上涂抹卡波普凝胶。</li>
		<li>通过皮下输注方式，将肝素化导管插入尾侧耳动脉（5 ml含5,000 IU/ml肝素的0.9%生理盐水），使用绿色套管并以缝线固定。</li>
		<li>输注乳酸林格液（10–20 ml/kg/hr）。</li>
		<li>将动物置于略微倾斜的检查台上，头部稍向下倾斜，以促进唾液引流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测
	<ol>
		<li>每5分钟检查并记录个体麻醉病例报告中的以下指标：黏膜颜色和毛细血管再充盈时间、下颌肌肉张力和眼球位置、瞳孔缩小/散大、眼睑反射。</li>
		<li>持续监测心率和呼吸频率、脉搏血氧饱和度、体温和心电图。将动脉导入器插入股动脉，再插入一根口径较大的10 cm长导管至股动脉，用于监测体循环血压。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脉动导管的设置 
	注：该医疗器械由两根并列焊接的导管组成。第一根导管远端连接一个标准球囊，直径为20 mm，最大容积为5 ml。第二根导管用于插入导丝，以辅助导管在肺动脉内的定位。该装置全长750 mm，内径为0.035，外径为12 Fr。
	<ol>
		<li>实验中使用小型Harvard 683动物呼吸机进行脉动，该呼吸机在球囊放气时施加主动负压，在充气时施加正压，每次脉动体积为2.5 ml。使用氦气作为球囊泵的驱动气体，以防止气体栓塞。</li>
		<li>持续记录体表心电图，以监测实验过程中可能出现的心律失常。在左侧股动脉连接传感器装置至20 G导管，并接入血流动力学监测系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>右心导管检查
	<ol>
		<li>清洗并剃除动物颈部毛发。使用纱布蘸取皮肤消毒液（聚维酮碘 scrub）清洁皮肤。为界定手术区域，在右肩与胸骨柄之间的右侧颈静脉周围铺设无菌巾。</li>
		<li>使用无菌剪刀在右肩与胸骨柄中点处做一条4 cm长的纵向切口。</li>
		<li>用镊子小心分离皮肤和肌肉层，然后轻柔剥离静脉周围约5 cm长度的结缔组织。夹闭远端以防止出血。在近端放置一根结扎线，以便在静脉半切后控制血管开口。</li>
		<li>使用特制的小型锋利凿刀横向将静脉切开一半。确保切口边缘整齐。使用薄泡沫垫起切口一侧边缘，轻柔地将导管推入静脉近端。用结扎线控制出血。</li>
		<li>将导管插入颈静脉，并依次通过上腔静脉、右心房、右心室，最终进入肺动脉。</li>
		<li>在每个心腔及肺动脉内，记录10个稳定心动周期的压力（T0）。每隔1分钟测量心输出量三次。</li>
		<li>在X线透视引导下将球囊导管定位至肺动脉。用1 cm3氦气对球囊进行充气和放气（脉动），持续脉动10分钟。在每个心腔及肺动脉内记录10个稳定心动周期的压力，并在10分钟后（T1）测量心输出量。</li>
		<li>在脉动干预方案结束后30分钟再次测量心输出量（T2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 一氧化氮检测
<ol>
	<li>将道格拉斯袋连接至呼出气体出口管，直至其完全充满。然后将其放置在NO呼吸分析仪的进气管上。</li>
	<li>通过缓慢且持续地挤压有弹性的道格拉斯袋，将呼出的气体压入分析仪中。利用分析仪的流量计监测袋内气体流出量，以保持恒定的气流速度。</li>
</ol>
4. 组织学测量
<ol>
	<li>在麻醉状态下，将 30 ml 的 Dolethal（安乐死用注射液）注入心脏内留置的搏动性导管中。</li>
	<li>安乐死后立即用锯子纵向锯开胸骨，轻微移动心脏并固定右肺。然后使用解剖剪刀从肺中叶切取两块 2 或 3 cm3 的组织样本。</li>
	<li>将其中一个样本在液氮中速冻后于 -80 °C 保存；将另一个样本用 3.7% 多聚甲醛固定 24 小时，随后包埋于石蜡中，用于后续组织学分析。</li>
	<li>组织学检测方法参照先前描述16。肺动脉壁厚度测量方法如下：每只幼猪检测 10 条动脉，每条动脉测量 2 次，每组共 6 只幼猪。</li>
	<li>进行统计学分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示的倍数变化表示。
	<ol>
		<li>比较两组均值时采用非配对 Student t 检验；比较多组均值时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Dunn 检验。当 p &#60;0.05 时认为差异具有统计学显著性（*）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者感谢INRA研究所为仔猪提供的饲养场所，以及Cardio Innovating systems提供的资金支持。

