生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

本实验的总体目标是利用整合方法来表征生物膜与其周围环境之间的相互作用。构建一种双入口微流控流动池系统，将含葡萄糖和不含葡萄糖的培养基泵入流动池，形成葡萄糖浓度梯度。将细菌引入系统后，使其在数天内逐步形成生物膜。

随后通过三维共聚焦显微镜对生物膜进行成像，以表征溶质的传输情况。在生物膜内，将荧光示踪剂注入流动系统，并进行延时成像，以表征生物膜菌落周围的流场；随后注入荧光微珠，再进行延时成像。对所得数据进行溶质传输和粒子追踪分析，结果表明该方法能够在单个装置内、通过一组实验评估不同化学环境下生物膜过程的有效性。

该方法的主要优势在于能够同时评估生物膜与环境相互作用的多个方面。本文所报道的方法有助于回答有关自然环境中或与生物膜相关感染中生物膜形成的若干关键问题。在超净工作台中操作，将一株表达GFP的铜绿假单胞菌PAO1菌落以及一株大肠杆菌DH5α菌落，分别从LB平板转移至含有3 mL LB液体培养基的独立离心管中。

将培养物在37摄氏度、225 RPM振荡条件下培养过夜。该流动系统基于一种双入口微流控细胞装置，可在流动腔内通过混合两种溶液形成明确定义的化学梯度，从而便于观察生物膜的生长情况。在流动过程中，横向会形成平滑的浓度梯度。

由于扩散作用，靠近入口处的浓度梯度较陡，而下游则更为平缓。在实验当天，仔细组装流动系统：首先将管路固定到蠕动泵中，然后将管路的一端连接至含有900毫升含葡萄糖FAB培养基的培养瓶，另一端连接至气泡捕集器。

重复此步骤，将另一个装有 900 毫升无葡萄糖 FAB 的培养基瓶连接到第二个气泡捕集器。接着，在流式细胞池入口前安装三通阀，并将每个气泡捕集器连接至流式细胞池。最后，将流式细胞池的出口连接至废液瓶。

确保将流动池的盖玻片一侧朝下放置，以便悬浮细胞沉降到盖玻片表面。组装好流动系统后，启动蠕动泵，每个入口的流速设为每小时10毫升，用培养基（fab培养基）灌注系统，其中两个入口均引入培养基，但仅在一个入口提供葡萄糖。接下来，在生物安全柜中操作，将两种细菌培养物用1毫升无菌水按1:1的比例稀释，每种细菌的OD600值均调整至0.01，用于接种流动池。使用无菌塑料注射器，通过三通阀向流动池的每个入口各注入500微升接种液。

注射后，停止泵流，让细菌细胞在盖玻片上附着一小时。细胞附着后，将泵速设置为每个入口 0.03 毫升/分钟，并在室温下持续流动三天，期间在葡萄糖浓度梯度条件下形成生物膜。三天结束后，使用记号笔和直尺在流动池的盖玻片一侧绘制网格，以备成像使用。

这将有助于定位用于观察大肠杆菌的成像区域进行复染。首先，关闭灯光以使工作区域变暗，因为复染剂对光敏感。使用注射器将一毫升稀释后的细胞通透性红色荧光核酸染料缓慢注入流室上游的三通阀中。

停止流动。将流动池置于黑暗中静置 30 分钟。30 分钟后。

以每分钟 0.03 毫升的流速恢复流动，冲洗未结合的染料 15 分钟。然后停止流动，使用 63 倍物镜通过共聚焦显微镜观察生物膜。选择一个含有适量生物量且生物膜菌落分布清晰分离的视野，如图所示。

然后在适当的通道中采集三维图像序列，以绘制流式细胞仪图像内生物膜发育的空间模式，获取沿流式细胞仪入口三个或更多纵向（X方向）距离处的生物膜，以及相对于施加的营养梯度在三个横向（Y方向）位置处的生物膜。为了表征生物膜内溶质的运输模式，从流式细胞仪开始实验。在生物膜培养三天后，再次于避光条件下操作。

停止泵以暂停流动，打开气泡捕获器以释放注射压力。然后使用注射器将一毫升稀释的科幻示踪剂溶液注入流式池上游的三通阀之一。注射科幻溶液后，关闭气泡捕获器。

调整三通阀，并以每分钟0.03毫升的流速重新启动泵，将科幻溶液注入流动池。接下来，将共聚焦成像模式切换至XYT模式，帧速率为0.15赫兹。为描述染料渗透过程，建议采用高时间分辨率，但快速扫描会降低图像质量。

因此，需设置扫描速度和线平均值，以平衡成像的时间分辨率与图像质量。成像参数设定后，重新启动泵以恢复流动。以每分钟0.03毫升的流速，sci five将同时被输送至流动池中。

启动延时共聚焦成像。延时成像完成后，根据随附文档中的说明进行扩散分析。

为了表征生物膜周围的流场，将荧光标记的一微米微珠稀释于无菌水中，最终固含量浓度为0.2%，终体积为0.5毫升。然后涡旋振荡以确保微珠充分分散，暂停流动后将稀释的荧光微珠注入并输送至流动池中。同前，将流速调节至0.01毫升每小时。

低流速有助于精确追踪粒子路径。将共聚焦显微镜设置切换至XYT模式，并指示软件在单个Z层面上追踪粒子运动。以每秒一帧的帧率采集时间序列图像，方法同前。

重复颗粒注射步骤，并在不同的Z位置进行成像。完成成像后，按照随附文档中的说明计算流速矢量，以研究葡萄糖梯度下生物膜中细菌的相互作用。通过反染色法在双物种生物膜中区分 Posa GFP 与 E. coli。

在流式细胞室的九个成像区域中，每个区域均采集了62张细胞图像。在本图所示的叠加图像中，posa GFP 显示为绿色或黄色，大肠杆菌（e coli）显示为红色。在高葡萄糖浓度区域，生物膜的生物量主要由 posa 占据主导地位；而在低葡萄糖浓度区域，则主要由大肠杆菌（e coli）占主导地位。

因此，这两种物种占据了不同的生态位。这些结果证明了双入口微流控流动池在研究复杂环境中生物膜发育活性及相互作用方面的实用性。观看本视频后，您应能充分理解如何利用双入口微流控流动池在化学梯度条件下培养生物膜，以及如何通过注入荧光颗粒或示踪剂来获取生物膜发育过程中的环境参数。

这些方法为环境与临床微生物学领域的研究人员探索微生物群落与其周围环境之间的复杂相互作用奠定了基础。