Name: 人淋巴管内皮细胞中的多参数荧光激活细胞分选分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学习使用多参数荧光激活细胞分选技术从人淋巴管畸形和包皮组织中分离高纯度淋巴管内皮细胞。该方法通过酶解消化和细胞培养富集，为下游基因和蛋白质组学研究提供可靠材料。

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作者感谢贝克基金会和皇家儿童基金会“女性科学研究员奖学金”对Zerina Lokmic的支持。Andrew G. Elefanty和Edouard G. Stanley为澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）高级研究员。他们实验室的工作得到了NHMRC和澳大利亚干细胞项目的资助。

伦理声明：收集淋巴管畸形和包皮组织的伦理批准已由澳大利亚墨尔本皇家儿童医院的人类研究伦理委员会批准。在手术前，已从患者家长处获得书面知情同意。组织样本采集自临床诊断为淋巴管畸形并接受手术治疗的患者，以及接受择期包皮环切术的患者。所有实验均严格遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的指导原则进行。
1. 从包皮和淋巴管畸形组织制备细胞悬液
<ol>
	<li>缓冲液与培养基的制备。
	<ol>
		<li>使用市售的EGM-2 MV Bullet Kit制备完全内皮细胞培养基：将EGM-2培养基置于37 °C水浴中预热，并将试剂盒各组分轻轻解冻。在II级生物安全柜中，以无菌操作将各组分依次加入EGM-2培养基中。所有组分添加完毕后，将该培养基称为“完全内皮细胞培养基”。使用无菌50 ml移液管在使用前充分混匀。 
		注意：所有涉及细胞培养的操作均在II级生物安全柜中进行。所有溶液按照生产商说明储存于4 °C，并在使用前恢复至室温。完全内皮细胞培养基、细胞培养缓冲液及酶溶液在使用前需于37 °C预热20分钟。</li>
		<li>在完全内皮细胞培养基中添加VEGF-C至终浓度50 ng/ml。将添加后的内皮细胞培养基分装至无菌50 ml离心管中，4 °C储存备用。该培养基在4 °C储存条件下至少可稳定保存4周。</li>
		<li>通过将8.752 g NaCl、1.416 g Na2HPO4·2H2O和0.395 g KH2PO4溶解于1,000 ml水中，制备无钙无镁的磷酸盐缓冲液（PBS）。调节pH至7.4。使用0.22 μm滤器过滤除菌，4 °C保存。使用前加入抗生素/抗真菌溶液（使用浓度为1:100）。</li>
		<li>制备人纤维连接蛋白：将1 mg纤维连接蛋白溶解于10 ml无菌水中。将重悬后的溶液以100 μl分装，-20 °C保存。使用当天，取100 μl纤维连接蛋白分装液加入10 ml无菌PBS中（终工作浓度为10 μg/ml）。</li>
		<li>制备酶解培养基：在无菌PBS中配制含0.04% Dispase II、0.25% Collagenase II和0.01% DNase I的混合酶溶液。首先称取Dispase和Collagenase，置于无菌50 ml离心管中，加入所需体积的PBS，于37 °C振荡孵育30分钟使其充分溶解。溶解后，在生物安全柜中使用0.22 μm滤器过滤除菌。无菌条件下加入DNase I。酶解液于37 °C保存，现配现用。 
		注意：DNase I为市售细胞培养级试剂，以无菌冻干粉形式提供。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 包皮和淋巴管畸形组织单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>称量一个含有10 ml DMEM/2% 抗生素-抗真菌溶液的50 ml离心管。该离心管将用于组织收集。</li>
	<li>在手术切除淋巴管畸形和包皮组织后，无菌地将组织样本加入该离心管中，并置于冰上立即转移至细胞培养实验室。</li>
	<li>称量含有组织的离心管并计算组织重量。利用该重量计算消化组织所需的酶溶液体积。</li>
	<li>在II级生物安全柜中，使用无菌镊子将组织和培养基转移至一个100 mm的组织培养皿中。使用无菌剪刀将组织精细剪切成约1 mm3大小的碎块。</li>