首次发现，肺部脉动血流的变化与慢性缺氧暴露继发的肺动脉高压（PAH）的发生存在因果关系。这种转化医学方法表明，使用专门设计的导管人为增加肺部脉动血流可改善肺动脉高压，其机制可能是通过增加一氧化氮（NO）的生成实现的。
这些发现不仅具有原创性，而且具有重要的治疗意义，表明在肺循环中可以通过机械方式安全地刺激内源性一氧化氮（NO）的产生，同时不影响全身功能。该研究设计符合肺动脉高压领域最新的临床前研究建议，该建议最近提出在将新方法应用于临床之前，应先在大型动物身上进行测试。这些发现的转化潜力非常高。
然而，肺动脉高压（PAH）的病理生理机制并非单一。PAH 的分类将其分为五个不同组别。第三组代表由慢性缺氧引起的中膜肥厚。尽管该模型可归入此组，但并不能完全模拟人类的 PAH。人类由慢性缺氧继发的 PAH 主要与慢性支气管炎相关，其支气管和肺实质的病变可导致外周肺循环至体循环的分流。这些分流通过与该模型不同的机制引起低氧血症。因此，该模型更接近于高海拔生活状态，而非肺部疾病。然而，该模型的心脏血流动力学与人类相近：心率相同、心输出量相...

肺动脉高压是一种影响肺血管系统的危及生命的疾病。该领域普遍认为，血管收缩因子（内皮素、5-羟色胺）增加与血管舒张因子（一氧化氮、前列环素）减少之间的失衡，促进了肺动脉高压的发生发展。随着时间推移，这种促收缩表型会演变为复杂的促增殖和抗凋亡表型，从而导致血管病变的形成1。
长期暴露于血管收缩剂会导致肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）显著且持续升高，从而激活多种钙调节的转录因子（如NFAT2-4），促进肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖并抵抗凋亡表型5。该表型可导致肺血管病变，增加肺动脉压力和肺血管阻力，最终引发致命性的右心衰竭6。
目前尚无能够逆转肺动脉高压（PAH）的治疗方法，尽管已有多种治疗手段可改善患者的生活质量7。在这些治疗方法中，吸入一氧化氮（NO）治疗的有效性已得到证实，但由于其半衰期较短，临床应用困难。因此，临床上更倾向于使用更稳定、持久的治疗方式，例如前列环素类似物或内皮素受体拮抗剂7。为了开发更有效的治疗方法，深入并拓展对PAH病理生理学的认识至关重要。
脉动性是已知可激活剪切应力诱导血管舒张的刺激因素，能够保护非弹性远端动脉免受高压血流损伤8,9。在主动脉-肺动脉手术分流继发肺动脉高压（PAH）的模型中，Nour et al. 证明了肺内剪切应力介导的内皮功能增强10。多项研究表明，一氧化氮（NO）、前列环素和内皮素-1（ET-1）的表达受到脉动血流变化的密切调控。事实上，脉动血流适度增加可提高内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性和前列环素水平，而这两者在肺动脉高压中均降低。脉动血流的调节可能参与了肺动脉高压的发病机制，而人工增加脉动血流是一种有吸引力且新颖的方法，可促进肺循环中NO和前列环素的生成。
本研究旨在评估使用新开发的脉动式导管进行10&#160;分钟脉动血流灌注，在低氧诱导的肺动脉高压（PH）幼猪模型中对血流动力学测量指标的影响。研究假设增加肺动脉的脉动性可诱导肺动脉血管舒张，从而降低肺动脉压力。
右心导管检查（RHC）是诊断和随访肺动脉高压（PAH）患者的关键临床干预手段。事实上，这是诊断PAH最可靠的方法，可使医生评估血管反应性11,12以及疾病进展。实际上，每位PAH患者都会接受多次RHC检查。本研究在大型动物中开展，旨在证明在常规RHC操作过程中，脉动导管在评估和治疗PAH方面的有效性和安全性。由于脉动导管已可获得，且RHC在PAH患者中已常规开展，本研究提供了快速开展临床试验所需的全部信息。

