骨条件培养基的制备和生物测定

本视频的总体目标是描述如何制备骨条件培养基，并在体外测试其活性。这是通过首先使用骨刮刀从猪下颌骨上收集骨屑来实现的。第二步是热处理、脱矿或不对骨片进行处理，然后在培养基中孵育 24 小时。

接下来，收集包含从骨片释放的所有因子的骨条件培养基。最后一步是用骨条件培养基刺激细胞，或者在孵育期后将生物材料与骨条件培养基和种子细胞进行预孵育。最终，定量实时 PCR 用于显示处理后细胞基因表达的变化。

单独使用自体骨移植物或与其他生物材料联合使用可刺激种植体周围骨缺损的骨再生，从而确保良好的长期效果。本视频介绍了一种体外生物测定法，可用于确定质量细胞对骨骼条件下生物分子的遗传反应。中等 骨状况培养基可以帮助回答创伤颌面和牙科领域的关键问题，例如为什么自体骨是骨再生中标准移植物的目标。

从加工过的骨头制备条件培养基，如热处理骨自动移植物或化骨基质，可能很难标准化。因此，精确很重要。首先，从当地肉店获取新鲜的猪下颚，并将它们放在坚固的表面上。

接下来，使用骨膜释放全层骨膜瓣，同时特别注意不要留下任何附着在骨骼上的软组织。取出骨膜后，牢牢握住骨刮刀，用长动作从下颌骨的颊侧收获骨屑。丢弃任何长度小于 1 毫米的骨片。

通过在 10 厘米培养皿中快速用培养基覆盖骨片来防止骨片变干。收集到足够的骨片后，通过对 5 克骨片进行巴氏杀菌来准备一个热控制批次。通过在 30 摄氏度下加热 80 分钟或在 20 摄氏度下高压灭菌 121 分钟来对薯片进行巴氏杀菌。

接下来，将 5 克骨片加入一磨牙盐酸溶液中，并将它们放在摇床上，在 4 摄氏度下放置 4 到 6 小时，以制备脱盐对照品。然后用培养基反复清洗骨片，直到达到中性 pH 值。将 5 克新鲜骨片和每种对照制剂 5 克放入单独的培养皿中，并向每个培养皿中加入 10 毫升新鲜培养基。

然后将样品在 37 摄氏度的加湿环境中孵育 24 小时，以便在第二天制备条件培养基。从每个培养皿中取出培养基，并将其放入 15 毫升锥形管中。将骨质培养基以 200 倍重力离心 10 分钟，以去除任何碎屑。

然后取出上清液，通过 0.2 微米无菌过滤器，将 Ali 四边形储存在零下 80 摄氏度，直到需要为止。首先将人间充质细胞（如骨细胞或牙龈和牙周韧带成纤维细胞）以每平方厘米 30， 000 个细胞的浓度接种到 12 鲸鱼板中。用生长培养基覆盖细胞，第二天早上让细胞附着在板上过夜。

丢弃培养基，并在 37 摄氏度下用预热的 PBS 洗涤细胞。然后通过添加预热的无血清培养基（含和不含 20% 骨条件培养基）来刺激细胞。如果还测试生物材料的吸收能力，请将骨条件培养基（包括任何对照品）添加到含有目标生物材料的试管中，并将试管在 37 摄氏度下孵育 1 小时。

然后用预热的 PBS 强烈冲洗生物材料，并以每平方厘米 30， 000 个细胞的浓度将人间充质细胞接种到材料上。将细胞单独或接种在生物材料上的细胞在 37 度细胞 CS 的潮湿气氛中孵育 24 小时。然后丢弃培养基。

用预热的 PBS 冲洗细胞，并使用标准 RNA 分离方案提取细胞 RNA。分离 RNA 后，从提取的 RNA 的相同浓度开始，并对每个样品进行逆转录酶反应，以制备每个处理组的 CD NA 样品。然后对样品进行定量实时 PCR，以使用随附文本方案中列出的引物和条件寻找所选基因的水平。

最后，通过使用 delta delta CT 方法将基因的循环阈值水平标准化为管家基因 Gabb dh，从而根据相对基因表达水平计算骨条件培养基的质量。以下是一些典型结果，显示了暴露于骨条件培养基 24 小时的口服成纤维细胞的基因表达变化。两个基因 adrenalin 和 pent trax 以及 3 个基因均显著下调至原始水平的 40%，而白细胞介素 11 和 33 以及 N-A-D-P-H 氧化酶 4 和蛋白聚糖 4 均上调高达 200 倍。

有趣的是，用于保护骨片免受周围软组织的胶原蛋白屏障膜吸收了大部分导致基因表达变化的骨条件培养基。然而，胶原膜未能吸收控制白细胞介素 33 表达的因子。因此，在这种情况下，白细胞介素 33 的表达不受调节。

此处描述的方案可以适用于研究涉及骨再生的不同类型的细胞的反应。此外，该方案可用于从加工骨和其他骨填充物制备条件培养基。该生物测定法的临床相关性尚不清楚。

细胞对体内 BCM 的反应可能更复杂，包括大量基因和不同的靶细胞，扩展了此处介绍的基因。尽管如此，我们的生物测定法为骨 RAF 分子的可能复杂组成和体外细胞反应提供了初步见解。