Name: 鼠标颈淋巴结高频超声成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学习使用高频超声成像技术对小鼠颈淋巴结进行可视化成像和形态学定量分析，并结合影像引导进行精准穿刺活检。该方法适用于肿瘤、感染及自身免疫疾病等多种疾病模型的纵向监测研究。

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本研究得到了西弗吉尼亚大学玛丽·巴布·伦道夫癌症中心的多萝西·D·拉德福德捐赠基金的支持。&#160; 作者对使用西弗吉尼亚大学动物模型与成像设施（AMIF）以及显微成像设施（MIF）（由玛丽·巴布·伦道夫癌症中心及美国国立卫生研究院资助项目 P20 RR16440、P30 RR032138/GM103488 和 S10 RR026378 支持）表示衷心感谢。

本方案中展示的所有动物实验程序均已通过西弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会在协议编号11-0412和14-0514下的审查与批准，并依照《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》中规定的原则和程序进行。
1. 动物准备
<ol>
	<li>将一只小鼠置于诱导室中，使用3%异氟烷与1.5 L/min的100%氧气混合气体进行麻醉。将动物从诱导室中取出，仰卧位放置于预热至40 °C并维持在37–42 °C之间的成像平台（图2A）。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉状态。</li>
	<li>将小鼠鼻部置于连接麻醉系统的鼻罩内，持续给予麻醉气体以维持稳定麻醉状态（1.5%异氟烷与1.5 L/min的100%氧气混合）。</li>
	<li>在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂以防角膜干燥。在电极上涂抹导电胶，并用胶带将四只爪子分别固定至对应的电极上。电极垫将传输动物的心电图（ECG）信号至成像系统，用于监测心率和呼吸频率。涂抹润滑剂后插入直肠温度探头，以持续监测体温。正常小鼠体温为36.9 °C，麻醉期间体温波动1–2 °C属正常现象。</li>
	<li>使用脱毛膏去除小鼠颈部的毛发。用浸水纱布清洗颈部区域，以清除残留毛发和多余脱毛膏。如有需要，可再次涂抹脱毛膏以去除任何残留体毛（图2B）。</li>
</ol>
2. 使用高频超声成像识别和获取小鼠颈部淋巴结图像
<ol>
	<li>首先，在无毛发的颈部区域涂抹一层温热的超声耦合剂。为获得最佳图像质量，应足量使用耦合剂（图 2C）。涂抹过程中避免引入气泡，以免干扰超声成像。</li>
	<li>将成像平台调整至 20–30° 倾斜，使小鼠头部略抬高。此体位有助于维持小鼠最佳呼吸频率。将 40 MHz 探头横向置于支架系统中，并缓慢下放，直至探头扫描面前端完全浸入超声耦合剂中（图 2C）。 
	注意：切勿对小鼠颈部施加过大压力，以免引起不必要的呼吸困难。此外，探头与小鼠之间保留一层耦合剂缓冲层，有助于成像。</li>
</ol>
B型超声成像与淋巴结检测：
<ol start="3">
	<li>使用控制高频超声（HFUS）图像采集软件的计算机，将亮度（B模式）设置调整为以下参数：增益 22 dB，深度 10.00 mm，宽度 14.08 mm。 
	注意：这些参数为建议的起始设置，不同应用之间可能需要进行轻微调整以获得最佳图像采集效果。正常颈部淋巴结在图像中表现为位于皮肤表面附近、周围为高回声区域内的椭圆形低回声结构。病变淋巴结的形态在不同模型中可能有所差异。为系统性地成像颈部区域内的所有淋巴结，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>使用 Y 轴从颅侧向尾侧扫描颈部，直至胸腔区域；使用 X 轴使图像居中。</li>
		<li>识别主要解剖标志：口腔、舌和甲状腺（图 3A、B 和 C，分别对应）；倾斜成像平台，水平调整小鼠颈部腹侧，使 B 模式图像中颈部两侧对称。倾斜程度取决于每只小鼠的个体生理结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对从口腔/舌区至甲状腺的整个颈部区域进行三维（3D）扫描，以绘制颈部区域内淋巴结及相关解剖标志的分布图。
	<ol>
		<li>定位舌/口腔区域（图 3A），并记录 Y 轴上的数值位置。</li>
		<li>定位甲状腺（图 3C），并记录 Y 轴上的数值位置。</li>
		<li>计算步骤 (2.4.1) 和 (2.4.2) 所得数值之间的差值，以确定成像颈部区域的总长度（mm）。</li>
		<li>使用 Y 轴调节旋钮，将探头居中对准该总长度的中点。</li>
		<li>按下“3D”按钮，输入总长度；3D 步长设置为 0.076 mm，以采集覆盖整个颈部区域的图像序列堆栈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描完成后，选择颈部右侧或左侧，将探头对准感兴趣的单个淋巴结并居中，然后将 40 MHz 探头从小鼠体表抬起。取下 40 MHz 探头，更换为 50 MHz 微扫描探头（同样保持横向位置），以获取更高分辨率的图像。在小鼠颈部重新涂抹超声耦合剂，并将 50 MHz 探头浸入耦合剂中。</li>
</ol>
三维能量多普勒成像
<ol start="6">
	<li>采用能量多普勒进行三维扫描，以评估单个颈部淋巴结的体积和血管情况，步骤如下：
