Name: 骨条件培养基的制备和生物测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习制备骨条件培养基并进行体外生物测定的方法。本视频演示从猪下颌骨采集骨片、热处理或脱矿处理、孵育培养基24小时收集BCM，以及使用实时定量PCR分析基因表达变化的技术流程。

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作者感谢Catherine Solioz提供的娴熟协助。

1. BCM 制备
<ol>
	<li>尽可能从当地屠户处获取新鲜的猪下颌骨。将下颌骨放置在坚固的表面上，剥离全层瓣，特别注意不要在骨表面残留任何软组织或骨膜。操作环境应保持清洁，无需在超净工作台内进行。</li>
	<li>完成全层瓣剥离后，使用骨刮匙从颊侧刮取骨碎片。请注意，骨刮匙必须锋利。牢固握持骨刮匙，以长距离刮取动作收集骨组织。丢弃尺寸小于1 mm的骨碎片。
	<ol>
		<li>如需保留天然骨碎片，应立即将其置于直径为10 cm的塑料培养皿中，加入含1%抗生素和抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），防止其干燥。</li>
		<li>如需评估热处理的影响，将骨碎片在80 °C下巴氏灭菌30分钟，或在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>如需评估脱矿作用的影响，将骨碎片在4 °C条件下于1 M HCl中振荡4–6小时，随后用培养基反复冲洗，直至pH值呈中性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将总共5 g骨碎片加入含10 ml新鲜DMEM（补充1%抗生素和抗真菌剂）的新塑料培养皿中。</li>
	<li>将塑料培养皿置于37 °C、加湿环境中培养24小时。随后收集骨条件培养基（BCM）。以200 × g离心10分钟去除碎片，经无菌过滤（0.2 nm），分装后于-80 °C冷冻保存。</li>
	<li>使用前立即解冻BCM原液，避免反复冻融。</li>
	<li>对于指定实验，将胶原膜在BCM或无血清培养基中室温浸泡1小时。用PBS充分洗涤膜，随后将其放入96孔板中。湿润的膜用于接种细胞。</li>
	<li>BCM的制备流程总结于图1中。</li>
</ol>
2. 基于间充质细胞的生物测定
<ol>
	<li>将人源间充质细胞（例如骨细胞、牙龈和牙周韧带成纤维细胞）以30,000个细胞/cm2的浓度接种于12孔板中。接种时使用含DMEM、10%胎牛血清和抗生素的生长培养基。让细胞在过夜（O/N）条件下贴壁。</li>
	<li>弃去培养基，用预热至37 °C的PBS洗涤细胞。通过加入预热的无血清培养基（含或不含20% BCM）刺激细胞。将细胞置于37 °C、湿润环境中培养24小时。</li>
	<li>弃去培养基，用预热的PBS冲洗细胞，并根据您所选用的方案提取RNA。</li>
	<li>调整RNA浓度，使各样品中RNA量相等。制备cDNA，并使用表1所示引物进行qRT-PCR分析目的基因。 
	注意：各组分的稀释比例为：2x SYBR Green、20x 正向引物、20x 反向引物、5x 无菌去离子水、5x cDNA。qRT-PCR反应共进行40个循环，每个循环为95 °C 15秒和60 °C 1分钟。</li>
	<li>采用Δ(ΔCt)法对GAPDH看家基因进行归一化处理，计算相对表达水平，其中ΔCT = 目标基因CT值 - GAPDH CT值，Δ(ΔCT) = 刺激组ΔCT - 对照组ΔCT。</li>
	<li>完成此质量控制后，将BCM加入培养基中，用于刺激包括间充质细胞、造血细胞或内皮细胞在内的所有类型细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Buser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Stability+of+Early+Implant+Placement+with+Contour+Augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation.</a> Journal of dental research. , (2013).</li>
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<li>Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((conditioned+medium+enhances+osteoclastogenesis+in+murine+bone+marrow+cultures.+Clin+Oral+Impl+Res%3B+in%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oral+Maxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).</li>
<li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-conditioned+medium+changes+gene+expression+in+bone-derived+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22IJOMI+accepted%22%5BJournal%5D)">Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts).</a> IJOMI accepted. , (2014).</li>
<li>Fulzele, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelopoiesis+is+regulated+by+osteocytes+through+Gsalpha-dependent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling.</a> Blood. 121, 930-939 (2013).</li>
<li>Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demineralized+bone+matrix+mediates+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+in+vitro%3A+effect+of+age+of+cell+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor.</a> Journal of. 11, 1703-1714 (1996).</li>
<li>Kupcova Skalnikova,, H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+techniques+for+characterisation+of+mesenchymal+stem+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome.</a> Biochimie. , (2013).</li>
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<li>Schuldt Filho,, G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+of+demineralized+bone+matrix+activates+TGF-%CE%B2+signaling+pathways+in+mesenchymal+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cranio+Maxill+Surg%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro.</a> J Cranio Maxill Surg. , (2015).</li>
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<li>Stoecklin-Wasmer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbable+collagen+membranes+for+periodontal+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review.</a> Journal of dental research. 92, progress. 773-781 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。Jordi Caballé-Serrano 收到了来自瑞士巴塞尔牙科研究与教育基金会的奖学金。

