Name: 该DNA氧化标志物的高效液相色谱法测量，8-氧代-7,8-二氢-2-脱氧鸟苷，在培养细胞和动物组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: 学习使用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）定量检测培养细胞和动物组织中的DNA氧化标志物8-oxo-dGuo，该方法通过优化样品制备条件有效减少氧化伪影。

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本研究由加拿大卫生部基因组研究与发展计划（GRDI）和加拿大生物技术监管战略（CRSB）资助。作者无利益冲突。

确保所有动物饲养、饲养环境、操作和实验均遵守当地的法规，并在开始任何研究之前获得实验方案的批准。对于本研究所描述的实验，动物护理、操作和处理均已通过加拿大卫生部动物护理委员会的批准。供应商信息见“试剂表”。
1. 生物样本的采集
<ol>
	<li>细胞或动物组织
	<ol>
		<li>在含有10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的F12-K培养基中培养人肺泡腺癌A549细胞。</li>
		<li>以每10厘米培养皿约100万个细胞的密度接种细胞。每次实验共使用12个培养皿（每个生物学重复3个培养皿 × 4个剂量组），以获得足量DNA（80 μg）用于酶切消化和高效液相色谱分析。</li>
		<li>当细胞密度超过培养皿表面积的约70%时，移除培养基，并用4 ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤细胞两次。</li>
		<li>对于培养的动物细胞，使用 KBrO3 作为阳性对照。 
		注意：KBrO 与线性正相关关系3 浓度与8-oxo-dGuo频率之间的关系已有文献报道9.</li>
		<li>将 KBrO 溶解3 在 PBS 中，确保其在细胞培养基中的终浓度大于 1 mM，以获得相对于未暴露细胞显著增加的 8-oxo-dGuo 水平。加入相同浓度的 KBrO3 向系列中的每块板加入（例如，12 个 10 厘米培养皿。</li>
		<li>将培养板在 37 °C 下孵育 3 小时。移除培养基，并用 PBS 洗涤一次。</li>
		<li>加入1 ml胰蛋白酶溶液（储存浓度2.5 g/ml），于37 °C孵育3分钟。</li>
		<li>用4 ml PBS洗涤，将每组细胞收集至一个50 ml圆锥形聚苯乙烯离心管中，在4 °C、1,000 × g条件下离心5 min。</li>
		<li>移除 PBS，将细胞沉淀物储存于 -80 °C，直至进一步分析。通过核分离可进一步减少人工 DNA 氧化，具体方法见其他文献。10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物组织
	<ol>
		<li>根据需要对动物进行给药。本方案中，对成年（9周龄）雄性Muta小鼠以橄榄油溶解的DBP 20 mg/kg bw，通过口服灌胃每日给药一次，连续给药三天。 
		注意：该转基因动物携带经基因工程改造的λ-噬菌体及突变报告基因lacZ E. coli11 用于转基因啮齿类动物突变检测12.</li>
		<li>进行动物尸检 例如， 用异氟烷麻醉小鼠后，通过颈椎脱位法处死，随后打开胸腔。立即用液氮速冻组织，于 -80 °C 保存直至分析。 &#160; 
		注意：处理后实施安乐死的时间可能是另一个重要变量（例如，在大鼠脑和肝脏中，DNA氧化在噪声暴露后72小时达到峰值）13).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. DNA 提取、沉淀与洗涤（对于组织样本，直接进入 2.2）
<ol>
	<li>在50 ml圆锥形聚苯乙烯离心管中，加入1 ml DNA提取剂（如DNAzol），将收集的细胞充分匀浆。使用1,000 μl移液器吸头反复吹打，使细胞沉淀完全分散，形成均一溶液。将匀浆液转移至新的1.5 ml微量离心管中，冰上孵育10–20 min。随后进行步骤2.3。</li>
	<li>在含有500 μl DNA提取剂的1 ml手持式不粘玻璃匀浆器中，匀浆15–20 mg组织。轻柔上下移动匀浆器约1分钟；较软的组织所需时间更短。轻柔操作可减少DNA剪切。将匀浆液置于冰上孵育10–20分钟。</li>