	<ol>
		<li>按下系统键盘上的“Power”按钮以获取能量多普勒图像，并调整以下能量模式参数：PRF 4 KHz，多普勒增益 34 dB，2D 增益 30 dB，深度 5.00 mm，宽度 4.73 mm。注：与之前相同，这些参数为建议的起始设置，可根据不同模型的需要进行调整，以获得最佳图像采集效果。</li>
		<li>找到目标淋巴结最头侧的点，并在 Y 轴刻度上记录其位置。</li>
		<li>找到同一淋巴结最尾侧的点，并在 Y 轴刻度上记录其位置。</li>
		<li>计算两点之间的距离差，以确定淋巴结的总长度（参见步骤 2.4.3）。</li>
		<li>将探头中心对准所确定总长度的中点位置，参考 Y 轴刻度进行定位。</li>
		<li>按下“3D”按钮并输入淋巴结的总长度，步长设为 0.051 mm。 
		注：由于探头靠近胸部区域，50 MHz 探头可能会因检测到正常的呼吸运动而导致多普勒图像不稳定。可通过“Physiological”选项卡下的“Respiration Gating”功能消除此干扰。</li>
		<li>用黄色框圈选目标淋巴结，该框将定义能量多普勒分析的区域，然后选择“3D scan”以采集图像。将探头从小鼠体表抬起，移动至颈部对侧，再将探头放回小鼠体表，重复上述步骤以获取颈部另一侧淋巴结的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存图像数据集以供后续分析。</li>
</ol>
3. 颈部淋巴结活检
<ol>
	<li>选择目标淋巴结进行活检，并使用50 MHz换能器维持高频超声（HFUS）成像。在小鼠颈部每侧选择可见的最大颈淋巴结。淋巴结肿大通常提示存在炎症反应，因此这类淋巴结是活检的理想候选。 
	注意：我们发现对直径小于10 mm的宫颈淋巴结进行活检非常困难3.</li>
	<li>将连接有27 G、0.5英寸针头的1 ml注射器放入注射器架中，以准备活检用的针头和注射器。调整针头架，使针头与小鼠颈部呈90°角图4A).</li>
	<li>通过将整个小鼠平台抬升至与针头齐平的高度来准备。可通过移除三维电机并更换为较高的平台，或在提供的较短平台下方放置适当高度的固体物体来实现。可使用塑料微量离心管架达到此目的。如有必要，将平台旋转180°，以便对位于针头装置对侧颈部的淋巴结进行活检。</li>
	<li>调整采集设置，选择“Preferences”，然后选择“Max” &amp;#38; 扩展缓冲液”。将视野范围调整至深度8.00 mm、宽度9.73 mm。使用屏幕按键旋钮开启针导引功能。针导引将在屏幕上预示穿刺针的行进路径，并帮助操作者将目标淋巴结准确定位于活检所需位置。</li>
	<li>确保淋巴结始终处于视野中，将淋巴结置于屏幕中央或稍偏左的位置图4B在开始活检前，按下系统键盘上的Pre-trigger键，以获取整个手术过程的动态影像序列。</li>
	<li>调整持针器，直至针尖进入视野并接触皮肤（图4B）。用力快速推进针头以刺穿皮肤。继续推进针头，直至针尖刺穿囊膜（图4C）并在髓质内可见（图 4D).</li>
	<li>一旦针头准确位于淋巴结内，轻轻回拉注射器活塞至200-300 µl 刻度之间，以完成活检（图 4D 和 4E）。请注意，活检组织通常在注射器内不可见。</li>
	<li>轻轻将针头从鼠颈部拔出，将注射器内容物排入一个1.5 ml微量离心管中。取下注射器上的针头，使其留在管内。用同一支注射器吸取1 ml活检培养基（来自与储备液分开的分装 aliquot），然后在保持针头留在管内的条件下，将针头重新安装回注射器上。
	<ol>
		<li>用活检培养基冲洗注射器和针头，并将活检培养基排入试管中。 
		注意：活检后，针头连接的任何阶段均不得回抽针栓。由于样本量较小，回抽可能增加丢失活检组织的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过组织学方法确认淋巴结内容物图4F）并使用其他方法进行分析（组织化学、流式细胞术， 等等。视情况而定。</li>
	<li>活检完成后，关闭麻醉装置并拔出直肠温度探针。用纱布擦去小鼠身上多余的超声耦合剂，并取下每只脚掌上的胶带。</li>
	<li>将小鼠从成像平台移除并放回笼中。活检部位可能出现轻微出血，但无需干预即可自行停止。在恢复期间监测小鼠，直至其完全恢复活动。</li>
</ol>
4. 颈部淋巴结的影像分析
<ol>
	<li>在超声软件中，选择用于分析的图像，进入“图像处理”选项卡，选择“加载到3D”。</li>
	<li>在左上角选择“3D重建图像”，点击“单窗格显示”按钮。可根据需要使用缩放功能放大图像。切换“显示布局”以仅在B模式下查看图像，从而移除血流能量多普勒叠加显示。这有助于在后续的三维分析过程中更清晰地观察淋巴结的边缘。滚动图像序列以定位淋巴结的起始位置。</li>
	<li>为勾画淋巴结边界，进入“3D设置”选项卡，选择“体积”，然后点击“平行”旁边的“开始”按钮。</li>
	<li>通过滚动图像，在各单幅图像中对感兴趣区域进行轮廓勾画。持续操作，直至覆盖整个淋巴结的图像均被标记。选择“完成”以结束分析。</li>
	<li>在图像底部，将自动显示三维体积和血管化百分比。 
	注意：三维体积对应淋巴结体积，血管化百分比表示通过能量多普勒检测到血流信号的淋巴结区域所占的百分比。</li>
	<li>切换“显示布局”以将能量多普勒成像作为叠加层显示在B模式图像上。在表面视图中可观察到感兴趣体积区域的网状视图。将图像导出为标记图像文件格式（TIF）或以视频（.avi）格式导出三维扫描图像，以便进一步使用。</li>
</ol>