<table><tbody><tr><td>麻醉药物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫喷妥钠，THIOPENTAL SODIUM</td><td>Abbott, 法国</td><td>0000071-73-8</td><td>粉末&lt;br/&gt; 3 place Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;异氟烷，FORANE</td><td>Abbott, 法国</td><td>05260-05</td><td>玻璃瓶装 250 ml&lt;br/&gt; 3 place Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.</td></tr><tr><td>咪达唑仑，Hypnovel</td><td>Accord Healthcare&amp;nbsp;</td><td>Vidal</td><td>注射用安瓿 1mg/ml&lt;br/&gt; 45 Rue du Faubourg de Roubaix 59000 里尔 法国</td></tr><tr><td>普莫卡因，TRONOTHANE 1%&amp;nbsp;</td><td>Laboratoires LISAPHARM</td><td>Vidal</td><td>局部应用凝胶 T/30g&lt;br/&gt; 3, rue Scheffer. 75016 巴黎.</td></tr><tr><td>盐酸吗啡 Lavoisier</td><td>CMD Lavoisier Laboratoires CHAIX et DU MARAIS</td><td>Vidal</td><td>注射用安瓿&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 7, rue Labie -75017 巴黎 - 法国</td></tr><tr><td>丙烯酸酯共聚物-Carbopol&amp;reg; Aqua SF-1 聚合物</td><td>Lubrizol</td><td></td><td>局部应用凝胶&lt;br/&gt; Elys&amp;eacute;es La D&amp;eacute;fense 19 le Parvis 92073 巴黎 la d&amp;eacute;fense</td></tr><tr><td>材料&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>哈佛呼吸机 683</td><td>Harvard apparatus</td><td>Harvard apparatus</td><td>DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>配备 3.5 MHz 探头的 Voluson E8 超声仪</td><td>通用电气</td><td>GEHealthcare</td><td>DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pulsatil 导管</td><td>Cardio inovating system</td><td></td><td>Cardio innovative systems, 33 rue Vivienne, 巴黎, 法国 75002</td></tr><tr><td>一氧化氮呼吸分析仪</td><td>Respur</td><td>Respur</td><td>26 rue Felix Rouget 95490 Vaureal 法国</td></tr></tbody></table>

增加肺动脉搏动性血流可改善仔猪低氧性肺动脉高压

Increasing Pulmonary Artery Pulsatile Flow Improves Hypoxic Pulmonary Hypertension in Piglets

肺动脉高压（PAH）是一种影响肺小动脉的疾病。这些动脉发生变形，导致右心室衰竭。目前的治疗方法有限。从生理学角度看，脉动性血流对血管系统有害。作为对持续脉动应力的响应，血管会释放一氧化氮（NO），以诱导血管舒张，实现自我保护。基于这一观察，本研究建立了一种实验方案，用于评估人工肺部脉动血流是否能够通过依赖一氧化氮的机制，降低肺动脉压力。一组幼猪暴露于慢性低氧环境持续3周，并与对照组幼猪进行比较。每周对幼猪进行一次超声心动图检查，以评估肺动脉高压的严重程度。在低氧暴露结束后，对幼猪实施使用脉动导管的脉动干预方案。在麻醉并完成手术准备后，在放射透视控制下，分离幼猪的颈静脉，并将导管经右心房、右心室插入肺动脉。在脉动干预前（T0）、干预后即刻（T1）以及干预后30分钟（T2）测量肺动脉压（PAP）。结果表明，该脉动干预方案是一种安全且有效的方法，可通过依赖一氧化氮的机制显著降低平均肺动脉压。这些数据为肺动脉高压的临床管理开辟了新的途径。

增加肺动脉脉动血流可改善仔猪缺氧性肺动脉高压
在使动物暴露于脉动血流增加之前，采用超声无创检查确认猪仔是否已形成肺动脉高压。如图所示 图2，三周的慢性缺氧在仔猪中诱导了肺动脉高压的发生，表现为肺动脉加速时间显著缩短（多普勒法）以及右心室肥厚增加（M型超声心动图）。在右心导管检查（RHC）中，慢性缺氧仔猪与对照组仔猪相比，右心室收缩压（RVSP）和平均肺动脉压（PA pressure）的有创测量值均证实存在肺动脉高压（T0时数值）（图3）。右心室舒张压在对照组为 -3 ± 1 mmHg，在肺动脉高压组为 -2 ± 1 mmHg；两组的房压均为 -4 ± 2 mmHg。体循环压力为 106 ± 13 与 对照组为95 ± 18 mmHg 与 PAH组。通过组织切片上血管重构的量化分析，也证实了肺动脉高压的存在。为了评估搏动性血流对肺动脉高压可能的治疗作用，使用搏动性导管产生人工搏动性肺血流，持续10分钟。如图所示 图3 10分钟的脉动血流增加导致右心...