	<li>在1.5 ml锥形微量离心管中，于4 °C以10,000 x g离心10分钟，使匀浆沉淀。</li>
	<li>将所得上清液小心转移至新的1.5 ml微量离心管中，注意避免接触沉淀。</li>
	<li>从匀浆液中沉淀DNA：每1 ml匀浆液加入0.5 ml 100% EtOH。倒置离心管10次，确保裂解试剂与EtOH充分混匀。</li>
	<li>此时，DNA沉淀呈黏稠状，将其缠绕在塑料移液器吸头尖端例如，最大容纳量为200 μl）中，随后转移至新的1.5 ml圆锥形微量离心管。 &#160; 
	注意：可采用快速离心以去除分离DNA中残留的任何裂解液。 
	（DNA 洗涤与溶解）</li>
	<li>向分离的DNA中加入1 ml 75% EtOH。通过倒置离心管10次，充分悬浮DNA沉淀。</li>
	<li>小心地将乙醇从管中倾出，确保DNA沉淀附着在管壁上。将离心管垂直放置1-2分钟，用移液器吸去管底残留的多余乙醇。</li>
	<li>再重复DNA洗涤步骤一次，随后可将样品保存在-20 °C的乙醇中（可稳定保存数月），或立即进行消化步骤。</li>
	<li>将DNA溶解于消化缓冲液（如下所述）中，然后采用标准的光谱学方法进行定量即使用NanoDrop分光光度计测定260 nm处的吸光度。</li>
</ol>
3. 酶消化
<ol>
	<li>通过混合适当体积的 50 mM 单碱性磷酸钠溶液（含 2.0 mM KCl、1.0 mM 去铁胺（DFO）和 200 mM MgCl2）与 50 mM 双碱性磷酸钠溶液（同样含 2.0 mM KCl、1.0 mM DFO 和 200 mM MgCl2），配制“消化缓冲液”。每个样品需要 4.0 μl 单碱性和 17.0 μl 双碱性磷酸盐溶液。</li>
	<li>去除管底残留的乙醇，并将样品在空气中干燥约 5 分钟。确保 DNA 不完全干燥。</li>
	<li>将 80 μg 提取的 DNA 溶解于 21.0 μl 消化缓冲液中，加入 2.0 μl 消化缓冲液溶解的 1 单位 DNase I。</li>
	<li>轻轻涡旋以充分混匀，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。</li>
	<li>孵育结束后，加入 216.4 μl 含 2.0 mM KCl、1.0 mM DFO 和 200 mM MgCl2 的双碱性 50 mM 磷酸钠溶液。</li>
	<li>通过将一体积的消化缓冲液与九体积的双碱性 50 mM 磷酸钠溶液（含 2.0 mM KCl、1.0 mM DFO 和 200 mM MgCl2）混合，配制“消化缓冲液-2”。</li>
	<li>在 16.3 μl 消化缓冲液-2 中加入 0.025 单位磷酸二酯酶（PDE）I，上下吹打数秒，然后轻轻涡旋以充分混匀，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。</li>
	<li>在 8.0 μl 消化缓冲液-2 中加入 0.4 单位碱性磷酸酶（AP），上下吹打数秒，然后轻轻涡旋以充分混匀，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。加入 33.0 μl HPLC 级甲醇。</li>
	<li>立即或在 -80 °C 保存待用，按如下所述对消化后的 DNA 样品进行 HPLC 分析，以尽量减少氧化。&#160;注意：此处建议的 1.5 小时消化步骤基于其他文献中提出的时间间隔9，以及类似方案可实现完全 DNA 消化的研究结果9。因此，假设实现完全消化的唯一限制因素是时间，而酶抑制和样品不均一性可忽略不计。</li>
</ol>
4. 高效液相色谱运行：流动相的制备、仪器设置与维护
<ol>
	<li>使用超纯水配制所有缓冲溶液，并用高键合强度树脂处理例如Chelex 100：一种带有亚氨基二乙酸离子的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，可高亲和力螯合过渡金属，用于在样品制备过程中最大限度减少金属污染和DNA氧化。</li>
	<li>配制 250 mM 磷酸钠缓冲液，pH 6.2。使用二碱基磷酸钠（分子量 = 177.99 g/mol）与单碱基磷酸钠（分子量 = 119.98 g/mol）按 1 : 3.6957 的比例混合。 
