Name: 瘦素受体分贝 2型糖尿病小鼠模型:胰岛分离和活细胞双光子成像完好胰岛 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习从Lepr db糖尿病小鼠模型中分离胰岛并进行活细胞双光子成像的方法，用于实时评估β细胞胰岛素分泌。该技术为研究2型糖尿病发病机制提供了重要工具。

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本工作得到了澳大利亚研究理事会基金 DP110100642（资助对象：PT）以及国家健康与医学研究理事会基金 APP1002520 和 APP1059426（资助对象：PT 和 HYG）的支持。

注意：所有实验均根据昆士兰大学动物伦理程序进行（已获昆士兰大学解剖生物科学伦理委员会批准）。
1. 胰岛分离
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>酶混合物
		<ol>
			<li>对于胰腺消化，使用liberase和IV型胶原酶的混合物。将1瓶5 mg的liberase TL（thermolysin low）用26 ml DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）溶解。</li>
			<li>在 Hank’s 缓冲液中配制 IV 型胶原酶，浓度为 0.5 mg/ml，添加 5 mM HEPES 和 0.5 mM CaCl₂2，0.1 mg/ml DNA酶和1 mg/ml牛血清白蛋白。</li>
			<li>将 liberase TL 溶液与胶原酶溶液按 4:1（体积比）混合， 即，4 ml Liberase TL + 1 ml 胶原酶。将酶混合物分装为每份2.5 ml，于-20 °C保存。 
			注意：不同批次的酶处理时，组织孵育时间略有差异（30 秒&#160;至1分钟&#160;因此，可能需要进行批次测试。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RPMI 分离培养基
		<ol>
			<li>将一管 RPMI 1640 粉末在室温下溶于 1 L 水中，并加入 2 g NaHCO₃ 补充成分3，4.02 g HEPES。</li>
			<li>将RPMI分离培养基加入一个大锥形瓶中，使用磁力搅拌器混匀，用NaOH调节pH至7.4，过滤除菌后于4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RPMI 培养基</li>
		<li>使用含10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI培养基即，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰岛分离与培养
	<ol>
		<li>动物牺牲
		<ol>
			<li>通过颈椎脱位或CO₂处死小鼠2 根据当地机构的伦理程序实施窒息安乐死。用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胰腺灌注
		<ol>
			<li>沿腹部皮肤和腹膜横向做两个长切口，形成一个V形皮瓣。将皮瓣向上拉开，暴露整个腹腔，移开肠管，并用折叠的滤纸固定肝脏以保持其位置，从而显露胆总管图示&#160;1 和 2将动物放置，使其头部朝向术者，尾部远离术者。</li>
			<li>在十二指肠壁的壶腹部施加血管夹，以阻止注入的酶进入十二指肠（图&#160;1). 
			注意：此步骤至关重要，因为它决定了注入的酶是进入胰管并灌注胰腺，还是反流至注射部位（夹闭过度）或流入十二指肠（夹闭不足）。</li>
			<li>在肝总管与胆囊管汇合处附近，用31 G针头穿刺胆总管图&#160;1）并预留空间以便在胰腺首次灌注失败时进行第二次注射。将约 2 ml 冷的酶混合液缓慢（约 10 秒内）注入小鼠胆总管。 
			注意：如果夹子位置正确，胰腺将被迅速灌注。</li>
			<li>如果针头位于胆总管内但无法灌注胰腺，则调整夹子位置（即若夹持过度，则将夹子稍向上移，远离肝脏；若夹持不足，则将夹子稍向下移，靠近肝脏。 
			注意：针头有时会进入周围包膜而非导管腔内。注射时若观察到导管扩张，可作为判断针头是否位于胆总管内的有用指标。若胰腺灌注失败，可选择将酶混合液注射至胰腺多个位点，但预期产量较低。灌注胰腺左侧部分（脾叶）对于最大化胰岛产量至关重要。</li>
