生成三维全层皮肤等效物及自动化伤口制造

本实验的总体目标是构建一种三维全层皮肤等效物，该等效物具有类似天然皮肤的结构，并在无菌条件下使用自动化损伤装置产生精确且可重复的伤口。首先将原代人真皮成纤维细胞包埋于I型胶原蛋白水凝胶中，随后将原代人表皮角质形成细胞接种于经纤连蛋白包被的水凝胶表面，从而实现上述目标。

然后将模型在浸没条件下培养，再于气液界面条件下培养，形成由真皮组分和多层表皮组成的三维全层皮肤等效物。最后，在无菌环境中制造标准化的伤口。最终通过免疫组织化学染色和显微镜观察来评估受损全层皮肤等效物的组织学结构。

与现有方法（例如动物模型）相比，该技术的主要优势在于，全层皮肤等效物由原代人类细胞构成。因此，结合自动化致伤装置，我们能够生成标准化的伤口。该自动化致伤装置可为人类化环境下的皮肤伤口愈合过程提供深入见解。此外，该装置还可应用于我们的其他系统，如骨组织工程。

该方法有助于回答有关伤口愈合的关键问题，例如生物学过程、皮肤修复的潜在机制，以及表皮与真皮组分之间的细胞间串扰。首先，用0.1%乙酸溶解胶原蛋白，使其终浓度为每毫升6毫克。通过混合232.5毫升2倍DMEM、7.5毫升FCS、7.5毫升3摩尔HEPES以及2.5毫升每毫升5毫克的溶液，制备凝胶中和液。

将硫酸软骨素放置于24孔板的孔中，分离人真皮成纤维细胞或HDF，并将细胞悬液在270 ×g下离心5分钟。计数细胞后，取1,200,000个HDF，在270 ×g下离心5分钟。弃去上清液，加入4毫升冷却的凝胶中和溶液，轻柔重悬HDF，避免产生气泡。

然后用 8 毫升胶原蛋白溶液重悬该溶液。接着使用多通道移液器，将 500 微升胶原细胞混合物加入每个插入物中。将 24 孔板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 20 分钟，使凝胶充分凝固。

然后每孔加入2毫升DMM培养基，添加10% FCS。为使凝胶完全浸没，将凝胶孵育24小时。使用超纯水溶解人纤维连接蛋白（fibronectin），使其终浓度为50微克/毫升。

将真皮等效凝胶孵育24小时后，移除培养基。每块真皮等效物使用25微升纤连蛋白溶液覆盖，并将凝胶继续孵育30分钟。在此期间，将人表皮角质形成细胞或HKS用KGM™-2培养基加5% FCS重悬，调整细胞浓度至每升100万个细胞，每块凝胶上接种100,000个细胞。

然后将凝胶孵育45分钟，使细胞在含有5%胎牛血清（FCS）的KGM-2完全培养基中贴壁，并继续孵育。孵育2至3天后，更换为含2% FCS的培养基，再过2至3天后更换为不含FCS的培养基。第7天，完全移除培养基。

使用无菌镊子将每个插入物放入六孔板的一个孔中，然后每孔加入 1.5 毫升气液界面培养基。注意不要润湿 FTSC 的表面。

每隔两到三天更换一次培养基，持续额外14天。使用70%乙醇和紫外线照射对工作区域进行消毒，并用无菌镊子准备自动划伤装置。将皮肤等效物放入灭菌器样品载板的指定区域。

将样品载板放入钻孔头下方的插槽中。使用控制软件设置损伤参数如下：旋转速度 15,000 RPM，穿透深度 1.5 毫米。

推进频率 100 赫兹。将损伤参数传输至自动损伤装置。参数传输完成后，开始损伤程序。

从插座中取出样本载板，使用无菌镊子将受损的FTSE转移回用于培养的插入式培养器中。将受损的FTSE孵育至进行实验评估为止。可在任意时间使用模型进行组织学分析。

在将分离的HDFS和HKS用于FTSE之前，通过免疫组织化学染色对其进行表征。HDF对纤维细胞标志物menton呈阳性，原代HEK高表达早期分化蛋白角蛋白14（CYTOKERATIN 14），但几乎不表达晚期角质形成细胞分化蛋白角蛋白10（CYTOKERATIN 10）。FTSE在浸没培养条件下培养7天，随后在气液界面培养14天。

在此过程中，FTSC 在 21 天内显著收缩。通过调整培养基液面高度使模型表面暴露于空气中，HEK 得以增殖。同时，通过提高钙离子浓度，HKS 被诱导分化为多细胞表皮，该表皮由多层具有活性的角质形成细胞构成。

在不同分化状态的D细胞及角膜心房中，通过比较FTSE与天然人皮肤的苏木精-伊红染色结果，可以明显看出FTSE模拟了皮肤的组织学结构。胶原蛋白一型水凝胶中的HDF可用抗波形蛋白的特异性抗体进行染色。

此外，角质形成细胞形成由细胞角蛋白14阳性细胞和晚期分化标志物组成的表皮层。细胞角蛋白10在基底层上方的细胞层中表达。进一步地，随着其发育，角质层对RIN呈阳性。

该技术为皮肤病学领域的研究人员探索皮肤伤口愈合以及建立高度模拟人体皮肤的标准化体外实验体系铺平了道路。