人淋巴管内皮细胞中的多参数荧光激活细胞分选分离
May 1st, 2015
这个协议的目标是隔离淋巴管内皮细胞衬里使用荧光激活细胞分选（FACS）人淋巴管畸形囊肿状容器和包皮。随后的细胞培养和扩大这些细胞的实验允许为复杂遗传，蛋白组学，功能和细胞分化研究的一个新的水平。
该程序的总体目标是使用荧光激活细胞分选分离排列在人类淋巴畸形和包皮淋巴管上的高纯度淋巴内皮细胞。首先通过酶消化患者组织样本来实现。在第二步中，培养单细胞悬液以富集淋巴内皮细胞的数量。
在示例中。然后用针对目标细胞表面标志物的抗体标记细胞，并使用多参数荧光激活细胞分选进行分选。最终，包皮和淋巴管畸形、淋巴内皮细胞可以在细胞培养物中扩增，用于进一步的下游分析。
与现有方法相比，该技术的主要优点是荧光激活细胞分选产生的细胞纯度大于 99%，避免了由于污染细胞过度生长而导致淋巴内皮细胞丢失的相关问题。首先称取含有 10 毫升培养基的 50 毫升试管，并补充抗生素抗真菌溶液。然后将淋巴畸形或四个皮肤样本转移到试管中，并再次称量试管以确定组织的重量。
接下来，在二级生物安全柜中，使用无菌镊子将组织和培养基转移到使用无菌剪刀的 100 毫米组织培养皿中。最后，将组织切成一立方毫米的小块。然后将碎片转移到装有 10 毫升新鲜抗生素抗真菌剂的 50 毫升试管中。中等。
旋转试管几次以重悬组织，然后旋转样品。去除上清液后，每 100 毫克碎组织加入 1 毫升预热消化液，并将组织在 37 摄氏度的培养箱中以 200 RPM 的速度不断摇动，以成功富集淋巴内皮细胞。识别细胞何时充分暴露于胶原酶和间隙障碍反应至关重要，这样它们才能在分离中存活下来。
这是通过仔细监测组织消化过程并在大部分组织被消化成细小片段时停止反应来实现的。在孵育结束时，确认几乎所有组织都已消化成小碎片，并通过 70 微米过滤器将组织浆液过滤到无菌 50 毫升试管中。现在使用带有橡胶柱塞的 3 毫升注射器活塞研磨剩余的组织，直到仅观察到少量细胞外基质。
然后用与解离酶培养基体积相等的内皮细胞培养基洗涤细胞过滤器，并向下旋转细胞复溶蛋白。将沉淀悬浮在最多 20 mL 的内皮细胞培养基中，具体取决于样本大小。然后，在计数种子后，将 6 个细胞放入 150 平方厘米的培养瓶中，用纤连蛋白预编码，在终体积为 20 毫升的内皮细胞培养基中进行过夜培养。
第二天早上，用补充有抗生素抗真菌溶液的 PBS 冲洗三次洗去未结合的细胞。然后，为了增加淋巴内皮细胞的数量，向细胞中加入新鲜的内皮细胞培养基，并将培养物孵育 5 至 7 天，直到培养物达到约 80% 汇合。通过多参数荧光激活细胞分选对细胞进行染色以进行分选。
首先，去除细胞培养基，在 PBS 中洗涤细胞 3 次。然后在 37 摄氏度下孵育 5 至 7 分钟后加入 7 毫升分离溶液。收获解离的细胞，用 3 体积的内皮细胞培养基灭活酶，并将细胞悬液转移到无菌管中。
将细胞离心 3 次，在 5 毫升 PBS 中洗涤沉淀，用于最后一次洗涤后的第二次和第三次旋转。将沉淀重悬于 5 毫升新鲜 PBS 中，并通过 trian blue 排除法计数活细胞的数量。细胞计数后。
将细胞无菌转移至流式细胞术染色管中，并向下离心细胞以阻断非特异性结合。将细胞重悬于 5% F-B-S-P-B-S 中，并在冰上孵育 20 分钟。封闭离心机后，细胞去除上清液和复苏。
将沉淀悬浮在 CD 34、CD 31 potanin 和 VEGF 受体三种抗体混合物中。在冰上放置 20 分钟后，在 2 毫升 F-B-S-P-B-S 中洗涤细胞 3 次，以去除任何未结合的抗体并复苏。将沉淀悬浮在 300 微升碘化丙啶中，溶于冰上的 F-B-S-P-B-S 溶液中。
最后，在多参数荧光激活细胞分选仪上对纯化的人淋巴内皮细胞进行分选。然后离心分选的细胞，并将沉淀悬浮在合适的培养基中，用于细胞培养接种。在这里，显示了用抗 pot deplane 抗体标记的正常人淋巴管和淋巴管畸形血管，注意人淋巴畸形血管内的显着扩张和相当大的管腔大小变化。
事实上，大多数淋巴畸形在初始组织消化和在普通样品中培养 24 小时后，包含小或微囊性以及大或大囊性异常囊性结构。除了成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞外，在分选后还可以在细胞培养中再观察 24 小时，观察到不同的内皮细胞集落。然而，CD 34、低 CD 31 阳性 VEGF 受体、三个阳性 podo 平面和阳性细胞附着在培养容器上，并表现出在这些图像中观察到的典型鹅卵石形态。
看完这个视频，你应该对如何使用荧光激活细胞分选来高纯度地分离排列人类淋巴畸形和全身皮肤淋巴管的淋巴内皮细胞有一个很好的了解。不要忘记，处理原代人体组织可能是危险的，因为它可能含有对人体健康有害的传染源。执行此程序时应始终采取标准预防措施，例如佩戴手套、防护眼镜和实验室防护服。
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概述
本协议旨在使用荧光激活细胞分选（FACS）从人类淋巴系统畸形和包皮中分离出高纯度的淋巴内皮细胞。该过程包括组织样本的酶解和随后的细胞培养，以富集淋巴内皮细胞以供进一步分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 血管生物学
背景
- 淋巴内皮细胞对于理解淋巴系统畸形至关重要。
- 荧光激活细胞分选（FACS）允许分离特定类型的细胞。
- 细胞培养技术使得分离的细胞可以扩展用于研究。
- 理解这些细胞可以带来对各种疾病的洞察。
研究目的
- 从人类组织中分离淋巴内皮细胞。
- 增强研究遗传和蛋白质组学特征的实验方法。
- 促进功能研究和细胞分化研究。
使用的方法
- 对组织样本进行酶解以创建单细胞悬液。
- 培养单细胞悬液以富集淋巴内皮细胞。
- 用针对特定表面标记的抗体标记细胞。
- 使用多参数荧光激活细胞分选对细胞进行分选。
主要结果
- 成功分离出高纯度的淋巴内皮细胞。
- 通过培养技术富集淋巴内皮细胞。
- 为下游分析准备细胞。
- 进一步研究淋巴系统畸形的潜力。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来分离淋巴内皮细胞。
- 分离的细胞可用于各种实验研究。