			<li>胰腺灌注后，迅速取出胰腺，放入一个约20 ml的玻璃瓶中，孵育约19分钟&#160;在37 °C水浴中。 
			注意：孵育时间可能因小鼠品系和年龄的不同而略有差异。</li>
			<li>孵育结束后，加入约 20 ml 冷分离培养基以终止消化过程。轻轻振荡离心管以充分分散胰腺组织，随后将悬液通过普通茶筛（孔径 1 mm）滤入无菌 50 ml 离心管中。用分离培养基补至满管体积，于 400 x g 离心 1 分钟。&#160;4 °C，关闭离心机刹车。</li>
			<li>将沉淀物再次溶于分离液中，转移至两个15 ml离心管，然后以400 x g离心1分钟&#160;4°C下关闭刹车离心。吸除上清液后，每管加入6 ml密度梯度细胞分离介质（Histopaque 1077溶液），通过涡旋或吹打充分混匀两个沉淀。然后沿管壁缓慢加入约6 ml分离介质，覆盖在密度梯度分离介质上方，100 × g离心15分钟。&#160;4 °C，关闭离心机刹车。</li>
			<li>将上层（分离培养基）、中层和下层（密度梯度细胞分离培养基）的上清液分别收集到3个独立的培养皿中。在解剖显微镜下，使用移液器从这3个培养皿中手工挑选胰岛。 
			注意：中层含有大部分胰岛。胰岛表现为直径约50至500 μm的致密结构（图&#160;3）。我们在野生型小鼠中获得约200个胰岛，而在 &#60;db/db 小鼠中的 100 个胰岛</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胰岛培养
		<ol>
			<li>为了帮助胰岛从酶消化中恢复，将每组40个胰岛置于含6 ml RPMI培养基（10 mM葡萄糖）的25 cm培养皿中，在37 °C、5% CO₂/95%空气条件下培养2/2 活细胞双光子成像前连续培养2天，每天更换培养基. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 活细胞双光子成像
<ol>
	<li>试剂准备
	<ol>
		<li>细胞外缓冲液
		<ol>
			<li>为双光子检测配制富含钠的细胞外缓冲液，其中包含 140 mM NaCl、5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM NaHCO3 和 10 mM HEPES。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞外染料
		<ol>
			<li>为双光子检测配制 8 mM 储存液 SRB 溶于细胞外缓冲液中，分装至小管中，于 -20 °C 保存。使用前将 SRB 储存液用新鲜细胞外缓冲液按 1:10 稀释，获得 0.8 mM 的工作浓度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双光子成像
	<ol>
		<li>首先，将培养 2 天的胰岛在含 3 mM 葡萄糖的细胞外缓冲液中预孵育 30 分钟。 
		注意：我们使用培养 2 至 5 天的胰岛。</li>
		<li>然后，将玻璃载片置于安装在显微镜载物台上的温控腔室中。使用真空脂防止溶液泄漏。</li>
		<li>向腔室中加入 500 μl 含 0.8 mM SRB 及不同浓度葡萄糖（3 mM、6 mM、15 mM 和 20 mM 葡萄糖）的细胞外缓冲液。</li>
		<li>接着，将预孵育后的胰岛置于腔室中央，并将焦平面聚焦于胰岛内部 3–4 层细胞深度处，在啮齿类动物胰岛中，胰岛素免疫染色显示该区域大多数细胞为 β 细胞。 
		注意：SRB 会迅速标记胰岛所有细胞膜，此时胰岛即可进行成像。</li>
		<li>使用配备 60 倍油浸物镜（NA 1.42）的双光子显微镜及成像软件（例如，ScanImage 11）。图&#160;4 展示了典型的显微成像装置。利用飞秒激光脉冲在 880 nm 激发 SRB 作为细胞膜非通透性荧光细胞外标记物，并在 550–650 nm 范围内检测荧光信号，记录胰岛对刺激的响应。</li>
		<li>通过荧光斑点的突然出现（分辨率为 10 像素/μm）识别单个胞吐事件，并通过感兴趣区域（约 0.78 μm2）荧光信号的快速上升相加以确认。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