	<li>将混有培养基的剪碎组织转移至一个含有额外10 ml无菌DMEM/2% 抗生素-抗真菌溶液的50 ml离心管中。通过轻柔颠倒混匀以重悬组织。以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液。根据组织重量，每100 mg剪碎组织加入1 ml预热（37 °C）的胶原酶II/DNase I/Dispase II消化液。通常情况下，每约1 g剪碎组织使用10 ml酶溶液。</li>
	<li>将组织置于37 °C培养箱中孵育20–90分钟，同时以200 rpm持续振荡。孵育结束后，确保几乎所有组织已被消化成细小碎片。 
	注意：在从原代组织中分离细胞时，细胞暴露于胶原酶和dispase的时间会影响细胞存活率。我们通过实验发现，大多数新生儿包皮样本最佳消化时间为20–30分钟，而纤维化程度较高的淋巴管畸形样本可能需要60–90分钟的消化时间。LM LEC的得率受组织中纤维化程度的影响，纤维化程度越高，获得的细胞越少，这可能是由于长时间暴露于胶原酶II和dispase II对细胞产生不利影响所致。</li>
	<li>消化完成后，将离心管转移至生物安全柜中，将消化后的组织悬液通过置于无菌50 ml离心管上的70 μm细胞筛过滤。使用带有橡胶活塞的3 ml注射器芯杆研磨残留组织，直至仅剩少量细胞外基质可见。</li>
	<li>用与解离酶液体积相等的内皮细胞培养基洗涤细胞筛，以回收粘附在筛网上的细胞并灭活酶活性。例如，若使用2 ml解离酶液消化剪碎的组织，则加入2 ml内皮细胞培养基以灭活酶。</li>
	<li>以300 × g离心细胞悬液5分钟，吸除上清液。&#160;将细胞重悬于10 ml PBS中。再次以300 × g离心5分钟，弃去上清液，重复洗涤细胞两次。&#160;将细胞沉淀重悬于20 ml内皮细胞培养基中。使用台盼蓝染色计数细胞，然后将2 × 106个细胞接种至已预先包被纤维连接蛋白的150 cm2培养瓶中，最终体积为20 ml内皮细胞培养基。在37 °C、5% CO2、湿化空气的培养箱中培养。 
	注意：根据台盼蓝染色排除法估计，约有75%–90%的有核细胞可在组织消化过程中存活。初始细胞计数反映的是细胞悬液中所有有核细胞（即角质形成细胞、白细胞、巨噬细胞、结缔组织细胞和血管细胞）。5–7天后的细胞计数则反映在培养过程中已贴壁、存活并增殖的细胞。使用纤维连接蛋白包被组织培养瓶可进一步提高LEC和LM LEC的后续存活率。</li>
	<li>过夜培养后，用PBS/1% 抗生素-抗真菌溶液洗涤三次以去除未贴壁细胞，并加入新鲜的内皮细胞培养基。进行三次洗涤以有效清除培养瓶中的未贴壁细胞和红细胞。每隔两天更换一次培养基。5–7天后细胞融合度将达到约80%。</li>
</ol>
3. 用于流式细胞术的淋巴管内皮细胞表面标志物抗体染色
<ol>
	<li>细胞达到 80% 汇合度后，吸除培养基，并用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>每 150 cm2 培养瓶加入 7 ml 细胞解离液（如 Accutase），在 37 °C 下孵育 5–7 分钟，使贴壁细胞脱落。</li>
	<li>收集解离的细胞，加入 3 倍体积的内皮细胞培养基以中和细胞解离液的活性，并将细胞悬液转移至新的无菌离心管中。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于 5 ml PBS 中。以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，重复洗涤一次。再次将细胞重悬于 5 ml PBS 中。</li>
	<li>计数活细胞数量。取 10 μl 细胞悬液与 90 μl 0.4% 台盼蓝混合。取 10 μl 该混合液加入血细胞计数板进行计数。 
	注意：最终细胞产量取决于处理的样本大小。通常每 150 cm2 培养瓶可获得 7 × 105 至 1.2 × 106 个活细胞。</li>
	<li>配制用于细胞染色的抗体溶液。 
	注意：以下稀释比例适用于在 100 μl 染色体积中对 1 × 106 个细胞进行染色。
	<ol>