骨条件培养基反映了骨移植材料在骨再生早期阶段释放的生物活性。本文所述方案可适用于研究参与骨再生的不同类型细胞的反应。此外，该方案也可用于制备经处理的骨组织或骨填充材料的条件培养基。这些方法操作简便，基于一个简单的原理：从各种天然及处理后的骨组织中释放出的生物因子。了解骨条件培养基对间充质细胞的影响，有助于深入认识移植物的整合过程以及自体骨移植物的特性。基于这一理念，我们已积累了关于来源于天然骨组织的骨条件培养基作用效应的大量知识 11,15 和处理过的骨组织 14,20 对间充质细胞的基因表达以及增殖、迁移和向三个主要谱系——成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞——的分化均有影响 11. 还研究了BCM靶向造血细胞的能力，例如在调节破骨细胞生成方面的作用 13许多潜在的靶细胞正等待响应 BCM 体外本文所述方案可作为该研究的入门指南。
所展示的实验方案还可用于进一步揭示BCM在间充质细胞中特异性激活TGF-β调控基因的分子机制。例如，TGF-β受体I拮抗剂SB431542可阻断BCM对...

自体骨被广泛用于修复因畸形、切除手术、创伤重建手术以及种植体植入前造成的骨缺损1,2。了解骨移植材料支持移植物整合过程的生物学原理，不仅对于理解为何自体移植物被视为重建手术中的“金标准”至关重要，同时也为骨替代材料的仿生优化设计提供了依据3。然而，与骨替代材料相比，自体骨的移植物整合速度更快4,5。因此，揭示使自体骨在促进骨再生方面如此高效的分子与细胞机制显得尤为迫切。
自体移植物被认为具有三种教科书级特征，可支持骨愈合过程 6,7首先，自体骨具有骨传导性，可引导新形成的骨组织长入缺损区域。其次，自体骨具有骨生成性，即其含有可分化为成骨细胞的间充质细胞。 8第三，自体骨具有骨诱导性，因为埋藏于基质中的生长因子（如骨形态发生蛋白）可启动软骨内成骨甚至膜内成骨过程。 9还有一个方面：新制备的骨碎片具有基于旁分泌功能的特性 体外 使用“骨条件培养基”的观察结果 10-15还应提及髓系造血的影响 16一种类似的术语“脱矿骨基质条件培养基”早在1996年就已被提出，该术语支持骨组织具有旁分泌功能的整体概念，即使在经过脱矿处理后依然如此。 17对于我们的目的，BCM 可以从新鲜的猪下颌骨制备 10,11. 对BCM的蛋白质组学分析揭示了其复杂的组成，包括生长因子和细胞外基质成分 10，同时也拓展了关于完整骨组织中蛋白酶体的现有知识 18,19因此，BCM 应反映不同修饰骨移植物所释放的活性 体外.
当间充质细胞（例如从骨碎片或口腔软组织中分离的细胞）暴露于BCM时会发生什么？ 体外，BCM 可减少成骨和成脂分化，并引起 IL11 表达显著升高 11全基因组微阵列分析显示，间充质细胞在响应BCM时有更多基因差异表达。这些基因包括肾上腺髓质素（ADM）、白细胞介素11（IL11）、白细胞介素33（IL33）、NADPH氧化酶4（NOX4）、蛋白聚糖4（PRG4，又称润滑素）和五聚素3（PTX3）。 15. 从高压灭菌骨碎片获得的BCM未能改变相应基因的表达 14经巴氏消毒和冷冻处理的骨碎片中的BCM能够改变基因表达 14脱矿骨基质条件培养基（DBM-CM）也可改变TGF-β调控基因的表达 20有趣的是，用于保护骨碎片免受周围软组织侵入的胶原屏障膜 21,22，吸附了BCM中负责基因表达变化的那些部分 23BCM 研究可拓展至参与骨再生的其他细胞类型，例如骨吸收性破骨细胞和内皮细胞等。总体而言，不断积累的 体外 数据为临床前研究的设计提供了科学依据。
