Lepr^db 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

本实验的总体目标是从糖尿病 LEP R DB 小鼠中获取具有活性的活体胰岛，并利用活细胞双光子成像技术评估胰岛内β细胞的胰岛素分泌情况。首先需准备相关试剂，包括用于胰腺消化的酶混合液、胰岛培养用的培养基，以及双光子检测所用的细胞外缓冲液。随后，打开已处死小鼠的腹腔，将酶混合液注入胰腺以消化该器官。

然后将胰岛从胰腺消化物中分离出来并进行培养。最后，利用双光子显微镜对胰岛内β细胞中单个胰岛素颗粒的融合进行成像。该方案最终将有助于研究人员理解在健康和疾病状态下胰岛素分泌的调控机制。

眼泡分离技术的主要优化在于使用混合酶以提高眼泡的得率和活性。双光子成像技术目前是记录完整眼泡内多个细胞胰岛素分泌的唯一方法。为制备用于分离胰腺眼泡的酶液，将一管5毫克的胶原酶TL用26毫升DMEM稀释，将IV型胶原酶在Hank's缓冲液中配制成0.5毫克/毫升的浓度，并补充以下混合的胶原酶TL和胶原酶溶液。

按体积比四比一将酶混合物分装，每份2.5毫升，于-20°C保存。在含有1升水的大锥形瓶中配制RPMI分离培养基，室温下溶解一管RPMI 1640粉末，加入2克碳酸氢钠和4.02克HEPES。用氢氧化钠调节pH至7.4，然后过滤、灭菌，并于4°C保存。

为双光子成像制备 RPMI 培养基，需在 RPMI 分离培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素。使用以下试剂配制富钠细胞外缓冲液。为制备细胞外染料，将磺酰罗丹明 B（SRB）配制成 8 毫摩尔的储存液，分装至小管中，每管含一份细胞外缓冲液，于 -20 °C 保存。

为获得工作浓度，使用新鲜的细胞外缓冲液将储备液按1:10比例稀释。在按照文本方案用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体后，将小鼠牺牲，然后将其体位调整为头部朝向术者、尾部远离术者。通过腹部皮肤和腹膜做两条长的侧向切口，形成一个V形皮瓣。

提起皮肤瓣以暴露整个腹腔。将肠管移至一旁，并用折叠的组织固定肝脏位置，以显露胆总管。接着，在十二指肠壁的壶腹部施加血管夹，防止注入的酶进入十二指肠。

这一步骤至关重要，它决定了胰酶是否进入胰管反流、注射部位或进入十二指肠。使用31号针头穿刺胆总管，穿刺位置位于肝总管与胆囊管汇合处附近，并预留第二次注射的空间。如果首次灌注胰腺失败，则缓慢向小鼠胆总管内注射约2毫升的冷酶混合液。

如果夹子位置正确，胰腺将迅速被灌注。胰腺灌注完成后，迅速取出器官，放入玻璃小瓶中，并在37摄氏度水浴中孵育约19分钟。孵育结束后，加入约20毫升冷分离培养基以终止消化过程。

轻轻振荡小瓶以破坏胰腺组织，然后将其通过孔径为一毫米的普通筛网，倒入无菌的50毫升离心管中。用分离培养基加满离心管，并在400 G、4摄氏度条件下离心一分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入分离培养基并充分溶解。

然后将悬液转移至两个15毫升离心管中，再次离心。吸除上清液后，向每个样本中加入6毫升密度梯度细胞分离介质，并用移液器吹打或涡旋振荡以重新悬浮。然后沿离心管管壁缓慢加入约6毫升分离介质，覆盖在密度梯度分离介质上方，于100 ×g、4°C条件下离心15分钟。

分离后，将上层、中层和下层分别收集到三个不同的器皿中。然后在解剖显微镜下，使用移液器从这三个器皿中手工挑选出小孔结构。大部分小孔结构位于中层，以利于其从酶消化过程中恢复。

在25厘米的培养皿中，每组40个眼状体，加入6毫升含10毫摩尔葡萄糖的RPMI培养基，培养两天。每天更换培养基，以进行双光子成像，作为检测胰岛素分泌的间接方法。首先，使用含3毫摩尔葡萄糖的细胞外缓冲液对培养两天的眼状体进行预孵育。

将润滑脂涂抹于显微镜载物台上，持续30分钟，以防止溶液泄漏，并将含有玻片的温控腔室安装在显微镜载物台上。随后，加入500微升含有0.8毫摩尔SRB及不同浓度葡萄糖的细胞外缓冲液覆盖腔室。接着，将预先孵育的环状组织置于腔室中央，并聚焦于环状组织内部的三到四层细胞。

在啮齿类动物的眼部切片中，通过胰岛素免疫染色显示大多数细胞为β细胞。然后使用双光子显微镜和60倍油浸物镜，通过微小荧光斑点的突然出现来识别单个胞吐酸性事件。最后，在扫描图像软件中，通过野生型小鼠感兴趣区域内荧光信号的快速上升相确认该事件。

采用本视频中演示的方案，预计可获得约200个眼状结构（eyelets）。健康的眼状结构外观明亮、呈圆形，边缘光滑。而消化不足的分离样本通常含有较小、模糊的眼状结构，以及附着有非目标细胞的眼状结构。

尽管在响应葡萄糖或高钾等刺激时，过度消化的批次在双光子检测中表现出较少的孔洞，但当胰岛素颗粒与质膜发生融合时，SRB会进入颗粒，从而导致出现一个直径约为400纳米的突然荧光点。在记录的时间范围内，所有响应刺激的胞吐事件均被识别出来，包括事件的位置、出现时间、持续时间以及融合类型。诸如“KISS和Run”或完全融合等事件被加以表征，这对于评估2型糖尿病模型中颗粒融合缺陷具有重要价值。

该方法被用于证明糖尿病 DB DB 胰岛中的缺陷是完全颗粒融合的丧失，而非单个颗粒融合动力学的改变。此外，影响疾病状态下胰岛素分泌减少的最主要因素是响应性细胞数量的减少。观看本视频后，您应能充分理解来自左侧 RDB 小鼠的胰腺灌流与胰岛离体激活技术，并能够开展双侧舌下注射实验，以评估完整胰岛内的分泌反应发生情况。