胰岛分离过程中最关键的步骤是胰腺的初始灌注；灌注不足的胰腺会导致胰岛得率显著降低。其他因素也会影响分离质量，例如消化时间和振荡强度，这些因素可在一定程度上弥补灌注不足的问题。例如，充分灌注的胰腺在37 °C条件下仅需轻轻振荡孵育约18分30秒，而灌注不足的胰腺则可能需要约20分钟&#160;的消化时间并配合更强的振荡。我们发现，联合使用两种消化酶的效果优于单独使用其中一种。对于仅使用胶原酶的方法，消化时间对胰岛得率至关重要，仅30秒的时间差异就可能显著影响分离质量。而仅使用Liberase时，虽然得率尚可，但有时会出现消化不足的情况；我们认为添加胶原酶有助于更有效地消化结缔组织。
我们发现，db/db 小鼠即使在同窝仔鼠中也表现出多样化的糖尿病表型。因此，通常在处死每只动物前对其进行葡萄糖耐量试验。这有助于根据空腹血糖水平以及注射葡萄糖后血糖曲线下面积对动物进行分类。
胰岛分离后可进行多种可能的实验。分离的胰岛可在分离后立即用多聚甲醛或甲醇固定，并用于免疫荧光染色，以确定目的蛋白的定位10。分离的胰岛也可...

β细胞功能障碍在疾病中的作用已被广泛认识3,4。MIN6和INS-1等细胞系是研究β细胞生物学行为的有用工具。然而，胰岛素分泌的生理调控发生在胰岛（Langerhans岛）内部。这些胰岛包含数千个紧密排列的β细胞，以及血管和其他内分泌细胞类型。胰岛内的这一微环境影响胰岛素的分泌，可能在糖尿病的发生发展中起重要作用。因此，要理解胰岛素分泌的生理调控机制以及疾病的病理生理过程，研究完整的胰岛至关重要。
胰岛分离
活体人胰岛，尤其是来自2型糖尿病患者的胰岛，难以获取。此外，人胰岛在实验性分子操作方面存在诸多限制。因此，研究人员常采用动物来源的胰岛以及2型糖尿病的动物模型。其中一种疾病模型是db/db小鼠。这是一种自发性突变，其表型进展与人类2型糖尿病高度相似5,6。本文所述的从糖尿病db/db小鼠中分离胰岛的实验方案，与其他研究团队的方法有许多共同步骤，但在提高得率、纯化效果及增强胰岛存活率方面进行了若干优化。
双光子成像
本文所述的活细胞双光子检测方法可使研究人员定量分析来自糖尿病7和野生型胰岛8,9的多个细胞中含胰岛素颗粒的数量，并评估其特性。

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原酶 1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>用于制备分离培养基</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>用于制备培养培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>用于制备培养培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>用于制备培养培养基</td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>用于稀释 Liberase</td></tr><tr><td>Metamorph 程序</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>用于分析双光子图像</td></tr></tbody></table>

leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

2型糖尿病是一种慢性疾病，2013年影响了3.82亿人，预计到2035年将上升至5.92亿人1。在过去的20年中，β细胞功能障碍在2型糖尿病中的作用已得到明确证实2。研究进展依赖于胰岛分离技术的建立。本文所介绍的胰岛分离方案与其他研究团队的方案有许多共同步骤，同时进行了一些改进，以提高从野生型和糖尿病Leprdb（db/db）小鼠中分离胰岛的得率和质量。随后介绍了一种活细胞双光子成像方法，可用于研究胰岛内胰岛素分泌的调控机制。

胰岛产量与纯化
对于正常的野生型小鼠，预计可获得约200个胰岛。健康的胰岛外观明亮、呈圆形，边界光滑。消化过度的分离样本通常含有较小且轮廓模糊的胰岛，而消化不足的样本则胰岛数量较少，并伴有腺泡细胞附着的胰岛（图3）。对于糖尿病db/db小鼠，胰岛的产量和形态取决于疾病进展程度：血糖控制较好的小鼠胰岛更大、更明亮，数量也更多（可达300个胰岛），而血糖控制较差的小鼠胰岛较小，呈半透明状，数量少于100个。
双光子检测
双光子成像是一种间接检测方法，用于在单个胰岛素颗粒融合水平上测量胰岛素分泌。在葡萄糖或高钾等刺激下，胰岛素颗粒与质膜融合，胞外染料SRB进入颗粒内，从而产生直径约400 nm的突然荧光斑点（图5）。已有多种实验验证了该检测方法可准确反映含胰岛素颗粒的融合事件，例如：随着葡萄糖浓度增加，颗粒融合事件数量呈剂量依赖性上升，且与预期的胰岛素分泌量一致；双光子成像中响应细胞的大小与β细胞相符；双光子成...