	示例：因此，配制3 L储备液时，将70.81 g一碱基粉末与28.43 g二碱基粉末混合，加水至 例如， 2.8 L，检测溶液 pH 值是否为 6.2。使用分别配制的 250 mM 单或二碱磷酸钠溶液调节 pH 值，不得使用浓酸或浓碱。加入 2.24 g KCl，使 KCl 浓度达到 10 mM。</li>
	<li>准备流动相，分别装入三个瓶中，每瓶至少1 L，包含：溶剂B——HPLC级甲醇，溶剂B——超纯水，以及溶剂C——步骤4.2中制备的磷酸盐缓冲液。将高效液相色谱仪的流动相供给管插入各瓶中；其余管路也必须浸入其中任一容器内例如， 溶液C）即使不用于混合也需进行预启动。</li>
	<li>运行过程中，将流动相溶液按6%溶剂A、74%溶剂B和20%溶剂C混合，得到终浓度为50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.2），含2.0 mM KCl和6%甲醇的最终溶液。</li>
	<li>将电极从电化学检测器上拆下，拆解后使用制造商推荐的电极清洗液和抛光片清洁参比电极和工作电极。用超纯水冲洗清洁后的表面，轻轻擦去水分，并确保检测器干燥后再开启系统。</li>
	<li>重新组装检测器，并将流动相入口连接至电极。开启流路，使流动相在连接出口管路前充分填充电极。在开始优化前安装一根新色谱柱，确保安装方向正确，并遵循所有制造商的建议。</li>
	<li>提前开启HLPC仪器例如， 1 小时）的样本分析时间，以达到平衡并降低基线噪声。参见 表1 有关建议设置，请将背压限值设为 3,000 psi，以避免损伤色谱柱。开启脱气机，随后进行泵的冲洗及溶剂梯度的设置。</li>
	<li>根据制造商说明对泵进行干启动预处理。当流动相更换或管路入口暴露于空气时，需执行此操作以润湿管路。</li>
	<li>找到引子盘，并在其处插入一支10–15 ml的塑料注射器。确保注射器完全插入后，再打开管路。打开管路时，只需将圆盘逆时针旋转一圈即可。</li>
	<li>选择合适的HPLC接口开始冲洗。轻轻拉动注射器，使液体进入管路。当液体开始流动后，冲洗即完成；让程序继续运行直至结束。对所有管路重复此操作（通常为四条，具体取决于仪器）。</li>
	<li>或者，当管路因先前的干式预冲而已经湿润时，可采用湿式预冲（见下文）。 &#160; 
	注意：当两次使用之间间隔较长时间时（例如，两周或更长时间），建议采用干式预处理。</li>
	<li>使用HPLC用户界面将流动相溶剂组分的组成更改为各25%。在界面中选择“Direct Function”选项，然后选择“Wet Prime”选项。这将同时对所有管路进行预冲洗。</li>
	<li>通过观察进入废液容器的润洗管路，确保系统中的空气已完全排出。充分润洗后，确认管路中无任何气泡残留。若仍有气泡存在，请重复润洗操作。</li>
	<li>泵浦完成预冲后，开始调节高效液相色谱流动相。通过高效液相色谱仪操作界面手动调整流动相组成为6%甲醇（溶剂A）和94%水（溶剂B），并设定流速为0.9 ml/min。保持运行5分钟，以清除色谱柱清洗步骤中残留的甲醇。</li>
	<li>5 分钟后，将流动相组成调整为 6% 甲醇（溶剂 A）、74% 水（溶剂 B）、20% 缓冲液（溶剂 C），流速提高至 1.0 ml/min。其余参数设置详见下表总结 表1，并将背压限制设置为 3,000 psi，以避免柱损伤。 &#160; 
	注意：高效液相色谱（HPLC）系统可能出现基线漂移、峰分裂和信号强度降低等问题。通过每次使用后清洗色谱柱、定期清洁电极，以及确保缓冲液无污染，通常可克服上述问题。例如，颗粒物或微生物生长）。</li>
	<li>运行流动相约1-1.5小时，以获得稳定的基线信号。</li>
	<li>使用仪器软件界面，选择如下所示的参数 表1 运行时间设置为15分钟。进样。对于复杂样品，应延长运行时间（通过观察15分钟之后是否有峰出现，凭经验确定）。 &#160; 
	注意：仪器软件允许设置样品运行条件和自动进样程序。</li>
	<li>运行结束后，通过检测器界面关闭检测器池。务必遵循制造商关于关闭检测器的建议，因为不当操作和关机可能损坏仪器。切勿通过切换检测器背面的开关来关闭检测器池，否则可能损坏仪器。</li>
	<li>手动将流动相组成调整为6%甲醇和94%水，运行5分钟。</li>
	<li>手动将流速降低至0.7 ml/min，立即调整流动相组成为50%甲醇和50%水，运行至少20分钟。若未按推荐时间执行此步骤，可能导致色谱柱和检测器损坏。停止流速，然后关闭脱气机。</li>
</ol>
5. 标准品的制备
<ol>