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</ol>

本文的出版费用由 Visual Sonics 赞助。

本方案描述了利用无创高频超声（HFUS）成像技术对小鼠颈部淋巴结进行可视化及原位评估的方法。通过B型超声和能量多普勒成像观察颈部淋巴结的形态、体积及血流情况，可实现对临床前小鼠模型系统的实验分析，其分析方式类似于临床实践中对患者颈部淋巴结的表征评估。此外，通过细针穿刺活检监测颈部淋巴结的能力，为检测小鼠口腔疾病诱导的淋巴结病变过程中免疫细胞变化以及外来细胞类型或细菌的存在提供了有效技术手段。由于高频超声操作简便且成本较低，可在多种动物模型中快速筛查颈部淋巴结状态。
本方案中的一个关键步骤是在高频超声（HFUS）图像中成功识别颈部淋巴结。本机构配备了多种如前所述的HFUS探头，因此我们使用这些探头以获得最高质量的图像。然而，如果文中所述探头不可用，也可使用其他探头进行成像调整。&#160; 为此，只需调节图像的深度和宽度以获得合适的图像即可。尽管图像分辨率可能有所差异，但仍可通过HFUS获得高质量图像。口腔和甲状腺的成像解剖标志将极大帮助操作者定位淋巴结所在的正确区域。颈部淋巴结具有典型的椭圆形、低回声特征，并且位置表浅、紧邻皮肤表面，这些特点有助于在颈部正确区域快速确认其身份。虽然三个淋巴结有时可在同一成像平面上显示（图3B），但通常成像过程中仅能捕捉到一个或两个淋巴结。通过轻微调整探头位置，可以获得不同的成像切面，从而实现对颈部单侧所有淋巴结的可视化观察。
尽管我们发现所描述的技术在识别小鼠颈部淋巴结方面具有可靠性，但该成像与活检技术仍存在特定的局限性。由于小鼠颈部淋巴结位置表浅，在使用探头对皮肤施加轻微压力时，会导致淋巴结过度移动。&#160; 这可以通过缓慢将换能器探头压入小鼠颈部的超声耦合凝胶中来抵消，直至识别到标志性的图像。淋巴结的移动性也可能使细针穿刺活检变得复杂，尤其是在使用高分辨率（50 MHz）范围的换能器时。用于活检的淋巴结居中图像通常会因穿刺针穿透表层皮肤和包膜所需施加的力而被推出视野。这一问题可通过将淋巴结偏离中心地置于穿刺针进入方向的一侧来解决，从而为淋巴结在穿刺过程中向对侧移动预留空间，同时仍保持其位于视野内。根据我们的经验，淋巴结 &#62;10 mm3 很难进行活检，在穿刺针前进过程中常常被针推挤而非穿透。因此，活检最好用于肿大的淋巴结，其大小足以 &#62;10 mm3 以确保颈部区域淋巴结靶区的足够大小和稳定性。此外，活检样本可能无法提供足量的细胞，以满足需要较大量细胞的实验操作要求（例如，流式细胞术。 &#160;
高频超声（HFUS）已成功用于可视化原位头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤25，并具有在口腔肿瘤小鼠模型中监测颈部淋巴结转移的潜力24。除了超声成像外，生物发光成像也被用于在活体小鼠中观察原位口腔肿瘤的形成及颈部淋巴结转移26,27。作为一种替代方法，生物发光成像相较于HFUS具有明显优势，能够对同一只动物在不同时间点的肿瘤进展和转移负荷进行直接定量分析。尽管生物发光成像无疑具有实用价值，但它无法测量HFUS所能观察到的许多参数，包括淋巴结形态、淋巴结体积或血流情况。此外，生物发光成像需要使用专用的暗箱来维持成像过程中的小鼠环境，这使得该技术难以适用于细针穿刺活检的整合应用。
此外，生物发光成像需要制备稳定表达荧光素酶的肿瘤细胞，因此该技术仅适用于在免疫缺陷小鼠中接种表达荧光素酶的肿瘤细胞所建立的原位异种移植模型，或依赖于可诱导的组织特异性转基因系统以限制荧光素酶表达的情况。&#160; 在&#160; a&#160; 时空&#160; 方式&#160; 特异性针对肿瘤来源组织。相比之下，高频超声（HFUS）可与这些模型中的生物发光成像联合使用，同时也能够对宫颈进行成像&#160; 具有完整免疫系统的小鼠中致癌物诱导的口腔肿瘤模型的淋巴结28,29尽管高频超声（HFUS）可能更适用于大多数口腔癌小鼠模型，但在肿瘤细胞表达荧光素酶的系统中，生物发光成像与高频超声成像相结合所提供的综合信息，能够比单一成像方式更全面地揭示颈部淋巴结的受累情况。
实时识别和检测小鼠颈部淋巴结的能力使得该技术可用于大多数导致炎性淋巴结病的口腔疾病模型，其中动物可在短期麻醉下保持倒置体位。在活体动物中检测淋巴结转移或细菌感染及其对淋巴结形态的伴随影响，相较于传统方法（需将死亡动物的淋巴结取出进行组织学处理）具有显著优势。将高频超声（HFUS）与细针穿刺活检相结合，可实现对颈部淋巴结进行常规病理学分析，类似于临床操作，从而为当前大多数小鼠口腔疾病模型中的疾病进展监测提供了更优方法。