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。

Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

2型糖尿病是一种慢性疾病，2013年影响了3.82亿人，预计到2035年将上升至5.92亿人¹。在过去的20年中，……

本实验的总体目标是从糖尿病 LEP R DB 小鼠中获取具有活性的活体胰岛，并利用活细胞双光子成像技术评估胰岛内β细胞的胰岛素分泌情况。首先需准备相关试剂，包括用于胰腺消化的酶混合液、胰岛培养用的培养基，以及双光子检测所用的细胞外缓冲液。随后，打开已处死小鼠的腹腔，将酶混合液注入胰腺以消化该器官。然后将胰岛从胰腺消化物中分离出来并进行培养。最后，利用双光子显微镜对胰岛内β细胞中单个胰岛素颗粒的融合进行成像。该方案最终将有助于研究人员理解在健康和疾病状态下胰岛素分泌的调控机制。眼泡分离技术的主要优化在于使用混合酶以提高眼泡的得率和活性。双光子成像技术目前是记录完整眼泡内多个细胞胰岛素分泌的唯一方法。为制备用于分离胰腺眼泡的酶液，将一管5毫克的胶原酶TL用26毫升DMEM稀释，将IV型胶原酶在Hank's缓冲液中配制成0.5毫克/毫升的浓度，并补充以下混合的胶原酶TL和胶原酶溶液。按体积比四比一将酶混合物分装，每份2.5毫升，于-20°C保存。在含有1升水的大锥形瓶中配制RPMI分离培养基，室温下溶解一管RPMI 1640粉末，加入2克碳酸氢钠和4.02克HEPES。用氢氧化钠调节pH至7.4，然后过滤、灭菌，并于4°C保存。为双光子成像制备 RPMI 培养基，需在 RPMI 分离培养基中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素。使用以下试剂配制富钠细胞外缓冲液。为制备细胞外染料，将磺酰罗丹明 B（SRB）配制成 8 毫摩尔的储存液，分装至小管中，每管含一份细胞外缓冲液，于 -20 °C 保存。为获得工作浓度，使用新鲜的细胞外缓冲液将储备液按1:10比例稀释。在按照文本方案用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体后，将小鼠牺牲，然后将其体位调整为头部朝向术者、尾部远离术者。通过腹部皮肤和腹膜做两条长的侧向切口，形成一个V形皮瓣。提起皮肤瓣以暴露整个腹腔。将肠管移至一旁，并用折叠的组织固定肝脏位置，以显露胆总管。接着，在十二指肠壁的壶腹部施加血管夹，防止注入的酶进入十二指肠。这一步骤至关重要，它决定了胰酶是否进入胰管反流、注射部位或进入十二指肠。使用31号针头穿刺胆总管，穿刺位置位于肝总管与胆囊管汇合处附近，并预留第二次注射的空间。如果首次灌注胰腺失败，则缓慢向小鼠胆总管内注射约2毫升的冷酶混合液。如果夹子位置正确，胰腺将迅速被灌注。胰腺灌注完成后，迅速取出器官，放入玻璃小瓶中，并在37摄氏度水浴中孵育约19分钟。孵育结束后，加入约20毫升冷分离培养基以终止消化过程。轻轻振荡小瓶以破坏胰腺组织，然后将其通过孔径为一毫米的普通筛网，倒入无菌的50毫升离心管中。用分离培养基加满离心管，并在400 G、4摄氏度条件下离心一分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入分离培养基并充分溶解。然后将悬液转移至两个15毫升离心管中，再次离心。吸除上清液后，向每个样本中加入6毫升密度梯度细胞分离介质，并用移液器吹打或涡旋振荡以重新悬浮。然后沿离心管管壁缓慢加入约6毫升分离介质，覆盖在密度梯度分离介质上方，于100 ×g、4°C条件下离心15分钟。分离后，将上层、中层和下层分别收集到三个不同的器皿中。然后在解剖显微镜下，使用移液器从这三个器皿中手工挑选出小孔结构。大部分小孔结构位于中层，以利于其从酶消化过程中恢复。在25厘米的培养皿中，每组40个眼状体，加入6毫升含10毫摩尔葡萄糖的RPMI培养基，培养两天。每天更换培养基，以进行双光子成像，作为检测胰岛素分泌的间接方法。首先，使用含3毫摩尔葡萄糖的细胞外缓冲液对培养两天的眼状体进行预孵育。将润滑脂涂抹于显微镜载物台上，持续30分钟，以防止溶液泄漏，并将含有玻片的温控腔室安装在显微镜载物台上。随后，加入500微升含有0.8毫摩尔SRB及不同浓度葡萄糖的细胞外缓冲液覆盖腔室。接着，将预先孵育的环状组织置于腔室中央，并聚焦于环状组织内部的三到四层细胞。在啮齿类动物的眼部切片中，通过胰岛素免疫染色显示大多数细胞为β细胞。然后使用双光子显微镜和60倍油浸物镜，通过微小荧光斑点的突然出现来识别单个胞吐酸性事件。最后，在扫描图像软件中，通过野生型小鼠感兴趣区域内荧光信号的快速上升相确认该事件。采用本视频中演示的方案，预计可获得约200个眼状结构（eyelets）。健康的眼状结构外观明亮、呈圆形，边缘光滑。而消化不足的分离样本通常含有较小、模糊的眼状结构，以及附着有非目标细胞的眼状结构。尽管在响应葡萄糖或高钾等刺激时，过度消化的批次在双光子检测中表现出较少的孔洞，但当胰岛素颗粒与质膜发生融合时，SRB会进入颗粒，从而导致出现一个直径约为400纳米的突然荧光点。在记录的时间范围内，所有响应刺激的胞吐事件均被识别出来，包括事件的位置、出现时间、持续时间以及融合类型。诸如“KISS和Run”或完全融合等事件被加以表征，这对于评估2型糖尿病模型中颗粒融合缺陷具有重要价值。该方法被用于证明糖尿病 DB DB 胰岛中的缺陷是完全颗粒融合的丧失，而非单个颗粒融合动力学的改变。此外，影响疾病状态下胰岛素分泌减少的最主要因素是响应性细胞数量的减少。观看本视频后，您应能充分理解来自左侧 RDB 小鼠的胰腺灌流与胰岛离体激活技术，并能够开展双侧舌下注射实验，以评估完整胰岛内的分泌反应发生情况。