本实验方案包含两个部分：首先，介绍如何制备BCM；其次，介绍如何基于间充质细胞检测其生物学活性。 体外.

<table><tbody><tr><td>猪下颌骨</td><td>当地屠夫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨刮匙</td><td>Hu-Friedy</td><td>PPBUSE2/36</td><td></td></tr><tr><td>抗生素 &amp;和抗真菌剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>胶原膜（Bio-Gide）</td><td>盖氏</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>16030074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; 高纯度RNA提取试剂盒</td><td>罗氏</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>罗氏</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green（用于qRT-PCR）</td><td>罗氏</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>罗氏</td><td>11666789001</td><td></td></tr></tbody></table>

骨诱导培养基：制备与生物活性检测

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

自体骨移植在口腔颌面外科、骨科和创伤学中被广泛应用。自体骨移植不仅能够替代缺失的骨组织，还能支持骨再生的复杂过程。这种自体移植物的良好性能归因于其三种特性：骨传导性、成骨性和骨诱导性。然而，还存在另一个方面：骨移植物会释放大量分子，包括可作用于参与骨再生的间充质细胞的生长因子。骨移植物的旁分泌特性可以被研究 体外 通过使用骨条件培养基（BCM）实现。本文介绍了一种从天然猪皮质骨以及经过热处理或脱矿处理的骨组织制备骨条件培养基的实验方案。细胞可直接暴露于BCM中，或接种于预先用BCM浸泡过的生物材料（如胶原膜）上。我们提供了相关示例 体外 基于间充质细胞的生物测定，研究TGF-β调控基因的表达。所展示的实验方案有助于进一步揭示骨移植材料在骨再生过程中的旁分泌效应，并为重建外科领域的转化研究开辟新路径。

骨条件培养基（Bone Conditioned Medium）由新鲜的猪骨碎片制备而成。图1和图2分别展示了制备BCM以及将生物材料与BCM联合使用的一般流程。在制备BCM过程中，应尽量获得较大的骨碎片，并采用长行程研磨；短行程研磨或产生过小的骨碎片可能会影响最终BCM的质量。BCM的质量可通过分析其靶基因（ADM、PTX3、IL11、IL33、NOX4和PRG4）的基因表达水平进行控制（图3）。其中，ADM和PTX3的表达可下调至0.4倍，而IL11、IL33、NOX4和PRG4的表达可上调达200倍。若口腔成纤维细胞未表现出如上所述水平的BCM靶基因表达，则应检查细胞状态是否健康，或使用新的下颌骨重新制备BCM。图4展示了在胶原屏障膜上接种的口腔成纤维细胞中BCM靶基因表达的典型结果。使用经巴氏灭菌骨碎片的条件培养基（20%浓度）或脱矿骨碎片的条件培养基刺激的口腔成纤维细胞，其基因表达水平与BCM刺激的细胞相似（表2和表3）。然而，...