口腔和颌面部区域的感染性微生物和癌症主要通过间质组织液的淋巴引流进行播散1,2。临床评估颈淋巴结是判断起源于口腔疾病的是否存在或进展的常用诊断方法。这凸显了收集颈淋巴结作为口腔疾病诊断重要解剖部位的价值3。目前临床上有多种专门的影像学方法用于识别病变的颈淋巴结，包括正电子发射断层扫描（PET）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MR）。尽管这些方法具有很高的应用价值，但均需要复杂的患者准备、高度专业化的设备和/或向循环系统注入化学物质，以实现或增强成像效果。
超声成像（超声；US）是一种常用的技术，用于对因感染或转移性病变导致淋巴结肿大的颈部淋巴结进行成像4-6。超声常与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET-CT）及磁共振成像（MR）联合使用，以全面评估患者的淋巴结状况，有助于确定肿瘤分期及是否需要手术切除7。超声的非侵入性特性相较于其他影像学方法具有固有优势，包括操作简便、成本低、患者不适感轻微且无需特殊准备。大多数颈部淋巴结位于浅表皮下位置，使得超声能够更精确地引导微创细针穿刺活检，从而提高诊断准确性8。
商用高频超声（HF US）可提供内部解剖结构的精细分辨率，达到30 µm9使用频率范围为22-70 MHz的换能器，高频超声（HFUS）已广泛应用于多种实验性啮齿类动物模型，以实现体内器官的实时成像。&#160; 高频超声（HFUS）已应用于可视化观察常规亮度（B）模式下的肿瘤形成，以及结合多种通用和专用的对比增强剂进行成像9。在HFUS中使用能量多普勒技术可实现对小鼠肿瘤内血流的监测，从而在活体小鼠中全面评估血管生成相关的灌注情况。10,11高频超声（HFUS）已被用于可视化位于体腔内的患病小鼠淋巴结，展示了该技术在临床实践中的并行应用价值。特别是在乳腺癌小鼠模型中，已观察到炎性及转移性内脏淋巴结的改变12,13，胰腺14结直肠15 和肺16 肿瘤以及纤维组织细胞瘤17以及获得性肾积水的衰老小鼠模型18这些实例进一步证实了高频超声（HFUS）作为一种强大研究工具，在多种啮齿类动物系统中用于肿瘤诱导的淋巴结病变研究的价值。 &#160;
多种细菌感染模型19,20 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）21,22 已开发出用于在临床前研究中探讨这些疾病的模型。与人类不同，小鼠具有三个颈淋巴结，负责收集来自口腔组织的淋巴液（下颌、下颌下和浅表腮腺淋巴结）23）。最近，我们报道了利用高频超声（HFUS）来定位这些淋巴结并绘制其形态，进行监测&#160; 淋巴变化&#160; HNSCC致癌物诱导小鼠模型中的淋巴结体积与血流24在此，我们提供了一种使用高频超声（HFUS）在活体小鼠中识别、成像和分析颈部淋巴结的详细实验方案。本方案还展示了利用HFUS进行图像引导下细针穿刺活检小鼠肿大颈部淋巴结的可行性，从而实现对同一动物个体随时间推移的颈部淋巴结内容物变化及病理状况的组织学监测。该方案可便捷地适用于研究由任何小鼠口腔腔隙侵入性病变所导致的颈部淋巴结病理改变。

<table><tbody><tr><td>Vevo2100 高分辨率微型超声成像系统，配备集成软件版本 1.6.0</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td>VS-11945</td><td></td></tr><tr><td>功率多普勒模式和 3D 模式</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td>VS-11952; VS-11484</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 麻醉紧凑型系统</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 集成导轨系统，包含用于注射的 3D 电机和显微操作器</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td>SA-11983</td><td></td></tr><tr><td>Thermasonic 凝胶加热器</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td></td><td>可选</td></tr><tr><td>探头 &amp;ndash; MS-550D（宽带频率：22 MHz - 55 MHz）</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td>VS-11960</td><td>称为 40 MHz 探头</td></tr><tr><td>探头 &amp;ndash; MS-700（宽带频率：30 MHz - 70 MHz）</td><td>VisualSonics, 多伦多, 安大略省, 加拿大</td><td>VS-12026</td><td>称为 50 MHz 探头</td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-1663</td><td></td></tr><tr><td>电极凝胶</td><td>Parker Laboratories</td><td>174-1525</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Medical Arts Press</td><td>174-153000</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Carter Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>通用供应品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-907</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>通用供应品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>润滑凝胶</td><td>Parker Laboratories</td><td>57-05</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>Parker Laboratories</td><td>01-50</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管架</td><td>通用供应品</td><td></td><td>用于抬高小鼠平台以获得最佳活检位置</td></tr><tr><td>27 G &amp;frac12; 英寸针头配 1 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>ThinPrep PreservCyt 溶液</td><td>Hologic</td><td>70097-002</td><td>称为活检介质</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>通用供应品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThinPrep 2000 处理仪</td><td>Cytyc, 马尔伯勒, 马萨诸塞州, 美国</td><td></td><td>蓝色滤膜</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Provis 显微镜</td><td>Olympus, 中心谷, 宾夕法尼亚州, 美国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠颈部淋巴结的高频超声成像