	<li>按照上述步骤 4.1–4.3 配制流动相缓冲液。必须使用高效液相色谱（HPLC）流动相来配制标准品，以避免样品注入后因不同溶液混合而产生额外峰。</li>
	<li>使用前用超纯水将该溶液稀释至五分之一，最终溶液中甲醇（MeOH）含量必须为 6%。</li>
	<li>dGuo 标准品 
	注意：dGuo 检测所需的高氧化电位可能增加检测到干扰性电活性化合物的风险。可通过例如在 260 nm 处对 dGuo 进行紫外（UV）检测的标准曲线，并与电化学（EC）检测所得标准曲线进行比较来验证。如果两条曲线高度吻合（例如，补充图 1），且已考虑样品基质效应，则可采用 260 nm 紫外检测代替电化学检测进行 dGuo 检测。
	<ol>
		<li>取 1.0 mg dGuo 置于 1.5 ml 微离心管中，加入 1.0 ml HPLC 级甲醇（MeOH）。</li>
		<li>高速涡旋振荡直至 dGuo 完全溶解。此为初级储备液，可在 -20 °C 下保存数周。</li>
		<li>为配制次级 dGuo 储备液（0.5 mM），取 143 µl 初级储备液与 857 µl HPLC 流动相混合，充分涡旋。使用前置于冰上保存，并每日新鲜配制。</li>
		<li>进一步稀释以建立标准曲线（例如，表 2）。溶液置于冰上保存，每日新鲜配制。实验样品应与标准品连续进样分析。</li>
		<li>运行前，使用最高浓度的标准品调节检测器电压，以确定最佳检测电压。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8-oxo-dGuo 标准品
	<ol>
		<li>取 1.0 mg 8-oxo-dGuo 置于 1.5 ml 微离心管中，加入 0.1 ml HPLC 级甲醇（MeOH），高速涡旋至 8-oxo-dGuo 完全溶解。此为 8-oxo-dGuo 的初级储备液，可在 -20 °C 下保存数周。</li>
		<li>另取一离心管，加入 2.9 μl 初级储备液与 997.1 μl HPLC 流动相缓冲液，充分涡旋混匀。此为次级储备液（10,000 nM）。</li>
		<li>为配制用于标准曲线的工作液（250 nM），取 24.4 μl 次级储备液与 975.6 μl 流动相缓冲液混合。</li>
		<li>进一步稀释以获得构建标准曲线所需各浓度溶液（例如，表 3）。溶液置于冰上保存，每日新鲜配制。标准品应与实验样品一同进样分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量分析
	<ol>
		<li>使用标准软件（作为 HPLC-计算机接口的一部分；参见 补充图 2A）对 8-oxo-dGuo 和 dGuo 的色谱峰面积进行积分。</li>
		<li>绘制标准曲线（各分析物已知浓度 vs. 峰面积，补充图 2B）。根据标准曲线方程，计算每个样品中 8-oxo-dGuo/dGuo 的比值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 琼脂糖凝胶电泳
注意：可通过琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 消化是否完全。
<ol>
	<li>配制 50 倍浓度的 Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液：将 242 g Tris 碱（分子量 = 121.14）溶解于 750 ml 超纯水中。加入 57.1 ml 冰乙酸和 100 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0；当溶液 pH 用 e.g., NaOH 调至 8.0 时，EDTA 将完全溶解），再用超纯水定容至 1 L。室温保存，使用前稀释 50 倍。</li>
	<li>称取 1 g 琼脂糖，加入 100 ml 1×TAE 缓冲液中，微波加热 1–2 分钟使其溶解。佩戴护目镜和防护装备，避免接触沸腾的琼脂糖。</li>
	<li>将溶液冷却至约 50 °C，加入 5 μl 溴化乙锭（注意：致突变剂），倒入琼脂糖凝胶电泳装置中，并插入梳子。</li>
	<li>待溶液完全凝固后，在凝胶上覆盖 TAE 缓冲液，上样（上样体积取决于梳子大小；通常加入 10–20 μl DNA 样品，并与 6×上样染料混合以利于观察和上样）。</li>
	<li>电泳运行至染料迁移至凝胶长度约 2/3 处（e.g.，150 V 下运行 45 分钟）。在紫外灯下观察 DNA 条带。</li>
</ol>