- 该方法增强了对淋巴系统疾病的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells enables mechanistic de-risking of lymphatic malformation targets and supports predictive confidence in early discovery. This method provides a disease-relevant system for target validation and assay development in vascular biology. The high-purity output facilitates translational biomarker screening and preclinical model generation for rare lymphatic disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lymphatic endothelial phenotype in diseased and healthy human tissue.
- Operational Value: Provides a purified cellular substrate for target engagement and pathway analysis.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation in rare vascular disorders with limited biological insight.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized lymphatic endothelial cells for reproducible assay formats.
- Operational Value: Yields >99% pure cells, reducing variability in downstream compound screening.
- Strategic Value: Enables scalable production of disease-relevant cells for high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of lymphatic malformation pathophysiology.
- Operational Value: Provides expanded cells for functional validation and biomarker discovery.
- Strategic Value: Facilitates preclinical de-risking of lymphatic-targeted therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The isolated lymphatic endothelial cells serve as a discovery biology tool that enables target validation and pathway clarification in vascular therapeutics.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by providing pure human lymphatic endothelial cells for target interrogation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-purity cell production for compound evaluation.
- Analytics: Facilitates quantitative readouts via flow cytometry and functional assays on sorted populations.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through expanded cells for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for lymphatic endothelial cell sourcing across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through disease-relevant human cellular models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via FACS-based isolation with >99% purity.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk through early mechanistic de-risking of lymphatic targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of lymphatic malformation therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation and multi-parameter flow cytometry.
- Dependent on access to FACS instrumentation and antibody panels for CD34, CD31, VEGFR-3, and PODOPLANIN.
- Necessitates sterile tissue handling and biosafety cabinet protocols for primary human samples.
- Requires optimization of digestion times to balance cell yield and viability across tissue types.
- Dependent on fibronectin-coated culture surfaces for lymphatic endothelial cell adhesion and expansion.
