软琼脂集落形成实验利用识别的致瘤性乳腺癌细胞抑制剂

该程序的总体目标是定量确定治疗对细胞在半固体基质中增殖能力的影响，因为增强的能力是细胞肿瘤致病性的标志，使用软琼脂测定肿瘤致病是通过细胞在半固体 AROS 凝胶内形成集落的能力来测量的。由于未转化的细胞无法在这种环境中快速增殖，因此首先通过制备 0.6%AROS 底层来构建半固体 AROS 凝胶。接下来，在底层上方添加含有 0.3% AROS 凝胶层的细胞。

在该测定中，实验细胞用 Subramanian 博士开发的肽基、精氨酸、dase 或 pad 酶抑制剂处理。每周增加一个额外的饲喂层，即 0.3%aros 凝胶，有或没有处理。最后一步是计算大于 70 微米的菌落数量以进行分析。

最终，使用倒置显微镜来显示对照组和治疗组之间菌落数的差异。嗨，我叫 Achi Huta。我是贝克动物健康研究所 Scott Kros 博士实验室的研究生。

在康奈尔大学，软老虎集落形成测定可以帮助回答癌症生物学领域的关键问题，例如评估各种癌细胞的肿瘤发生性，以及它们对药物、激素和许多其他治疗条件的敏感性。通过将 3%2 羟乙基 aros 制备到干净、干燥的 100 毫升玻璃瓶中来开始此过程。加入 0.9 克两个羟乙基 aros，然后加入 30 毫升蒸馏水。

将混合物用微波炉加热 15 秒钟，然后轻轻旋转。重复此步骤，直到 AROS 粉末完全溶解。接下来，将含有瓶子的溶液高压灭菌 15 分钟。

让 agros 溶液冷却至室温。在进一步之前，请在 37 摄氏度的培养箱中使用 Prewarm 几支 5 毫升和 10 毫升移液器，以防止 aros 在移液器中凝固。部分处理时，松开瓶盖，将预制的 3%2 羟乙基 aro 溶液微波 15 秒。

然后轻轻旋转溶液并再微波 15 秒。旋转 ARO 溶液时要小心，因为溶液暴露在空气中时会上升，如果瓶中微波炉中有残留的固体凝胶，可能会溢出。在接下来的步骤中，将装有 ARO 溶液的瓶子放在 45 摄氏度的水浴中再放置几秒钟，以防止农业溶液过早凝固。

接下来，使用 Prewarm 移液器将 12 毫升加热的培养基转移到无菌 50 毫升锥形管中。立即加入 3 毫升 3%aros 溶液，轻轻倒置锥形管，将 aros 与培养基混合。然后轻轻地将 2 毫升这种混合物加入 6 孔培养板的每个孔中，不形成任何气泡。

将六孔培养板在 4 摄氏度的平坦表面上水平孵育 1 小时，以使混合物凝固。混合物凝固后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。底层现在可以使用了。

该程序的一个困难方面是确保所有细胞均匀分布，并且熔化的 agra 壳在加入每个孔之前不会凝固，以确保在添加液体农业凝胶之前将苏打水混合在培养基中。此外，管道事先经过预热，以避免溶液在处理时凝固。要制备含有细胞的层，首先要制备胰蛋白酶眼睛 MCF 10 DCIS 细胞，并将其稀释至每毫升 40， 000 个细胞的细胞浓度，然后使用预热移液器取 8 毫升培养基并转移到无菌 50 毫升锥形管中。

立即向锥形管中加入 2 毫升 3%aros，然后轻轻倒置以将 aros 与培养基混合。避免形成任何气泡。接下来，取两毫升细胞，用 DMSO 中的两微摩尔 BB 氯胺或单独 DMSO 作为对照处理后，将细胞与 0.6%aros 以一比一稀释混合，使最终浓度为一微摩尔 BB 氯胺。

然后取 1 毫升 cell aros 混合物，轻轻加入到六孔培养板的底层。将六孔培养板水平放置在 4 摄氏度的平坦表面上至少 15 分钟，以使顶层凝固。混合物凝固后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中一周，然后添加补料层。

像以前一样用微波炉加热预制的 3%2 羟乙基 aro 溶液，并在 45 摄氏度的水浴中平衡农业溶液瓶，将 1 毫升 3% agro 溶液与 9 毫升温热培养基混合到 50 毫升锥形管中，然后轻轻倒置以将 aros 与培养基混合。避免形成气泡。用 BB 氯胺处理混合物后，将 1 毫升混合物轻轻加入包含底部和软层的 6 孔培养板的每个孔中。

然后将六孔培养板水平放置在 4 摄氏度的平坦表面上至少 15 分钟，让混合物凝固。饲养层凝固后，将板放入 37 摄氏度的培养箱中。Bader，每周重复此饲喂程序，将 1 毫升 0.3%agris 培养基处理液叠加在现有的饲养层上，以用新培养基补充细胞，直到观察到集落形成。

在软琼脂中细胞生长两周半后，计算每个孔中的菌落数。使用光学显微镜进行定量，将网格打印到透明胶片上，并将网格连接到六孔板上，以帮助在计数过程中定位细胞的位置。菌落大小由每个菌落的直径量化，并且会根据参考菌落大小而变化，以确定哪些菌落将被评分。

例如，此处的菌落大小为 70 微米或更大，包含在数据分析中。计数后，用多联体密封六孔培养板，以防止凝胶变干。将样品储存在 4 摄氏度下，以防止进一步形成菌落并用于将来计数。

结果表明，在 pad 抑制剂存在下，BB 氯胺显着抑制 MC 10 DCIS 细胞衍生集落的形成。与 DMSO 对照相比，集落形成和集落大小均有所减少。BB 氯胺处理的 MCF 10 DCIS 细胞的集落大小主要在 20 至 100 微米的范围内。

虽然 DMSO 对照的菌落大小在生长两周半后表现出 70 至 150 微米的更大范围，但对大于 70 微米的菌落进行计数和分析。DMSO 对照中平均约有 3， 500 个菌落，而在 BB 氯胺处理组中仅观察到约 2000 个菌落。经过两周半的软农业后，这表示在存在 1 微摩尔 BB 氯胺的情况下，平均菌落形成减少了 44%，表明 pad 抑制剂对乳腺癌细胞具有显着的致瘤抑制作用。

在尝试此程序时，请务必记住事先预热所有试剂和设备，以避免溶液在处理时凝固，感谢您的观看。