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

高频超声（HFUS）作为一种非侵入性方法，被广泛用于实验性小型动物系统中内部解剖结构的成像。HFUS能够检测小至30 µm的结构，这一特性已被用于在亮度（B）模式下对啮齿类动物的浅表淋巴结进行可视化观察。将能量多普勒与B模式成像相结合，可实现对淋巴结及其他器官内循环血流的测量。尽管HFUS已在多种小鼠&#160;模型系统中用于淋巴结成像，但目前尚未见详细描述小鼠颈淋巴结HFUS成像及特征分析的实验方案。本文中，我们证明HFUS可被优化用于小鼠颈淋巴结的检测与表征。结合B模式与能量多普勒成像可用于检测免疫性肿大的颈淋巴结中血流的增加。我们还介绍了利用B模式成像引导对颈淋巴结进行细针穿刺活检，以获取淋巴组织用于组织学&#160;分析的方法。最后，本文描述了借助软件辅助的步骤，用于在图像重建后计算淋巴结体积的变化，并可视化淋巴结形态的改变。对颈淋巴结生物学变化进行长期可视化监测的能力，为口腔疾病临床前小鼠模型中颈淋巴结改变的非侵入性监测提供了一种简便而强大的技术手段。

成像和活检操作的整体示意图见图1。该操作的关键步骤包括：正确准备用于成像的小鼠，识别颈部淋巴结，正确准备并实施穿刺活检，以及利用计算机软件分析B型和多普勒图像，以测量每个选定淋巴结的体积及其内部血管化程度。
对小鼠颈部淋巴结进行高频超声（HFUS）成像时，需在整个成像过程中实施并维持适当的麻醉（图2A），同时彻底清除覆盖整个颈部区域的毛发（图2B）。在脱毛区域充分涂抹超声耦合剂，可确保操作过程中获得清晰的HFUS信号（图2C）。
颈部区域的高频超声成像可通过识别产生特征性超声图像的颈部解剖标志来辅助完成。图3展示了主要器官的示例（图3A-C）、B模式下的颈部淋巴结（图3D）以及能量多普勒模式下的颈部淋巴结（图3E）。
在麻醉小鼠中进行实时高频超声（HFUS）成像，可实现对颈部淋巴结的引导式细针穿刺活检，类似于临床实践中的操作。图中展示了将活检针及其连接的收集注射器安装至控制微注射仪设备的过程。 图 4A后续B型超声图像显示活检前针头位置理想（图4B），针尖进入颈部淋巴结（图 4C），以及活检过程中的穿刺针位置（图4D）。特写图像显示针尖位于淋巴结髓质内（图4E）。通过细胞离心法处理活检样本组分，可见大量淋巴样细胞簇及相关的结缔组织，证实淋巴结活检成功。图4F).
基于计算的高频超声（HFUS）图像分析可获取有关淋巴结结构、体积和血管血流的详细信息。通过使用能量多普勒模式和三维体积测量，可从包含整个淋巴结的图像序列中计算血管百分比（PV）（图5A）。此外，三维成像可实现淋巴结的虚拟重建，揭示淋巴结的整体拓扑结构（图5B）。
<img alt="小鼠超声成像、活检及分析工作流程图；包含兆赫频率和活检装置示意图。" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1： 小鼠诊断性高频超声（HFUS）颈部淋巴结成像步骤的概略示意图。 主要步骤包括：1：准备小鼠以进行高频超声成像，并获取包含三个小鼠颈部淋巴结的颈部区域的40 MHz和50 MHz分辨率图像。2：在超声引导下对颈部淋巴结进行细针穿刺活检，并对所获取的活检组织进行后续组织学分析。3：利用计算机辅助图像分析及B模式与多普勒模式下获取的淋巴结图像进行三维重建，以测定各淋巴结体积及血流百分比（%）。