我们在此介绍如何制备骨组织条件培养基（BCM）并检测其活性 体外.

自体骨移植在口腔颌面外科、骨科和创伤学中被广泛应用。自体骨移植不仅能够替代缺失的...

本视频的总体目标是介绍如何制备骨条件培养基，并在体外检测其生物活性。首先，使用骨刮匙从猪下颌骨获取骨碎片。第二步是在将骨碎片置于培养基中孵育24小时之前，对其进行热处理、脱矿处理或不做任何处理。接下来，收集骨组织条件培养基，其中含有骨碎片释放的所有因子。最后一步是用骨组织条件培养基刺激细胞，或先将生物材料与骨组织条件培养基预孵育，然后在孵育结束后将细胞接种到材料上。最终通过定量实时PCR检测细胞经处理后基因表达的变化。单独使用自体骨移植材料或将其与其他生物材料联合使用，可促进种植体周围骨缺损的骨再生，从而确保良好的长期效果。本视频展示了一种体外生物测定方法，可用于确定骨微环境中的生物分子对骨细胞的基因表达反应。骨微环境培养基有助于回答创伤、颌面及牙科领域中的关键问题，例如为何自体骨移植被视为骨再生中的金标准。制备来自加工骨组织的条件培养基（如热处理骨自体移植材料或脱矿骨基质）可能难以标准化。因此，操作必须精确。首先，从当地屠夫处获取新鲜的猪下颌骨，并将其放置在坚固的表面上。接下来，使用骨膜剥离器分离骨膜，形成全层骨膜瓣，同时需特别注意避免任何软组织残留在骨面上。骨膜去除后，牢固握住骨刮匙，以长距离刮取动作从下颌骨的颊侧采集骨碎片。丢弃长度小于1毫米的骨碎片。将收集的骨碎片迅速用培养基覆盖于10厘米的培养皿中，以防止其干燥。当收集到足够量的骨碎片后，取5克骨碎片制备热处理对照组，通过以下方法进行巴氏消毒：在80摄氏度加热30分钟，或在121摄氏度下高压灭菌20分钟。接下来，通过将五克骨碎片加入一摩尔盐酸溶液中，并在4摄氏度下置于摇床上震荡4至6小时，制备脱矿质对照样本。然后用培养基反复清洗骨碎片，直至达到中性pH值。将五克新鲜骨碎片以及每种对照处理各五克分别放入不同的培养皿中，向每个培养皿中加入10毫升新鲜培养基。然后将样品置于37摄氏度的湿润环境中孵育24小时，以制备次日所需的条件培养基。吸出每皿中的培养基，并将其转移至15毫升锥形管中。将骨组织条件培养基在200 × g条件下离心10分钟，以去除所有碎片。然后去除上清液，并通过0.2微米的无菌滤器过滤，将分装样品在-80摄氏度下冷冻保存，直至需要时使用。首先将人源间充质细胞（如成骨细胞或牙龈及牙周韧带成纤维细胞）以每平方厘米30,000个细胞的浓度接种于12孔板中。加入生长培养基覆盖细胞，并在37°C孵育过夜，使细胞在次日早晨贴壁。弃去培养基，用预热至37摄氏度的PBS洗涤细胞。随后通过加入预热的无血清培养基刺激细胞，培养基中含或不含20%骨条件培养基。若同时需检测生物材料的吸附能力，则将含或不含骨条件培养基的培养基（包括相应的对照组）加入含有目标生物材料的试管中，并于37摄氏度孵育1小时。然后用预热的PBS剧烈冲洗生物材料，并以每平方厘米30,000个细胞的浓度将人源间充质细胞接种到材料上。将单独培养的细胞或接种在生物材料上的细胞置于37摄氏度、湿润的环境中培养24小时。随后弃去培养基。用预热的PBS洗涤细胞，并使用标准RNA提取方法提取细胞RNA。RNA提取完成后，取等浓度的RNA起始材料，对各处理组进行逆转录反应，制备cDNA样品。然后利用随附文本方案中列出的引物和条件，对样品进行实时定量PCR，以检测所选基因的表达水平。最后，使用ΔΔCT法将基因的循环阈值归一化至看家基因Gabb dh，从而根据相对基因表达水平计算骨条件培养基的质量。以下是一些典型结果，显示口腔成纤维细胞在骨条件培养基中培养24小时后基因表达的变化。两个基因adrenalin和pent trax以及基因three的表达均显著下调至原始水平的40%，而白细胞介素11和33，以及N-A-D-P-H氧化酶four和蛋白聚糖four的表达则最多上调达200倍。有趣的是，用于保护骨碎片免受周围软组织影响的胶原屏障膜会吸收大部分骨条件培养基，而该培养基正是引起基因表达变化的关键因素。然而，胶原膜未能吸收调控白细胞介素33表达的因子。因此，在此条件下，白细胞介素33的表达不受调控。本方案可适用于研究涉及骨再生的不同类型细胞的反应。此外，该方案还可用于从加工骨及其他骨填充材料中制备条件培养基。这种生物测定的临床相关性尚不明确。细胞在体内对BCM的反应可能更为复杂，涉及广泛的基因和多种不同的靶细胞，超出了本研究中所展示的范围。尽管如此，我们的生物测定实验首次揭示了骨来源RAF分子可能具有的复杂组成及其在体外的细胞反应。

