三维全层皮肤的生成等效和自动伤人

该程序的总体目标是建立一个类似于自然皮肤的三维全层皮肤，并使用自动伤口装置在无菌条件下生成精确且可重复的伤口。这是通过首先将原代人真皮成纤维细胞包埋在胶原蛋白 1 水凝胶中来实现的。接下来，原代人表皮角质形成细胞位于纤连蛋白包被的水凝胶的顶部。

然后在水下条件下培养模型，然后在气液界面下，形成由真皮成分和多层表皮组成的三维全层皮肤等效物。最后，在无菌环境中生成标准化伤口。最终，免疫组织化学染色和显微镜检查用于评估受伤全层皮肤的组织学结构。

这种技术与现有方法（例如动物模型）的主要优点是，全层皮肤等效物由原代人体细胞组成。因此，与自动伤器一起，我们可以生成标准化的伤口，因此，自动伤器可以在人性化环境中提供对皮肤伤口愈合过程的洞察。它也可以应用于我们的系统，例如骨组织工程。

这种方法可以帮助回答伤口愈合的关键问题，例如生物过程、潜在的皮肤修复以及表皮和真皮成分之间的细胞串扰。首先，用 0.1% 乙酸溶解胶原蛋白，最终浓度为 6 毫克/毫升。通过混合 232.5 毫升 2 X dmm、7.5 毫升 FCS、7.5 毫升、3 摩尔嘻和 2.5 毫升 5 毫克/毫升来制备凝胶中和溶液。

硫酸软骨素置于 24 孔板的孔中，分离人真皮成纤维细胞或 HDFS，并将细胞悬液离心 5 分钟。在 270 G 的浓度下，对细胞进行计数，并将 1， 200， 000 HDF 的 Eloqua 离心 5 分钟。在 270 G 时，去除 snat 并使用 4 毫升冷却的凝胶中和溶液小心地重悬 HDF，而不会产生气泡。

然后用 8 毫升胶原蛋白溶液重悬溶液。接下来，使用多步移液器并向每个插入物中加入 500 微升胶原蛋白细胞混合物。在 24 孔板中，将凝胶在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 20 分钟，以使凝胶凝固。

然后每孔使用 2 毫升 DMM 加 10% FCS。要浸没凝胶，请将凝胶孵育 24 小时。使用超纯水溶解人纤连蛋白至终浓度为 50 μg/mL。

将真皮等效凝胶孵育 24 小时后，去除培养基。使用 25 μL 纤连蛋白溶液覆盖每个皮肤当量，并将凝胶孵育 30 分钟。同时，用 kgm 2 加 5%FCS 重悬人表皮、角质形成细胞或 HKS 至最终浓度为每升种子 100 万个细胞，每个凝胶顶部 100， 000 heeks。

然后孵育凝胶 45 分钟，使细胞粘附，使用 kgm 2 ready 加 5% FCS 浸没细胞并继续孵育。孵育 2 到 3 天后，用 2% FCS 替换培养基，然后在 2 到 3 天后更换不含 FCS 的培养基。第 7 天，完全去除培养基。

使用无菌镊子将每个插入物放入六孔板的一个孔中。然后每孔加入 1.5 毫升 airlift 培养基。注意不要弄湿 FTSC 的表面。

每 2 到 3 天更换一次培养基，再延长 14 天。通过使用 70% 乙醇和紫外线准备自动伤口装置，使用无菌镊子对工作区域进行消毒。将皮肤等价物放入高压灭菌器样品载体板的指定区域。

将样品载板放入钻头下方的插座中。使用控制软件设置伤害参数，如下所示。旋转速度 15， 000 RPM 穿透力，1.5 毫米。

推进器 100 赫兹。将伤线参数传输到自动伤线装置。完成后开始伤人程序。

从插槽中取出样品载板，并使用无菌镊子将受伤的 FTSE 转移回用于培养的插入物中。孵育受伤的 FTSE 直到实验评估。随时使用这些模型进行组织学分析。

分离的 HDFS 和 HKS 在用于 FTSE 之前通过免疫组织化学染色进行表征。HDF 阳性 menton，这是成纤维细胞原代 HEK 的标志物 高表达早期分化蛋白 CYTOKERATIN 14，但几乎没有晚期角质形成细胞分化蛋白 CYTOKERATIN 10。FTSE 在浸没培养基条件下培养 7 天，然后在气液界面培养 14 天。

在此过程中，FTSC 在 21 天内大幅收缩。HEK 通过改变中等水平以使模型的表面暴露在空气中的方式增殖。通过增加钙浓度，刺激 HKS 分化为多细胞表皮，该表皮由角质形成细胞的几个重要细胞层组成。

处于 D 分化和心房角膜的不同状态。将 FTSE 的血红素和伊红染色与天然人类皮肤进行比较，很明显 FTSE 模拟了皮肤的组织学结构。胶原蛋白一水凝胶中的 HDF 可以用抗波形蛋白的一抗染色。

此外，角质形成细胞形成由细胞角蛋白 14 阳性细胞和晚期分化标志物组成的表皮层。CYTOKERATIN 10 在超基底层表达。此外，St.Stratum cornium 发育后对 RIN 呈阳性。

这项技术为皮肤病学领域的研究人员探索皮肤伤口愈合和密切模仿人体皮肤的标准化体外设置铺平了道路。