<img alt="3D imaging setup for mouse model; experimental station, multispectral analysis, imaging process." src="/files/ftp_upload/52718/52718fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 高分辨率概述 体内 用于宫颈淋巴结评估与活检的微成像系统 (AHFUS 系统正在对一只已麻醉的小鼠进行颈淋巴结成像的准备，图中还显示了微注射仪（MI）和三维电机载台（3D MS）等辅助设备。B麻醉后准备进行高频超声成像的小鼠颈部脱毛后的局部特写。 (C同一小鼠，颈部放置50 MHz换能器。注意使用了额外的超声耦合剂以利于颈部区域成像。
<img alt="超声示意图：口腔、舌、下颌腺、甲状腺、腮腺，标注的结构。" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3： B模式和能量多普勒模式下具有代表性的高频超声（HFUS）颈部解剖图像。(A, B) 口腔的B模式图像，显示靠近鼻腔成像时可见的口腔（BC）和舌（T）。在颈部每侧可发现三个颈淋巴结（标注为M，下颌下；SM，下颌下；SP，浅表腮腺），在单个成像平面中表现为一组低回声结构，如图(B)所示。(C) 上胸部区域所见的甲状腺（Th），呈实性、回声较强的蝴蝶状结构。(A–C) 使用40 MHz探头成像；比例尺 = 1 mm。(D, E) 正常（D）与肿大（E）颈淋巴结的代表性B模式和能量多普勒（红色）图像。虚线勾勒出各个淋巴结的边界。比例尺 = 0.5 mm。
<img alt="超声引导下活检装置设置与操作；穿刺针插入及细胞学中的细胞分析。" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4： 小鼠颈部淋巴结活检装置设置、成像及活检样本的细胞离心分析。 （A）成像平台示意图，显示微型注射器及穿刺针在小鼠颈部附近的放置位置。使用一个宽型微量离心管架（橙色块）轻微抬高平台，可在确保穿刺针正确定位的同时，仍为三维电机平台留出足够空间。此设置可最大限度减少每次更换小鼠时拆卸电机平台所需的时间。（B–D）使用50 MHz探头进行颈部淋巴结活检时，从视频中截取的完整颈部高频超声（HFUS）图像。（B）HFUS B模式图像，显示活检前穿刺针位于颈部侧方。针尖为紧邻穿刺引导线（绿色虚线）下方的强回声结构，该引导线为成像过程中叠加的标记，用于指示穿刺路径。淋巴结位于图像中央。比例尺 = 1 mm。（C）穿刺针进入淋巴结。（D）颈部淋巴结活检过程。（E）颈部淋巴结活检区域的放大图像。比例尺 = 0.5 mm。（F）代表性淋巴结活检样本的细胞离心分析结果，证实活检成功。比例尺 = 100 µm。
<img alt="超声成像分析，三维体积测量，Vevo 2100 系统，医学影像研究。" src="/files/ftp_upload/52718/52718fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5： 三维宫颈淋巴结图像的计算机分析。 （A）使用计算机软件分析的淋巴结代表性截图。淋巴结以蓝色轮廓标出；分析结果如图所示，包括三维体积和血管百分比（PV）。 （B）同一淋巴结经三维分析后的表面视图图像。基于 A 中的测量结果，呈现淋巴结的完整体积。