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<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突或竞争性财务利益。

尽管8-oxo-dGuo已被报道为DNA氧化的一种有用生物标志物，但其准确定量仍具有挑战性。虽然已有多种发表的方法，但仍缺乏对实验方案的全面、详尽描述，以帮助研究人员在各自实验室中成功应用该方法。本文提供了一种基于高效液相色谱（HPLC）的详细实验方案概述，可帮助新用户建立有效的8-oxo-dGuo检测与定量方法。
目前已报道三种用于定量8-oxo-dGuo的主要方法。这些方法包括基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的商业试剂盒19、液相色谱/质谱（MS）法（例如，其他文献中所述方法9）以及高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）法，后者如本文所述。ELISA方法可能受到生物样品中某些化合物的干扰19。通常认为，与基于ELISA的方法相比，采用色谱技术获得的结果在8-oxo-dGuo定量方面更为可靠20。在比较HPLC-ED方法与基于MS的方法时，前者的优点在于设备成本相对较低（即，大约比基于MS方法所需设备便宜一个数量级）。此外，HPLC-MS方法优于HPL...

活性氧（ROS）在多种病理状况和异源物质代谢过程中其稳态水平可能升高，从而导致氧化性DNA损伤的发生频率增加。在多种可能的碱基氧化产物中，氧化性DNA损伤可通过稳定的生物标志物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo）进行便捷检测，该物质是2'-脱氧鸟苷（dGuo）的氧化形式之一1。8-oxo-dGuo是含量最丰富的DNA损伤产物2，因此尽管存在多种DNA氧化产物，它仍被更深入地研究作为DNA氧化的生物标志物3。在人体中，这种损伤可通过8-氧代鸟嘌呤糖苷酶1（hOGG1）介导的碱基切除修复途径进行修复4。若未被修复，8-oxo-dGuo可导致碱基对置换突变（即 G至T颠换）的发生4。重要的是，8-oxo-dGuo已被确立为与致癌作用的启动和促进相关的DNA损伤标志物2。因此，对8-oxo-dGuo进行准确定量是评估氧化性DNA损伤的一种有用且理想的生物标志物5。
关于氧化损伤型2-脱氧鸟苷的正确命名，以及通常作为氧化DNA损伤生物标志物所检测的化合物的正确名称，目前文献中存在广泛混淆6。8-氧代-dGuo的6,8-二酮式和6-烯醇-8-酮式互变异构体（见图1）是文献中讨论最多的两种主要互变异构体5,7。在生理pH值7.4条件下，6,8-二酮式是最主要的存在形式，也是最主要的DNA氧化产物7。因此，该氧化产物最恰当的名称应为8-oxo-dGuo，而非8-羟基-dGuo6。还需注意的是，大多数检测方法实际检测的是2-脱氧鸟苷（dGuo），而非碱基鸟嘌呤（Gua）或核糖核苷鸟苷（Guo）6。
准确检测和定量8-oxo-dGuo具有挑战性，原因包括：i) DNA样本消化过程的不稳定性，ii) 样品制备过程中dGuo意外氧化为8-oxo-dGuo，以及iii) 需要对分析型HPLC-ED方法进行有效验证8。在本方案中，我们通过提供有利于DNA完全消化的条件来实现i)，通过加入金属螯合剂、经螯合剂处理的溶液以及特殊的DNA分离试剂来实现ii)，而iii)仅通过引入阳性对照得到部分解决，从而确保该方法具备在生物样品中检测8-oxo-dGuo的能力。更深入的验证超出了本文的范围。然而，我们相信本方案将有助于潜在使用者根据自身研究目的，判断其需要对该方法进行正式验证的程度。后续将提供正式验证该方法所需步骤的清单。在开发和实施8-oxo-dGuo检测方法的过程中，我们回顾并整合了已发表的方法。因此，本方法避免了需从多个已发表文献中收集信息的繁琐过程——这些文献常缺乏关键的实验细节，同时为检测和定量8-oxo-dGuo的方法是否被成功采用提供了快速且直接的验证手段。该优化后的方法已成功用于分析培养细胞和小鼠组织中的DNA样品。本视频文章将协助其他研究团队建立一种通过HPLC-ED可靠检测和定量8-oxo-dGuo的有效方法。

