从人乳腺癌组织及细胞系微球体形成分析

漂浮乳腺球测定可以研究在悬浮条件下存活的干细胞样乳腺癌细胞亚群，并在植入小鼠体内时显示增强的肿瘤发生。 该方案提供了一种方便的体外球体形成能力测量，是体内肿瘤发生的代理，同时有助于分析与茎相关的转录景观。

以下实验的总体目标是估计癌细胞系或肿瘤组织样本中干细胞样细胞的比例，并评估它们在连续传代中的自我更新能力。为此，对癌细胞系或肿瘤组织进行处理以产生单细胞悬液，然后将其分选以分离 CD 44 阳性和 CD 24 阴性细胞亚群。将细胞接种到低附着板上，留出生长时间，然后通过光学显微镜球体检查。

通过确定相对于最初接种的细胞数形成的球体数来量化形成效率。在连续传代中重复生成单细胞悬液、留出生长时间和确定球体形成效率的过程，最终提供细胞随时间自我更新能力的测量。该方法提供了一种简单的透视测定法，用于识别表现出干细胞功能特性（例如自我更新）的细胞，以及来自体内肿瘤的干细胞数量的定量估计。

球体形成测定的一个中心原则是，每个球体都来自用于克隆的单个细胞。由于这些原因，细胞密度是该测定中最重要的参数，因为它对在无菌培养罩下工作有关键影响。从 MCF 7 或 MDA MB 2 3 1 细胞开始此过程，这些细胞的 70% 至 80% 共流度。

从培养瓶中吸出培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。然后加入 tripsin EDTA，并在分离绞车后加入含有 10% FBS 的 mammos 球形培养基孵育 2 至 6 分钟。细胞分离后，将其转移至 15 mL 锥形离心管中，并在室温下以 200 倍 G 离心 5 分钟。

离心后，倒出番泻叶。然后将细胞悬浮在 1 至 5 毫升的压力球培养基中，上下移液 10 次以打碎细胞沉淀。接下来，将细胞悬液进一步运行至 40 微米细胞训练帽过滤器中，并在连接的试管中收集流过的流出。

为了获得单细胞悬液，我将 20 微升重悬细胞的等分试样放在血细胞仪上，并使用显微镜进行检查。如果观察到如图所示的细胞簇，请使用注射器将悬浮液按摩进出 25 号针头一到两次。如图所示，一旦细胞分散到单细胞悬液中，通过荧光激活细胞来源或磁性激活细胞来源分离 CD 44 阳性 CD 24 阴性细胞亚群。

使用 LS 柱阳性选择 CD 44 阳性细胞。由于所需的细胞附着在 LS 柱壁上，因此丢弃流出物，然后从色谱柱中取出细胞。涂抹 5 mL 缓冲液，涂抹并按下色谱柱随附的柱塞以冲洗出所需的细胞。

接下来，使用 LD 柱通过负选择进一步纯化群体。这里 CD 24 阳性细胞附着在 LD 柱上。收集含有 CD 24 阴性细胞的流出。

接下来，使用流式细胞术确认所有分离细胞的表型。使用 Trian 蓝色排除方法，在适当稀释细胞悬液后计算活细胞的密度。在 2 毫升完整的乳腺球中，用 500 至 4， 000 厘米见方的 6 孔超低附着板的每个孔接种。中等。

孵育板，注意不要打扰它们 5 到 10 天，直到观察到球体。继续培养，直到球体直径至少为 40 微米，但尚未开始转动。细胞凋亡。从接受手术切除乳腺肿瘤的患者那里获取人乳腺癌组织。

将组织以 50 毫升的形式在冰上储存长达 24 小时。DMEM 无菌试管，每毫升含 100 单位、青霉素和 100 单位/毫升。链霉素在无菌组织培养罩下工作。

使用无菌剪刀、手术刀和镊子将样品转移到含有少量培养基的 100 毫米组织培养皿中。去除脂肪组织。加入 2 至 3 毫升 D-M-E-M-F 12，使用无菌手术刀或剃须刀片，将样品切碎，直到没有大块残留物。

Reeses 弯曲组织块和 10 毫升含有蛋白水解酶的预热 DMEM，并在 37 摄氏度的旋转振荡器中孵育 1 至 3 小时。当使用消化酶堆叠活的灵长类动物肿瘤细胞时，细胞死亡和从细胞基质到 ins 的充分提取之间存在关键的权衡。确保成功对于定期监测消化至关重要每半小时，将 20 微升悬浮液移液到血细胞仪上，并使用显微镜评估消化程度。

消化完成后。让碎片沉淀 5 分钟。然后将旋囊转移到 15 毫升锥形聚丙烯管中。

在室温下将 200 倍 G 离心 10 分钟。离心后，小心地倒出仰卧位试剂，并将细胞重悬于 1 至 5 毫升 mammos 球形培养基中。然后按照上一节所述制备和接种单细胞悬液。

在本视频中，通过 25 号注射器上下询问细胞最多两次，以在必要时分散细胞。培养期后，在配备数码相机的显微镜下以 40 倍放大倍数观察细胞。获取 5 个随机场的图像。

拍摄完所有图像后，使用采集软件确定直径大于 40 微米的微球数量。最后，计算变球体形成效率 通过将每个孔中的 mamos 球体数量除以每个孔中接种的细胞数量乘以 100，我打赌每个孔中含有 mamos 球体的培养基放入 15 毫升的试管中。用 PBS 洗涤每个孔，并将其添加到收集的培养基中。

然后将细胞在 115 倍 G 的室温下离心 10 分钟。旋转后，丢弃旋后 andries。将沉淀悬浮在 500 μL 预热的 tryin EDTA 中孵育 2 到 3 分钟。

孵育后，加入 500 微升 FBS 以中和试用蛋白，然后以 500 倍 G 离心 5 分钟。旋转完成后，丢弃螺旋体，然后将沉淀物在 100 微升 mammos 球体中旋转，上下移液以解聚任何球体。同样，使用血细胞仪对细胞进行计数并确定它们是否已经分散成单个细胞悬液。

如果没有，请将它们通过 25 号注射器最多两次以获得单个细胞，将细胞接种到新的超低温度下。附件六，5 到 10 天后，以与初级生成相同的密度进行孔板计数，并计算计算恐惧形成效率，与以前一样估计球体形成效率。如本视频所述，大气是从上皮雌激素阳性 CF 7 和间充质三阴性 MDA 2 3 1 细胞系中培养的，大于 40 微米的乳腺球体计数提供了每种细胞系的球体形成效率的估计值。

请注意，此处看到的最小细胞融合聚集是通过低密度电镀实现的，MCF 7 为每平方厘米 500 个细胞，MDA 2 3 1 为每平方厘米 1000 个细胞。观看此视频后，您应该对来自不同细胞系或手术肿瘤样本的乳腺球体的生长和计数有很好的了解。在尝试此程序时，重要的是要记住以低密度接种细胞，以确保克隆性，并确保在从手术样本中提取细胞时，高比例的细胞是活的。

除了该程序外，还应执行其他方法，例如将异种移植细胞群移植到免疫功能低下的小鼠中，以确定感兴趣组织的体内肿瘤生成性。