本方案描述了高频超声（HFUS）在小鼠颈部淋巴结成像中的应用。该技术可优化颈部淋巴结形态、体积及血流的可视化与定量分析。同时展示了在影像引导下对颈部淋巴结进行活检，以及对淋巴组织进行处理以供组织学评估的方法。

高频超声（HFUS）被广泛用作一种非侵入性方法，用于实验性小型动物体内解剖结构的成像……

本实验的总体目标是利用高频超声成像技术观察小鼠颈部淋巴结，并通过影像引导的超声方法进行淋巴结活检。首先，将麻醉后的小鼠仰卧置于加热的成像平台之上，并完成所有必要的动物准备步骤以进行成像。第二步是对小鼠颈部区域进行高频超声成像，以识别并可视化颈部淋巴结。接下来，对目标颈淋巴结进行影像引导下的活检。最终，采用高频超声成像分析小鼠颈淋巴结，并通过多种小鼠模型的纵向监测，识别和量化正常与病理变化。该方法的可视化演示至关重要，因为小鼠的摆放和活检步骤需要相当程度的细节把握和精确操作才能顺利完成。我们最初在使用高频超声监测小鼠舌部肿瘤形成时，萌生了这一方法的想法。随后意识到该方法可轻松地被改进，用于同时监测相关颈部淋巴结的变化。尽管该方法能够为小鼠颈部淋巴结的癌症相关改变提供深入见解。它还可用于在其他小鼠模型系统（如细菌感染或自身免疫性疾病）中监测颈部淋巴结肿大。实验前，将成像平台预热至 40 摄氏度，并计划将其温度维持在几度范围内。麻醉小鼠后，将其仰卧位放置于成像平台上。接下来，安装鼻锥以维持稳定的麻醉状态。然后通过脚趾夹捏法确认麻醉效果，并在眼睛上涂抹眼用软膏。接着使用胶带和导电凝胶将足掌固定到心电图仪上。下一步是插入润滑过的直肠温度探头，以维持小鼠体温在36.9摄氏度的两度范围内。最后，使用脱毛膏去除颈部及其他部位的毛发。用浸水的纱布将脱毛膏和毛发冲洗干净。首先，在颈部区域大量涂抹温热的超声耦合剂，以消除毛发干扰。切勿在耦合剂中引入气泡。我们发现，充分涂抹超声耦合剂可防止探头牵拉皮肤，从而提升成像质量。接下来调整成像平台的角度，略微抬高小鼠头部，以改善小鼠的呼吸频率。然后将40兆赫兹换能器横向置于安装系统中，并小心下放，直至扫描头前端进入凝胶中。切勿施加过大压力，以免影响小鼠呼吸，应通过软件控制进行调节。按如下方式调整亮度模式设置：将增益设为 22 分贝，将深度设为 10.00 毫米，将宽度设为 14.08 毫米。这将作为起始点。调整成像平台的倾斜角度，使B模式图像中颈部两侧看起来对称。接下来，为了成像淋巴结，使用Y轴从颅侧向胸侧方向扫描颈部。使用 x 轴来居中图像。识别主要解剖标志，如口腔腔、舌和甲状腺。接下来，从甲状腺到口腔腔舌区域，利用整个颈部区域的三维皮肤来定位淋巴结。沿 Y 轴方向。注意观察舌、颊腔和甲状腺的数值位置，通过计算其差值来确定颈部长度。然后将探头置于计算所得的颈部中点位置。居中后，按下 3D 并输入计算得到的颈部长度作为扫描距离。将 3D 步长设置为 0.076 毫米。然后按下扫描以获取整个颈部区域的图像序列堆栈。为了抬高小鼠，可使用较高的平台，或用塑料微量离心管架垫高平台。