		<li>每份组织样本使用 100 μl 无菌 5% FBS/PBS 溶液，分别稀释 PE 标记的小鼠抗人 VEGFR-3 抗体（1:50）、PE-Cy7 标记的小鼠抗人 CD34 抗体（1:200）、APC 标记的小鼠抗人 CD31 抗体（1:100）以及 Alexa 488 标记的大鼠抗人 PODOPLANIN 抗体（1:200）。抗体溶液配制完成后置于冰上待用。同时配制相应的同型对照抗体混合液，以便设置流式细胞术门控。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为减少抗体的非特异性结合，以 300 × g 离心 2 分钟，弃上清，每份待染色样本加入 100 μl 无菌 5% FBS/PBS 溶液重悬细胞，在 4 °C 冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，将细胞重悬于标记好的抗体混合液中。同时取少量细胞（1 × 105）加入 100 μl 同型对照抗体混合液中进行染色。冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>为去除未结合的抗体，加入 2 ml 2% FBS/PBS 溶液，以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清，重复洗涤一次。</li>
	<li>将用于同型对照及抗体染色后分选的细胞沉淀分别重悬于 300 μl 含 0.5 mg/ml 碘化丙啶的 2% FBS/PBS 溶液中，置于冰上待分选。</li>
</ol>
4. 细胞分选
<ol>
	<li>使用以下材料设置仪器：校准微球（如市售的荧光颗粒）、基于磷酸盐缓冲液的鞘液，以及液滴延迟微球（如 Accudrop 荧光微球）。</li>
	<li>在多参数荧光激活细胞分选仪器上分离纯化的人淋巴管内皮细胞（LEC）。按照制造商的建议设置并校准仪器。此外，每次分选时均需运行单染补偿对照，以生成补偿矩阵，从而消除荧光染料（如 PE）的发射光谱大量溢出至 PE-Cy 通道的现象。 
	注意：若使用 100 μm 喷嘴，并将细胞分选至内皮细胞培养基中，则经 FACS 分选的细胞在分离过程中存活比例更高。</li>
</ol>
5. FACS 分选后细胞培养
<ol>
	<li>分选后，将细胞在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于 5–10 ml 培养基中（具体体积取决于接种细胞所用培养瓶的大小）。若分选细胞数少于 50,000 个，则将细胞培养于纤维连接蛋白包被的 25 cm2 培养瓶中。</li>
	<li>否则，将细胞接种于 75 cm2 纤维连接蛋白包被的培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 及空气饱和湿度的培养箱中进行培养。2 天后更换培养基。 
	注意：每两天更换一次培养基，因为延长换液间隔似乎更有利于非内皮细胞的存活。当细胞首次传代以进行进一步扩增时，我们通过免疫组织化学方法检测标志物 PROX-1、VEGFR-3、Podoplanin、CD34 和 CD31 来验证淋巴管内皮细胞表型15。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

淋巴管内皮细胞（LECs）在维持体液稳态、对外来抗原的免疫应答以及某些营养物质的吸收和运输方面发挥着重要作用。LEC 的稳态可受到细菌感染和肿瘤转移等疾病过程的影响，但 LEC 本身也可能发生体细胞突变，导致功能异常的淋巴管形成，并给患者带来显著的疾病负担。为通过深入研究淋巴管畸形的病因学以获得更全面的认识 体内 植入和 离体 实验，并发现新的治疗方案，我们首先开发了一种基于磁珠分选策略、利用CD34的LEC分离方法阴性CD31位置 筛选策略15然而，所获得的培养物中常含有难以去除的非内皮细胞。随后，该方法通过使用流式细胞荧光分选（FACS）对表达CD34的淋巴管内皮细胞（LEC）进行分选而得到优化。低CD31位置VEGFR3位置PODOPLANIN阳性 表型。该方法获得了相对均一的LEC培养物，其中包含 &#60;0.5% 非 CD34低CD31位置VEGFR3位置PODOPLANI...