肺动脉高压与肺动脉脉动性、收缩性和弹性的显著降低相关，这会导致肺动脉压力和肺血管阻力升高。本研究利用低氧幼猪模型证明，使用一种新开发的脉动导管改善肺动脉可塑性，可有效改善低氧性肺动脉高压。

肺动脉高压（PAH）是一种影响肺动脉远端分支的疾病。这些动脉发生变形，导致右心室……

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科研

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Medicine

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增加肺动脉脉动流改善缺氧性肺动脉高压的仔猪

大型动物模型在研究新生儿窒息的生理学和药理学方面具有良好的转化价值。我们采用新生仔猪建立了一种模拟新生儿窒息的实验方案，该模型有利于系统研究全身和局部血流动力学、氧转运及其与生化和病理通路之间的关联。...

一种新生仔猪缺氧窒息模型

我们开发了一种新颖且可重复的技术，能够从小至P7日龄的小鼠中分离肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的原代培养物，从而更深入地研究参与新生期平滑肌细胞收缩与舒张的信号通路。...

从新生小鼠中分离肺动脉平滑肌细胞

通过逐步阻塞肺动脉，在仔猪中诱导出慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）和右心室（RV）功能障碍。其表现与CTEPH患者中观察到的情况极为相似。该动物模型对于开展CTEPH及右心室衰竭的病理生理学和治疗研究将是一个非常有用的工具。...

慢性血栓栓塞性肺动脉高压及仔猪右心室功能评估

本方案描述了一种在大鼠中建立血流诱导肺动脉高压（PAH）模型的手术方法，以及分析该模型主要血流动力学和组织学终点的实验步骤。...

分流手术、右心导管检查及血管形态测量在血流诱导型肺动脉高压大鼠模型中的应用

我们介绍了一种通过诱导急性呼吸窘迫综合征（ARDS）在猪模型中建立右心室功能障碍的实验方案。我们展示了通过在主动脉和肺动脉周围放置血流探头来侵入性监测左心室和右心室心输出量的方法，以及在主动脉和肺动脉内进行血压测量的技术。...

ARDS 大动物模型中主动脉与肺动脉血流动力学的有创监测

啮齿类动物左肺切除术是肺动脉高压研究中一种有价值的技术。本文介绍了一种大鼠肺切除术的操作方案及术后护理方法，以确保最低的发病率和死亡率。...

左全肺切除联合野百合碱或Sugen建立大鼠肺动脉高压模型

本文描述了建立严重右心室压力超负荷的手术技术和实验方法，以模拟其适应性和非适应性表型。...

一种用于肺动脉高压和右心室衰竭的大型动物模型：绵羊左肺动脉结扎与进行性主肺动脉缩窄

本方案展示了如何通过对血容量正常的猪或仔猪的中心静脉持续输注晶体液，以适当研究急性容量超负荷的生理效应。...

成人与儿童猪急性容量超负荷模型

本文介绍了通过向气道注射博来霉素建立与肺纤维化相关的肺动脉高压（PF-PH）大鼠模型的方法。同时提供了对该动物模型进行验证的逐步操作流程。...

建立并验证与肺纤维化相关的肺动脉高压大鼠模型

本方案描述了一种新生仔猪急性肺损伤模型的建立方法，该模型模拟早产肺中发生的早期致病事件，包括表面活性物质不足、高氧暴露、高压通气以及炎症反应，旨在促进对支气管肺发育不良分子触发机制的理解，并推动治疗策略的转化应用。...

建立一种新生仔猪急性肺损伤模型以重现早产儿肺部早期环境

了解利用新型脉动导管增强肺动脉可塑性以缓解缺氧性肺动脉高压的研究方法。本研究使用缺氧仔猪模型评估治疗效果，为心血管疾病创新治疗策略提供重要见解。

增加肺动脉搏动性血流可改善仔猪低氧性肺动脉高压

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