活检时，首先选择体积最大的可见淋巴结，并用50兆赫的换能器持续获取该淋巴结的高频率超声图像。所选淋巴结应大于10立方毫米，否则活检将难以实施或成形。接下来，将一个1毫升注射器连接至27号半英寸针头上，并将其放入注射器架中。将针头垂直于颈部方向放置，然后按照文本方案调整活检图像。接下来，调节针头夹持器，直到针尖进入视野并接触皮肤。随后以稳固快速的推进动作刺穿皮肤，继续推进针头，直至针尖同时刺穿包膜并在活检过程中可见于髓质内。为刺穿皮肤，需迅速推进针头，随后稍作停顿，再进行第二次快速推进以刺破淋巴结包膜。针头进入淋巴结后，轻柔回抽注射器活塞至 200 至 300 微升刻度之间。活检组织通常会留在针头内，因此在注射器中不可见。然后轻轻将针头从小鼠体内取出，并将内容物排入一个1.5毫升的微量离心管中。取下注射器上的针头，也将其放入该管中。然后将一毫升活检培养基加入注射器中。操作完成后，重新装上针头，并将活检组织排入试管中。务必在超声软件中持续监测小鼠，直至其完全恢复活动。选择要分析的图像，并通过选择“载入3D”进入图像处理选项卡。然后在左上角选择三维重建图像，点击显示单窗格。如有需要，可使用缩放功能放大图像。然后切换显示布局按钮，以 B 模式查看图像，从而去除功率多普勒叠加视图。这有助于在后续的 3D 分析中更清晰地观察淋巴结的边缘。滚动浏览图像序列，找到淋巴结的起始位置，以圈定淋巴结范围。转到 3D 设置选项卡，选择“体积”。然后通过滚动找到“平行”旁边的开始按钮，在单个图像内围绕目标区域绘制轮廓。持续执行此操作，直至标记了足够多的图像，使整个淋巴结均被标记。然后选择“完成”以结束分析。在图像底部，将自动显示三维容积和血管化百分比。接下来，切换显示布局按钮，以查看表面的功率加倍图像叠加。观察感兴趣体积区域的网格视图。最终以TIF格式导出图像，或按照所述方案将3D扫描导出为VI视频。实时高频超声成像可实现对颈部淋巴结的引导下细针穿刺活检，其操作方式与临床实践中所采用的方法相似。BMO 超声移植物在活检前显示了理想的穿刺针位置。超声引导下穿刺针尖进入颈部淋巴结，并在活检过程中通过超声实时监控穿刺针的位置。活检组织样本采用胞嘧啶进行处理。结果显示大量淋巴样细胞簇及相关的结缔组织，证实淋巴结活检成功。通过计算机分析高频超声图像，可获取淋巴结结构体积、采用能量多普勒模式评估血流以及三维容积测量的相关信息。计算出血管化百分比。此外，掌握三维成像技术后，可实现淋巴结的虚拟重建，从而揭示淋巴结的整体拓扑结构。如果操作得当，每只小鼠完成该技术大约需要15分钟。观看本视频后，您应能够充分了解如何使用高频超声识别小鼠颈淋巴结，并掌握如何利用影像引导超声进行淋巴结活检的知识。

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小鼠颈部淋巴结的高频超声成像

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