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo 标准品</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>不恰当地被称为 &quot;8-羟基-2'-脱氧鸟苷&quot;；详见 &lt;strong&gt;图1&lt;/strong&gt; 及正文说明。</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>来源于 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>螯合重金属</td></tr><tr><td>去铁胺甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo 标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精子DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>钠盐</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>II型，来源于牛胰腺</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>该化合物在溶液pH值调节至8.0之前不会完全溶解（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 使用NaOH）</td></tr><tr><td>F12-K培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>保护柱</td><td>Chromatographic Specialties</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>防止色谱柱污染；也可能导致压力升高</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二酯酶I酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>II型，来源于响尾蛇（Crotalus adamanteus）毒液</td></tr><tr><td>特氟龙匀浆器</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 或 7724T-5（分别用于1 mL或5 mL）</td><td>体积（容纳容量）取决于待处理样品的量。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASIC键合球形硅胶柱</td><td>Chromatographic Specialties</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

使用高效液相色谱法测定培养细胞和动物组织中dna氧化生物标志物8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

氧化应激与多种生理和病理过程以及外源性物质代谢相关，可导致包括DNA在内的生物大分子发生氧化。因此，高效检测DNA氧化对医学、毒理学等多个研究领域具有重要意义。氧化损伤DNA的一个常见生物标志物是8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo；常被误称为8-羟基-2'-脱氧鸟苷，8-OH-dGuo或8-oxo-dG）。已有多种采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）测定8-oxo-dGuo的实验方案被报道。然而，这些方法主要应用于经促氧化剂处理的纯化DNA。此外，由于各实验室在方法学上的差异，尤其是分析仪器的不同，各实验室在采用已发表的HPLC-ED法检测8-oxo-dGuo时，均需进行细致的优化。目前尚缺乏系统描述此类优化过程的完整实验方案。本文提供了一种详细的HPLC-ED法检测培养细胞或动物组织DNA中8-oxo-dGuo的实验流程，展示了如何简便、快速地优化DNA样品制备过程，以最大限度减少样品处理过程中可能发生的非特异性DNA氧化。本方案还演示了在培养的人肺泡腺癌细胞中检测8-oxo-dGuo的方法即，经氧化剂KBrO₃处理的A549细胞）3，以及暴露于多环芳烃二苯并（def,p)屈（DBC，以前称为二苯并(a,l)芘，DalP）。总体而言，这项工作展示了如何对高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）方法进行简便优化，以实现对生物样品中8-oxo-dGuo的检测。