淋巴管系统的主要功能是吸收淋巴液，即含有脂质、蛋白质和细胞成分的过量组织间液，并将其输送至血液静脉系统。淋巴毛细管网络将淋巴液引流至淋巴结，在此处对其中是否存在外来抗原进行筛查，这是免疫监视以及部署白细胞以中和外来抗原的重要过程。
单向的淋巴系统始于组织中的初始淋巴毛细血管，这是一种独特的结构，由一层不连续的薄壁扁平内皮细胞构成，其具有特化的细胞连接，允许淋巴液进入1,2。这些毛细血管通过锚定纤维与邻近的结缔组织基质相连，以防止在间质压力升高时血管塌陷3。初始淋巴毛细血管汇入集合淋巴毛细血管，后者进一步汇合成更大的淋巴管或静脉。与初始淋巴毛细血管相比，集合淋巴管具有更厚的管壁、成对的淋巴瓣膜，并被一层不连续的基底膜包裹，其中嵌有少量平滑肌细胞4。淋巴瓣膜的协调开闭以及平滑肌细胞的收缩有助于淋巴液的流动3。在人体中，来自身体不同区域的淋巴管汇合形成淋巴干，再进一步合并为两条主要的淋巴导管：胸导管和右淋巴导管。胸导管引流身体左侧以及胸部以下右侧区域的淋巴液，而右淋巴导管则引流右上肢以及头、颈和胸部右侧的淋巴液。两条导管均将淋巴液导入颈部的锁骨下静脉5。
淋巴系统疾病 broadly 分为获得性和先天性两类（表1）。获得性疾病的例子包括淋巴管炎和继发性淋巴水肿。淋巴管炎是由细菌感染引起的淋巴管炎症。受累淋巴管扩张，并充满含有多形核细胞的渗出液。在皮肤上，这些淋巴管表现为红色、疼痛的皮下条索，常伴有相应引流区域淋巴结的肿大（淋巴结炎）6。继发性淋巴水肿是由于淋巴管或淋巴结受损或阻塞所致，导致损伤或阻塞部位远端淋巴液积聚，引起慢性进行性肿胀。在发达国家，继发性淋巴水肿最常见于恶性肿瘤，转移性肿瘤可阻塞淋巴管或区域淋巴结，或继发于抗癌治疗，如淋巴结手术切除、放疗后纤维化以及炎症后血栓形成和瘢痕形成7。在世界其他地区，继发性淋巴水肿可能继发于寄生虫（如Wuchereria bancrofti）引起的淋巴管阻塞6。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">淋巴管系统疾病</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>获得性</td>
			<td colspan="3">先天性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">淋巴结炎 
			继发性淋巴水肿</td>
			<td>原发性淋巴水肿10</td>
			<td>散发性淋巴管畸形13</td>
			<td>综合征相关性淋巴管畸形13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">例如 
			Milroy 综合征 
			Meige 综合征</td>
			<td>单纯性： 
			淋巴管畸形</td>
			<td rowspan="2">例如 
			Klippel-Tranaunay 综合征 
			Parks Weber 综合征 
			Sturge-Weber 综合征</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>复合性： 
			毛细血管-淋巴管畸形 
			毛细血管-淋巴管-静脉畸形 
			毛细血管-淋巴管-动静脉畸形 
			毛细血管-淋巴管-静脉-动静脉畸形</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 淋巴血管系统疾病的概述。
淋巴系统先天性发育异常包括原发性（特发性）淋巴水肿，其被认为由基因突变引起，以及淋巴管扩张症和淋巴系统结构异常8,9。原发性淋巴水肿可为散发性，推测由新生突变（de novo mutations）导致，也可为遗传性。淋巴系统疾病既可以是孤立发生的，也可作为更广泛综合征的一部分出现10。在儿童人群中，97%的淋巴水肿为散发性，其特征为淋巴管结构异常，导致局部淋巴引流障碍11。米尔罗伊病（Milroy disease）是一种典型的原发性淋巴水肿，由出生时或出生后不久即可发现的 VEGFR-3 基因突变所致12。尽管该病多为家族性，但在无米尔罗伊病家族史的婴儿中也可发现该病32。任何类型淋巴水肿的严重程度均取决于淋巴液生成量以及将淋巴液回输至静脉循环的能力6。
