氧化铜纳米颗粒去除铀中痕量元素 原位 回收渗出液及其对细胞活力的影响

本实验的总体目标是研究氧化铜纳米颗粒处理作为生产渗出液中污染物去除方法的效果，并利用培养的人源细胞评估其细胞毒性。首先使用氧化铜纳米颗粒处理生产渗出液，随后检测处理前后各元素浓度的变化。

接下来，将浓缩的细胞培养基分别用未经处理的采出水或氧化铜稀释，并加入经纳米颗粒处理的采出水以及标准细胞培养添加剂，以制备测试用培养基，包括未经处理的采出水培养基、水培养基和含氧化铜的纳米颗粒处理采出水培养基。随后将这些培养基施加于人源肾细胞和肝细胞培养物，并在七天内测定细胞活力。

最终，M-T-T-S-A 表明，氧化铜纳米颗粒可有效去除采出水中所含的砷、硒、钒和铀。使用氧化铜纳米颗粒处理后，人肾细胞和肝细胞的存活能力有所提高。本研究是首次在细胞培养体系中，利用氧化铜纳米颗粒去除特定污染物，并同步评估去除过程中相关细胞毒性的变化。

与现有方法相比，该技术的主要优势在于，以廉价的水凝胶珠形式，将自然状态下的环境样品与纳米颗粒一同进行测试。本研究中测试的氧化铜纳米颗粒可应用于其他地下水系统，例如与小型社区相关的民用地下水系统。氧化铜纳米颗粒的再生利用可减少废物产生，从而最大限度地降低废物处理问题。

开始此实验步骤时，首先制备氧化铜纳米颗粒，并按照文本方案收集生产放流水（PBW）。将50毫克制备好的氧化铜纳米颗粒加入50毫升锥形管中，随后加入50毫升PBW，密封试管，并在250 RPM转速下于台式轨道摇床中反应30分钟。将样品管以250 ×g离心30分钟。根据所用纳米颗粒的性质，可调整离心速度和时间，以确保纳米颗粒在离心管中充分沉淀压实。离心完成后，使用0.45微米注射器滤器过滤上清液。滤过后的样品送至进行元素分析。为配制细胞培养基，首先使用实验室的反渗透（RO）水。

这些包括100%、75%、50%和25%未经处理的PBW或经CIC氧化物纳米颗粒处理的PBW；接下来，将25毫升浓缩的10倍X-E-M-E-M加入190毫升的ro中，以及每种经处理和未经处理的PBW浓度中。用氢氧化钠或盐酸将每种溶液的pH值调节至7.4。

然后，根据文本方案中列出的标准组分，向未经处理和经处理的 PBW 加培养基的各浓度组以及 RO 对照培养基中补充添加。在配制完未经处理组、未经处理的 PBW 加培养基各浓度组以及 RO 对照水加培养基后，调节各溶液的渗透压。取每种溶液一滴，滴加到无溶质的滤纸片上，将滤纸片放入蒸汽压渗透压计中。

然后通过添加反渗透水将渗透压调节至每千克290至310毫渗透摩尔。最后，使用0.22微米真空滤器对每种溶液进行过滤，并在4摄氏度下保存。在人胚胎肾细胞和人肝细胞癌细胞接种前两到三天进行培养准备。

在96孔板中，按照生产商说明书操作，在将细胞从培养皿中取出后，使用胰蛋白酶以1000 × g离心5分钟，弃去胰蛋白酶。加入5毫升磷酸盐缓冲液（PBS），混匀细胞以获得单细胞悬液。

然后取20微升单细胞溶液加入血细胞计数板，离心后测定每毫升溶液中的细胞数量。随后，与之前步骤相同，倾去上清液，并用适量的1×E-M-E-M培养基重悬细胞，将细胞浓度调整至每100微升溶液含500个细胞，每孔加入该细胞悬液。接下来，向培养板周边各孔加入200微升PBS，以控制蒸发效应。

以每孔500个细胞的密度接种，除边缘孔外，每孔加入100 µL。在37°C下培养细胞24小时，使其在进行基线MTT细胞密度检测前恢复生长。

通过移除第一列的接种培养基并每孔加入100微升MTT溶液，孵育1小时，以进行细胞密度的基线MTT检测。1小时后，移除MTT溶液，每孔加入100微升二甲基亚砜，以溶解活细胞产生的MTT甲臜沉淀。

然后在570纳米的吸收波长下测定第一列的光密度。为获得基线读数，每块板加入一种溶液。将接种用培养基更换为100 µL的X-E-M-E-M RO对照培养基，以及每种经处理和未处理的PPW加培养基的不同浓度溶液。

将细胞在各自的测试浓度或对照溶液中孵育，总共七天，每天一次。在完成初始 MTT 读数后，从相应培养板的下一列中移除对照和测试溶液，并重复 MTT 操作步骤。每天重复该操作，持续七天，取平均值。

将每个时间点的OD结果按行记录，并以时间为横轴绘制七天的生长曲线，以评估铜螯合对细胞活力及氧化铜的影响。经纳米颗粒处理的PBW加培养基采用相同步骤，但在加入各对应培养板前，需在对照组和实验组溶液中加入100 µmol/L的D-青霉素。最后一步，使用科学绘图软件进行数据分析，结果显示氧化铜纳米颗粒处理去除了PBW中的砷、硒、铀和钒等元素形态。

建模结果支持分析结果，表明在PBW中，99%的砷、94%的硒和99%的钒以带负电荷的形态存在，能够吸附到氧化铜纳米颗粒上。然而，仅有35.5%的溶解态铀物种带负电荷，这会限制铀向氧化铜的吸附。在未处理的PBW加培养基中培养的细胞，其纳米颗粒活性以浓度依赖的方式受到抑制；而氧化铜纳米颗粒处理则在两种细胞系中均提高了细胞活性。

在对照培养基中培养第五天的Heck和肝细胞显示出融合良好、贴壁紧密且形态健康的细胞。相反，在未处理的PBW加培养基中培养的Heck和细胞融合度较低，出现脱落现象，细胞呈圆形或状态不健康。

此外，heck 细胞在五氧化二磷中培养。与未经处理的 PBW 加培养基中培养的细胞相比，经纳米颗粒处理的 PBW 加培养基显示出更高的汇合度、更好的贴附性以及更佳的细胞状态。通过该方法，还可采用其他毒性检测手段，例如流式细胞术，以进一步探究处理前后混合物在作用机制变化和细胞毒性方面的相关问题。

观看本视频后，您应能充分了解如何测试铜离子及纳米颗粒在去除水中污染物方面的有效性，以及其对细胞培养的影响。然而，重要的是要记住，需监测处理后水中的铜浓度。