dGuo 的保留时间为 4.7 分钟，而 8-oxo-dGuo 的保留时间约为 6.4 分钟（图 2A 和 B）。如 图 2C 所示，两种分析物的峰高相差约 1,000 倍。通过在 +0.2 至 +1.1 V 的工作电位范围内运行标准品，获得 8-oxo-dGuo 和 dGuo 的伏安图。8-oxo-dGuo 的最佳工作电位确定为 +0.5 V，dGuo 为 +0.9 V（图 3）。这些电位值与文献中报道的其他玻碳电极结果一致14,15。据报道，8-oxo-dGuo 和 dGuo 的电化学检测限和动态范围分别处于飞摩尔（femtomole）和纳摩尔（nanomole）水平8,9。应每天运行 dGuo 和 8-oxo-dGuo 的标准曲线，以确保在合适的浓度范围内实现线性检测以及仪器的正常性能（图 4）。标准曲线通过将峰面积对已知分析物浓度作图构建（补充图 2），从而可根据标准曲线生成的方程计算...

本实验方案的目的是通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）检测培养细胞或动物组织DNA中的DNA氧化标志物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo）。

使用高效液相色谱法测定培养细胞和动物组织中DNA氧化生物标志物8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine

氧化应激与多种生理和病理过程以及外源性物质代谢相关，可导致……的氧化

本实验的总体目标是通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）对生物样本中的DNA氧化产物8-oxo-dG进行检测和定量。该方法首先从生物样本中分离DNA，随后在DNA完全消化过程中加入金属螯合剂和特殊的DNA提取试剂，以最大限度减少样本制备过程中可能发生的非特异性DNA氧化。接着优化HPLC-ED的运行条件，并建立8-oxo-dG和2'-脱氧鸟苷的标准曲线。最后一步是将消化后的DNA与纯的8-ODdG和2'-脱氧鸟苷一起在HPLC中连续运行，以测定待研究的消化DNA样品中8-ODdG与2'-脱氧鸟苷的比值。最终，通过HPLC-ED检测和定量8-ODdG，用于量化生物样品中DNA氧化的程度。是的，该方法相较于现有技术的主要优势在于，它整合了多个已发表文献中的相关信息，同时为在新实验室环境中成功建立该方法提供了快速且简便的验证手段。该方法有助于回答生物医学和毒理学研究中的关键问题，例如氧化应激，或更具体地说DNA氧化，如何在机制上与不良效应相关联，以及培养细胞如何作为实验动物。通常，刚接触该技术的研究人员会遇到困难，因为在新的实验室环境中需要优化多个参数，以确保新方法正确运行。对该方法的可视化演示至关重要，因为实验步骤可能难以掌握，涉及大量需要优化的参数。由来自渥太华大学的前合作项目学生 Dean Kennedy 女士（Dr. Nikolai）示范本实验操作。可从培养的细胞中提取 DNA。操作时，需确认细胞数量足以进行 DNA 提取，通常至少需要两至三个直径为 10 厘米的培养皿，细胞密度约为 70%。弃去细胞培养液，用 PBS 洗涤细胞，用细胞刮或胰蛋白酶将细胞从培养皿上分离，收集至 50 毫升圆锥形聚苯乙烯离心管中，通过离心收集细胞，细胞将在管底形成沉淀。将细胞加入含有1毫升DNA提取试剂（如DN Azo）的50毫升圆锥形聚苯乙烯离心管中进行匀浆。使用1000微升移液器吸头充分分散细胞沉淀，直至溶液均匀。将匀浆液转移至新的1.5毫升微量离心管中，冰上孵育10至20分钟。或者，若从组织开始操作，将15至20毫克组织在含有500微升DNA提取剂的1毫升手持式不粘玻璃匀浆器中匀浆，轻柔地上提和下压匀浆器约1分钟。较软的组织所需时间更短。轻柔操作可减少DNA剪切，将匀浆液置于冰上孵育约10至20分钟。接下来，将来自细胞或组织的匀浆液在1.5毫升锥形微量离心管中，于4°C、10,000 G条件下离心10分钟。小心地将所得上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。注意避免接触沉淀物，通过每1毫升匀浆液加入0.5毫升100%乙醇，从匀浆液中沉淀DNA。将离心管倒置10次，以确保分离试剂与乙醇充分混匀。此时DNA沉淀呈黏稠状。用塑料移液枪头卷取DNA，然后转移至新的1.5毫升锥形离心管。该卷取方法可能不适用于所有组织，可能需要采用离心法。接着，向分离的DNA中加入1毫升