根据临床表现和原位内皮细胞增殖情况，淋巴系统异常被分为淋巴系统肿瘤或淋巴系统畸形13。卡波西样淋巴管瘤病即为一种淋巴内皮细胞肿瘤的实例14。淋巴系统畸形被认为起源于胚胎发育阶段，并随儿童生长而成比例增大15,16。此类畸形极少自行消退，但可长期无症状，直至外伤或感染诱发其迅速生长，进而导致临床并发症。在淋巴系统畸形中，上述淋巴网络的有序结构以及淋巴液从组织向静脉循环的传导过程受到破坏，病变表现为局部聚集的异常囊性结构，其内充满淋巴液。尽管尚无临床或实验证据表明这些囊性血管与淋巴循环系统相连，或含有功能性淋巴瓣膜，但其淋巴系统特性可通过表达一系列淋巴细胞标志物得以确认，例如PODOPLANIN、CD31、淋巴管内皮受体1（LYVE-1）、Prox1同源框蛋白1（PROX-1）和VEGFR-315,17,18。这些囊性结构可为小型（微囊型）或大型（巨囊型），但大多数淋巴系统畸形同时包含微囊型和巨囊型成分（图1）16。在手术切除、注射硬化治疗和/或射频消融后，淋巴系统畸形常会复发。
<img alt="经染色细胞的肝脏组织病理学图像，箭头指示结构，显微镜分析。" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 人淋巴管及淋巴管畸形的形态学特征。 使用PODOPLANIN抗体（棕色标记，箭头）标记的正常人淋巴管（A）和淋巴管畸形血管（B 和 C）。人淋巴管畸形血管的特征是明显扩张，并且管腔大小存在显著差异。这些局部异常的囊性结构可为较小者（微囊型，*）（B），或较大者（大囊型，#）（C）。大多数淋巴管畸形同时包含微囊型和大囊型成分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
一些研究者认为，淋巴管畸形代表了淋巴管系统发育异常，其中淋巴管内皮细胞（LEC）本身并不具备异常增殖潜能，而是未能与正常循环系统建立连接19。然而，我们发现，与包皮来源的淋巴管内皮细胞相比，淋巴管畸形来源的淋巴管内皮细胞（LM LECs）增殖更快，且对凋亡更具抗性15，这提示LM LECs本身存在原发性缺陷。当将LM LECs植入小鼠异种移植模型时，它们可形成类似淋巴管畸形的结构15。这一发现支持了如下假说：淋巴管畸形可能是由于胎儿发育过程中LM LECs发生了一种或多种体细胞突变所致。事实上，近期已有研究报告鉴定出磷酸肌醇-3-激酶（Phosphoinositide-3-Kinase）的p110α催化亚基编码基因（PIK3CA）中存在此类突变之一20。
随着DNA测序技术的进步，可在分离的LM淋巴管内皮细胞（LEC）中更便捷地鉴定出相关突变，从而为这些疾病的研究提供方向。分离出具有活性的LEC将有助于在迁移、增殖、成管能力以及在营养缺乏或促凋亡因子作用下的存活能力等实验中，对异常与正常LEC进行比较。分离的LEC还可使我们开展细胞特异性的基因表达和蛋白质组学研究，明确新的LEC亚群，并发现适用于淋巴管畸形临床治疗的新型药理学药物15。
我们此前发表了一种基于磁珠分离技术从新生儿包皮及淋巴管畸形组织中分离淋巴管内皮细胞（LEC）的方法15。我们曾报道一种策略，即利用淋巴管内皮细胞不表达CD34的特性，将其与血管内皮细胞分离，随后对CD34Neg细胞组分进行CD31阳性筛选。然而，该方法受限于存在残留的非内皮细胞。这一问题与在后续结缔组织消化前是否去除表皮无关。这些污染细胞通常增殖速度更快，因此即使重复进行LEC分离，最终仍会过度生长并取代内皮细胞培养物。事实上，初始污染的非内皮细胞比例低至2%至5%就足以完全压制LEC群体15。这促使我们探索采用荧光激活细胞分选技术，以提高LEC的得率和纯度。此外，我们采用了多参数分选策略以增强LEC群体的特异性，将VEGFR-3和PODOPLANIN作为附加筛选标志物，用于鉴定CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos的LEC。
选择这些标志物的依据是已有报道表明，尽管淋巴管内皮细胞（LEC）和血液血管内皮细胞具有许多共同的细胞表面标志物（如CD31），但与血液血管内皮细胞相比，LEC在CD34、PODOPLANIN和VEGFR-3细胞表面标志物的表达上表现出表型差异21-23。CD31是一种130 kDa的跨膜糖蛋白，也称为血小板内皮细胞黏附分子1（PECAM-1）。由于其在所有类型的血液和淋巴管内皮细胞上均有表达，因此被认为是泛内皮细胞标志物21,24,25。CD34是一种110 kDa的跨膜糖蛋白，存在于大多数造血祖细胞和干细胞、血管内皮细胞以及部分淋巴管中26。
VEGFR-3 是血管内皮生长因子 C 和 D 的受体，最初存在于小鼠胚胎发育中的静脉中，但在由 SRY 相关 HMG-box（SOX）-18、chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor 2（COUPTF-II）和 PROX-1 等转录因子调控的淋巴管特化过程之后，VEGFR-3 在静脉中的表达消失，并转而局限于胚胎淋巴管内皮细胞（LECs）25,27。PODOPLANIN 是一种 38 kDa 的膜结合黏蛋白，在小鼠胚胎发育约第 11 天（~E11.0）首次在淋巴管中被检测到28；尽管微血管淋巴管强烈表达 PODOPLANIN，但在淋巴管畸形中的大囊性淋巴管内皮中，其表达则更具变异性15。