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科研

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Biology

生物学

骨条件培养基的制备和生物测定

本视频展示了通过流感病毒感染刺激骨髓来源的巨噬细胞，以评估多种caspase的激活情况。在巨噬细胞裂解、裂解物热灭活及离心后，收集细胞内caspase用于后续免疫学分析。...

巨噬细胞中多种Caspase激活的评估

本视频展示了通过施加刺激以促进少突胶质细胞系细胞释放分子，从而制备少突胶质细胞条件培养基（OCM）的方法。该培养基富含生长因子、细胞因子及其他生物活性分子，可添加至神经元培养体系中，用于研究少突胶质细胞分泌因子对神经元生理功能及连接性的影响。...

一种生成少突胶质细胞条件培养基的方法

底板是发育中脊髓的关键结构，可向祖细胞和分化中的神经元提供可扩散的信号。本文介绍一种制备底板条件培养基的方法，将其应用于新鲜脊髓组织，并通过生物化学方法检测其对目标蛋白的影响。...

分离底板组织的培养及条件培养基的制备以评估底板释放信号的功能特性

本文描述了一种 离体 由小鼠淋巴结、骨、肺和脑组织来源的条件培养基组成的模型系统。该模型系统可用于鉴定和研究器官来源的可溶性因子及其对癌细胞器官趋向性和转移行为的影响.

器官条件培养基的制备及其在研究器官特异性对乳腺癌转移行为影响中的应用

用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。...

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

本方案介绍了一种放射性标记氨基酸摄取检测方法，可用于评估原代细胞或分离骨骼中的氨基酸消耗情况。...

培养骨细胞和分离骨骨干中氨基酸消耗的评估

实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。...

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

本视频介绍了一种从冈比亚按蚊细胞系中纯化沃尔巴克氏体（Wolbachia...

在无细胞培养基中维持沃尔巴克氏体

学习制备骨条件培养基并进行体外生物测定的方法。本视频演示从猪下颌骨采集骨片、热处理或脱矿处理、孵育培养基24小时收集BCM，以及使用实时定量PCR分析基因表达变化的技术流程。

骨诱导培养基：制备与生物活性检测

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