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

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科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

该DNA氧化标志物的高效液相色谱法测量，8-氧代-7,8-二氢-2&#39;-脱氧鸟苷，在培养细胞和动物组织

基于自由基的仿生化学已被应用于构建生物标志物开发所需的化合物库。...

化学生物学中的自由基：从化学行为到生物标志物的开发

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。...

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

本方案描述了一种利用ELISA技术对MCF-7细胞中DNA氧化损伤进行定量检测的有效方法。...

使用ELISA法检测MCF-7细胞中8-oxo-dG水平以评估氧化性DNA损伤

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的时间进程呈双相特征，表现为产物生成的快速爆发相和线性的稳态相。利用淬灭-流动技术，可分别测定爆发相速率和稳态速率，它们对应于8-氧代鸟嘌呤的切除以及糖基化酶从产物DNA上的释放。...

稳态、预稳态与单次转换动力学测量用于DNA糖基化酶活性研究

DNA 折纸是一种通过编程 DNA 分子自组装来制备精确纳米级结构的强有力方法。本文描述了一种利用 DNA...

DNA折纸法制备生物响应型机器人的折叠与表征

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。...

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

本文介绍了一种在将样品从含抑制剂的酸性溶液转移至X射线光电子能谱仪的过程中，防止金属基底发生氧化的实验方案。...

利用XPS测定缓蚀剂/金属界面的化学组成：最小化浸渍后氧化

我们描述了光子温度计的制备与测试过程。...

光子温度计的制备与测试

本方法通过超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）分析多种底物，用于在HeLa细胞中鉴定组蛋白去乙酰化酶（HDAC）亚型特异性抑制剂。该方法无需使用抗体，可在活细胞环境中反映HDAC1和HDAC6的活性，与单一亚型的无细胞检测方法相比具有优势。...

使用超高效液相色谱-质谱法同时测定HeLa细胞中HDAC1和HDAC6活性

本方案描述了磁性颗粒的合成及其通过动态光散射和电泳光散射评估其DNA结合特性的方法。该方法重点监测颗粒尺寸、多分散性以及颗粒表面的泽塔电位的变化，这些参数在DNA等物质的结合过程中起着关键作用。...

通过动态光散射和电泳光散射分析DNA-磁性颗粒结合

学习使用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）定量检测培养细胞和动物组织中的DNA氧化标志物8-oxo-dGuo，该方法通过优化样品制备条件有效减少氧化伪影。

使用高效液相色谱法测定培养细胞和动物组织中DNA氧化生物标志物8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine

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