流式细胞术实验表明，至少部分 CD34HighCD31Pos 内皮细胞表达淋巴管标志物 PODOPLANIN29。尽管对人类淋巴管畸形中 LYVE-1 和 PODOPLANIN 染色的系统性评估显示，两者均能有效标记淋巴管畸形的内皮细胞30，但在正常组织中，LYVE-1 被报道在初始淋巴毛细血管内皮中强烈表达，而在集合淋巴管内皮中表达减弱甚至缺失31。由于我们的目标是分离初始和集合淋巴管内皮细胞，因此我们选择不将 LYVE-1 用于细胞筛选策略中。最后，选择这些标志物还基于可用于诊断性标记淋巴管以进行显微成像的抗体的可获得性，这一特性有助于流式细胞术与免疫荧光研究结果之间的相互验证。
本文将介绍从包皮和淋巴管畸形组织中成功分离CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos淋巴管内皮细胞以及CD34HighCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos内皮细胞所需的组织消化方法、细胞染色及FACS设置。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>11965-092</td><td>用于从手术室收集组织样本。</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet试剂盒</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>EGM-2 MV Bullet试剂盒包含500 ml EBM-2培养基以及人表皮生长因子（EGF）、氢化可的松、庆大霉素（GA-1000）、胎牛血清（FBS）、VEGF、人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-b）、R&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;-IGF-1和抗坏血酸。</td></tr><tr><td>VEGF-C</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2179-VC-025</td><td>完全内皮细胞培养基中添加50 ng/ml VEGF-C。</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩液）</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15240-062</td><td>该溶液含有10,000&amp;nbsp;U/ml青霉素、10,000&amp;nbsp;mg/ml链霉素和25&amp;nbsp;mg/ml两性霉素B（Fungizone）。使用时按1:100稀释。</td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>使用浓度为10 mg/ml。若在4&amp;nbsp;&amp;#176;C下保存并维持无菌状态，可重复使用长达1个月。每150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;培养瓶使用7&amp;nbsp;ml进行包被。</td></tr><tr><td>StemPro Accutase细胞解离试剂</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>A11105-01</td><td>StemPro&amp;reg;Accutase&amp;reg;使用量为每cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 0.05 ml，以覆盖培养瓶整个表面。使用体积过少可能导致细胞脱离不完全。</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染料</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15250-061</td><td>用作细胞活力染色剂。</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>4942078001</td><td>使用浓度为0.04%。</td></tr><tr><td>胶原酶II</td><td>Worthington Lab</td><td>4176</td><td>使用浓度为0.25%。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>11284932001</td><td>使用浓度为0.01%。