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瘦素受体<sup&gt;分贝</sup&gt; 2型糖尿病小鼠模型：胰岛分离和活细胞双光子成像完好胰岛

在本视频中，我们介绍了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以实现对细胞动态的长期可视化观察。...

活体成像：通过稳定成像窗口在细胞水平观察小鼠胰腺的方法

本视频展示了一种基于成像的方法，用于可视化将表达荧光素酶的β细胞移植到非肥胖型糖尿病免疫缺陷小鼠体内。通过引入糖尿病小鼠的脾细胞，可导致β细胞进行性破坏，加入底物后发光信号逐渐减弱，可直观确认该过程。...

在经糖尿病型脾细胞攻击的免疫缺陷小鼠中成像转基因β细胞

一种结合眼内移植与共聚焦显微镜的新方法，可实现对移植组织内细胞的纵向、无创实时成像，分辨率达单细胞水平...

移植至眼前房以实现纵向、非侵入性 在体 实时单细胞分辨率成像

我们描述了一种利用pH敏感性绿色荧光蛋白pHluorin对完整胰岛中胰岛素胞吐作用进行可视化观察的实验方案。分离的胰岛被感染携带编码pHluorin的腺病毒，该pHluorin与囊泡 cargo...

共聚焦成像观察神经肽Y-pHluorin：一种用于完整小鼠和人类胰岛中胰岛素颗粒胞吐可视化技术

本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。...

一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。...

胰岛组织石蜡切片包埋

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。...

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。...

活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。...

观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

学习从Lepr db糖尿病小鼠模型中分离胰岛并进行活细胞双光子成像的方法，用于实时评估β细胞胰岛素分泌。该技术为研究2型糖尿病发病机制提供了重要工具。

Lepr^db 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

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