</td></tr><tr><td>70 mm 尼龙细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PE标记的VEGFR-3克隆9D9F9，克隆WM59</td><td>BioLegend</td><td>356204</td><td>使用稀释比例为1:50</td></tr><tr><td>PE-Cy7标记的CD34，克隆581</td><td>BioLegend</td><td>343516</td><td>使用稀释比例为1:200</td></tr><tr><td>APC标记的小鼠抗人CD31，克隆WM59</td><td>BioLegend</td><td>303116,</td><td>使用稀释比例为1:100</td></tr><tr><td>Alexa 488标记的大鼠抗人Podoplanin，克隆NC-80</td><td>BioLegend</td><td>337006</td><td>使用稀释比例为1:200</td></tr><tr><td>PE标记的小鼠IgG1, k同型对照，克隆MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>使用稀释比例为1:50</td></tr><tr><td>PE-Cy7标记的小鼠IgG1, k同型对照，克隆MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400126</td><td>使用稀释比例为1:200</td></tr><tr><td>APC标记的小鼠IgG1, k同型对照，克隆MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400120</td><td>使用稀释比例为1:100</td></tr><tr><td>Alexa 488标记的小鼠IgG2a, k同型对照，克隆RATK2758</td><td>BioLegend</td><td>400525</td><td>使用稀释比例为1:200</td></tr></tbody></table>

通过多参数荧光激活细胞分选法分离人类淋巴管内皮细胞

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

原发性淋巴水肿、淋巴管畸形和淋巴管肿瘤等淋巴系统疾病是一类罕见病，可导致严重的发病率，但目前对其生物学特性了解甚少。从病变组织和正常组织中分离出高纯度的人淋巴管内皮细胞（LECs），将有助于在基因、分子和细胞水平上对淋巴内皮进行研究。预计这些研究可能发现新的治疗靶点，从而改变这些疾病的临床管理策略。本文介绍了一种分离人包皮来源的淋巴管内皮细胞及淋巴管畸形来源的淋巴管内皮细胞（LM LECs）的实验方案。为获得单细胞悬液，将组织剪碎后使用中性蛋白酶II和胶原酶II进行酶解处理。所得单细胞悬液随后用针对分化簇（CD）标记物CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）以及PODOPLANIN的抗体进行标记。通过荧光激活细胞分选仪（FACS）对染色后的活细胞进行分选，以分离出CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos 表型的LM LEC群体，排除其他内皮细胞和非内皮细胞。分选获得的LM LECs可在纤维连接蛋白包被的培养瓶中进行培养扩增，用于后续实验研究。

在初始组织消化后，未分选样本经24小时培养，可观察到明显的内皮细胞克隆（图2A），同时存在成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞。经分选后，CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPodoplaninPos细胞在培养24小时后贴壁，并呈现典型的鹅卵石样形态（图2B和图2C）。采用上述FACS方法，我们可将细胞纯化至高达99.8%的纯度，并将其与CD34HighCD31PosVEGFR-3PosPodoplaninPos内皮细胞区分开来。门控策略与分选的代表性结果见图3。该方法解决了使用磁珠分离法时遇到的问题。截至目前，这些细胞已传代至第13代。在此代次之后，淋巴管内皮细胞（LM LECs）和包皮来源的淋巴管内皮细胞（foreskin LECs）开始出现衰老现象，伴随形态学改变及细胞分裂能力下降。
<p class="jove...

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离人淋巴管畸形囊样血管和包皮中衬覆的淋巴内皮细胞。对这些细胞进行后续培养与扩增，可为基因组学、蛋白质组学、功能研究及细胞分化研究提供更高水平的实验条件。

淋巴系统疾病，如原发性淋巴水肿、淋巴管畸形和淋巴系统肿瘤，均为罕见病，可导致显著的病态性后果……

本实验的总体目标是利用荧光激活细胞分选技术，分离出高纯度的人类淋巴管畸形和包皮组织中淋巴管内衬的淋巴内皮细胞。首先通过酶消化法处理患者组织样本，实现这一目标；第二步，将获得的单细胞悬液进行培养，以富集淋巴内皮细胞的数量。在样品中，细胞随后用针对目标细胞表面标志物的抗体进行标记，并通过多参数荧光激活细胞分选技术进行分选。最终，包皮及淋巴管畸形来源的淋巴内皮细胞可在细胞培养中扩增，用于后续深入分析。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，荧光激活细胞分选所获得的细胞纯度超过99%，可避免因污染细胞过度生长而导致淋巴管内皮细胞丢失的问题。首先称量一个含有10毫升培养基的50毫升离心管，培养基中需添加抗生素-抗真菌素溶液。然后将淋巴管畸形组织或四块皮肤样本转移至该离心管中，再次称量离心管，以确定组织的重量。接下来，在二级生物安全柜中，使用无菌镊子和无菌剪刀将组织和培养基转移至一个100毫米的组织培养皿中。最后，将组织切成1立方毫米大小的组织块，然后将其转移至含有10毫升新鲜抗生素-抗真菌剂培养基的50毫升离心管中。轻轻涡旋混匀试管数次以重悬组织，然后离心样品。吸除上清液后，每100毫克剪碎的组织加入1毫升预热的消化液，在37°C培养箱中孵育组织，同时以200 rpm持续振荡。为成功富集淋巴管内皮细胞，关键在于准确判断细胞暴露于胶原酶和dispase反应的时间是否充分，以确保细胞在分离过程中存活。通过仔细监测组织消化过程，并在大部分组织已消化成细小片段时及时终止反应，即可实现此步骤。孵育结束后，确认几乎所有组织均已分解为小片段，然后将组织悬液通过70微米细胞筛过滤至无菌的50毫升离心管中。接着，使用带有橡胶活塞的3毫升注射器推杆研磨剩余组织，直至仅观察到少量细胞外基质残留为止。然后用与解离酶溶液等体积的内皮细胞培养基冲洗细胞滤网，并将细胞悬液离心沉淀。根据样本大小，将沉淀物重悬于最多20毫升的内皮细胞培养基中。细胞计数后，将2×10⁶个细胞接种至经纤连蛋白预包被的150平方厘米培养瓶中，总体积为20毫升内皮细胞培养基，进行过夜培养。第二天早晨，用含抗生素-抗真菌溶液的 PBS 洗涤三次，去除未结合的细胞。随后，为扩增淋巴内皮细胞数量，向细胞中加入新鲜的内皮细胞培养基，培养 5 至 7 天，直至细胞融合度达到约 80%。为通过多参数荧光激活细胞分选技术对细胞进行分选，需对细胞进行染色。首先，移除细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。然后在 37 摄氏度孵育 5 至 7 分钟后，加入 7 毫升解离溶液。收集解离的细胞，用三倍体积的内皮细胞培养基终止酶反应，并将细胞悬液转移至无菌管中。离心细胞三次，在最后一次洗涤后的第二和第三次离心中，每次用5 mL PBS洗涤沉淀。将沉淀重悬于5 mL新鲜PBS中，通过台盼蓝排斥法计数活细胞数量。完成细胞计数后。无菌条件下将细胞转移至流式细胞术染色管中，离心沉淀细胞以阻断非特异性结合。用5%F-B-S-P-B-S重悬细胞，冰上孵育20分钟。阻断完成后离心，弃去上清液并重悬细胞。将沉淀重悬于CD34、CD31抗体和VEGF受体3抗体混合液中。冰上孵育20分钟后，用2毫升FBS-PBS洗涤细胞三次，以去除未结合的抗体并重悬。将沉淀物重悬于300微升含碘化丙啶的FBS-PBS溶液中，置于冰上。最后，使用多参数荧光激活细胞分选仪对纯化的人淋巴内皮细胞进行分选。随后离心收集分选后的细胞，并将细胞沉淀重悬于适当的培养基中，用于细胞培养接种。此处显示的是用抗PODPL抗体标记的正常人淋巴管及人淋巴管畸形血管，注意观察人淋巴管畸形血管中明显的扩张以及管腔大小的显著差异。事实上，在未分级样品经过初始组织消化并培养24小时后，大多数淋巴管畸形均包含小囊性或微囊性和大囊性或宏囊性异常囊性结构。分选后并在细胞培养中再培养24小时，除成纤维细胞样细胞和平滑肌细胞外，还可观察到明显的内皮细胞克隆。然而，CD34阳性、CD31低表达、VEGF受体3阳性、podo planin阳性细胞会附着于培养容器表面，并呈现出如本图所示典型的鹅卵石样形态。观看本视频后，您应充分了解如何利用荧光激活细胞分选技术，从人类淋巴管畸形组织及完整皮肤淋巴管中高纯度地分离出淋巴内皮细胞。请务必注意，操作原代人体组织可能存在风险，因其可能含有对人类健康有害的传染性病原体。在进行本实验操作时，应始终采取标准预防措施，例如佩戴手套、护目镜和实验服。

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