Name: 攀登缺陷的神经退行性疾病的果蝇模型定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 了解利用Drosophila melanogaster负趋地性实验定量分析果蝇攀爬能力的方法。该技术可检测轻度运动缺陷，用于筛选神经退行性疾病的遗传相互作用和药物靶点。

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本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）团队资助项目支持，资助对象为 Bolduc 博士（共同首席研究员）和 Guy Rouleau 博士（首席研究员）。我们感谢 Oksana Suchowersky 博士、Kathryn Todd 博士、阿尔伯塔大学果蝇研究小组成员以及 Clayton Dickson 博士在方法开发和统计分析方面提供的帮助。

关于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究符合阿尔伯塔大学的研究准则。
1. 果蝇采集
<ol>
	<li>用 CO₂ 收集 20 只果蝇2 (g) 麻醉后置于含有食物的25 mm × 95 mm收集管中。</li>
	<li>将装有果蝇的试剂瓶水平放置，以避免果蝇被困在可能积聚于瓶底的液体中。</li>
	<li>将果蝇孵育至少21小时&#160;在22 °C、45%湿度的培养箱中孵育约15小时。将培养箱设置为12小时&#160;光照：黑暗周期</li>
</ol>
2. 攀爬实验
<ol>
	<li>次日早晨，从一个试剂管中转移20只果蝇至一个250 ml的玻璃量筒中。标记量筒的位置，以确保每天保持一致。每种基因型使用单独的玻璃量筒，以防止不同基因型之间的交叉污染。每次实验结束后清洗量筒，并在不同基因型之间轮换使用。
	<ol>
		<li>在环境光（如果存在视觉缺陷的可能，则使用红光）条件下进行实验，温度和湿度分别为22 °C和40%。为避免昼夜节律的干扰，实验应在每天的同一时间进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用屏障膜（石蜡膜）密封量筒顶部，防止果蝇逃逸（图2）。</li>
	<li>将摄像机架设在三脚架上。将摄像机对焦于250 ml量筒的190 ml刻度线处（高度为17.5 cm）。</li>
	<li>统计量筒底部和食物管中死亡果蝇的数量，并将该数值记录为死亡率。</li>
	<li>用手反复轻敲量筒底部，敲击在闭孔泡沫垫上，力度应足以使果蝇移动至量筒内壁底部。敲击5–10次，同时用另一只手按下摄像机的录制按钮。</li>
	<li>按下摄像机上的“录制”按钮。</li>
	<li>启动摄像机录像，并以明显且非节律性的模式敲击量筒六次。</li>
	<li>每次试验从最后一次敲击果蝇开始计时，持续2分钟，记录在每个选定时间点（每10秒量化一次）越过17.5 cm高度（190 ml）的果蝇数量。注意：量筒上的毫升刻度会因不同型号的量筒直径不同而有所差异。为避免误差，应测量所用每个量筒的实际高度。</li>
	<li>试验结束后，将果蝇弃置于95%乙醇中处理。</li>
	<li>重复步骤2.1至2.9，直至所有重复组均完成测试，每次均使用新鲜果蝇。 
	注意：尽管对于对运动能力有显著影响的突变，5次重复可能已足够，但建议进行10次生物学重复，每次20只果蝇（共200只），以检测较小的差异。</li>
	<li>实验结束后，将量筒放入实验室洗碗机中清洗，并过夜干燥，以便重复使用。</li>
</ol>
3. 分析
<ol>
	<li>分析每只果蝇实验的视频。每隔 10 秒，记录通过目标线的果蝇总数。
	<ol>
		<li>如果某只果蝇爬回下方或掉落，将该果蝇记为 -1，并将下一只通过目标线的果蝇计数为与爬回或掉落的果蝇相同的编号。例如，如果第 15只果蝇掉落到目标线下方，则下一只通过该线的果蝇（原第 16只）应视为第 15只果蝇，而非第 16只。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从果蝇总数（20 只）中减去死亡果蝇数，得到仍参与实验的果蝇数量。在每个时间点，计算位于目标线上方的果蝇所占比例。</li>
	<li>在每个时间点绘制对应的百分比（见 图 3）。</li>
	<li>分析 120 秒时间点的表现数据，当存在两组时进行学生 t 检验，多组时则进行方差分析（ANOVA）及多重比较的后续检验（计划性比较采用 Bonferroni 校正，非计划性比较采用 Tukey 法）。同时进行 Kolmogorov-Smirnov 检验17，以评估数据正态性与方差齐性，并比较突变组与对照组的分布差异。</li>
	<li>为展示随衰老变化的数据，绘制不同日龄（2 天、1 周、2 周）果蝇在 120 秒时爬行百分比的图表，以观察是否存在进行性功能缺陷（图 4）。</li>
</ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li>
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<li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
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<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Drosophila 已被证实是研究帕金森病14及其他神经退行性疾病1,2的优秀模型。除了在 Drosophila 中可用的遗传工具外，其基因组中与神经系统疾病相关的基因具有高度保守性19。全基因组遗传筛选技术（包括全外显子组测序）的发展有望持续提供更多与人类运动障碍相关的候选基因。针对这些疾病的治疗开发需要借助动物模型，以加深我们对神经退行早期病理过程的理解。利用 Drosophila 及负向趋地性实验，可提供一种经济且可靠的方法，用于鉴定与运动功能缺陷相关的基因，并进一步筛选可挽救表型的候选药物。这还可结合在同一动物模型中获得的分子、电生理和成像证据。已有研究通过攀爬实验成功再现了运动基因突变导致人类运动障碍的果蝇模型中的运动缺陷。然而，先前的研究表明，病理变化可能早于运动缺陷的检测达数天之久14。这一现象在人类神经退行性疾病中同样存在，即所谓的亚临床改变。我们认为，通过理解并干预这些亚临床改变，将极大改善对疾病的修饰治疗效果。
我们在此...

帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫等破坏性神经退行性疾病正日益受到关注。遗憾的是，目前大多数神经退行性疾病仍缺乏有效治疗手段。全外显子组测序等全基因组范围、无偏倚的遗传检测在临床上的广泛应用，已导致越来越多与人类运动障碍相关的基因被发现。尽管取得了这些进展，这些疾病从早期到晚期的病理进展过程仍然不甚明确。Drosophila 提供了可在受控的空间和时间条件下研究基因功能需求的遗传学工具。此外，Drosophila 已被证实可用于帕金森病1、阿尔茨海默病2、智力障碍3,4 和癫痫5,6 等神经系统疾病的药物筛选。我们的目标是开发一种经济高效且可靠的检测方法，能够实现高通量分析，同时仍具备足够的灵敏度以检测运动功能的微小变化。
有多种检测方法可用于量化基因突变和/或环境条件对黑腹果蝇（Drosophila）攀爬行为的影响。大多数检测方法利用了果蝇天生向上攀爬的习性，即负向地性，也称为攀爬实验。Benzer7于1967年提出，用于研究趋光性的对流装置也可用于研究趋重性。此后，Ganetsky8及许多其他研究者9-12在此基础上进一步发展了该检测方法。其原理是将已知数量的果蝇放入一个试管中，用力将试管敲击坚硬表面，使果蝇全部跌落至试管底部。由于向上攀爬是一种本能行为，果蝇会试图逆着重力方向向试管顶部爬升。该实验具有定量性，通过测量在规定时间内有多少果蝇爬过试管上的标记线来进行评估。相比仅统计攀爬果蝇的总数，测量攀爬速度已成为一种更可靠的参数，并在果蝇数量差异不显著的情况下仍能检测出行为缺陷13。
爬行实验已被证明在研究多种神经退行性疾病（包括帕金森病14）中具有重要价值。然而，我们注意到，在病理学研究中已可观察到神经退行性病变时，运动功能缺陷可能尚无法被检测到14。因此，使用传统实验方法可能限制了对疾病发病早期阶段的研究能力。在病理进展的后期才出现的运动功能缺陷，可能反映疾病已进展至难以完全挽救的阶段。
这引发了关于传统攀爬实验敏感性的一个潜在问题。传统攀爬实验可能无法检测到轻微的运动缺陷，其原因在于实验要求果蝇攀爬的高度。传统实验方法15,16通过测量果蝇在10至20秒内成功攀爬超过2至5 cm高度的数量来进行评估。

<table><tbody><tr><td>果蝇品系</td><td></td><td></td><td>根据实验需求选择果蝇品系。必须控制并保持室内和培养箱中的温度与湿度一致，以避免果蝇过于干燥或过于潮湿。</td></tr><tr><td>摄像机</td><td></td><td></td><td>任何数码摄像机均可使用，但需确保其能够对近处物体对焦。</td></tr><tr><td>量筒</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>不同型号的量筒直径可能不同，因此测量其高度至关重要。</td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td>任何型号均可。我们使用计算机来监测果蝇的攀爬行为，并记录每个时间点果蝇的数量。</td></tr></tbody></table>

神经退行性疾病果蝇模型中攀爬缺陷的定量分析

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

由神经退行性疾病引起的运动功能障碍可能在多年亚临床期退化后才出现，属于疾病的晚期症状，因此目前的治疗方法尚无法实现治愈。通过全外显子组测序技术，越来越多被发现与人类运动功能相关的基因已被鉴定出来。然而，这些基因在正常运动功能中所起的关键作用仍不清楚。因此，比以往任何时候都更需要一种可靠的检测方法，利用模式生物来阐明这些基因的功能，从而发现具有治疗潜力的新靶点。我们设计了一种敏感性增强的负向趋地性检测方法，能够更早地检测出较轻微的运动缺陷，并可随时间推移对这些缺陷进行动态评估。该检测在玻璃量筒中进行，量筒顶部用石蜡封口膜密封。通过将需要攀爬的阈值距离提高至17.5 cm，并将实验时长延长至2分钟&#160;，我们观察到该方法在检测轻度运动功能障碍方面具有更高的敏感性。该方法成本低廉，且无需 extensive 培训即可获得高度可重复的结果，因此非常适用于在具有运动缺陷的Drosophila突变体中筛选候选药物。

攀爬是一种强烈且可重复的行为。事实上，出生一天的野生型果蝇能够迅速达到目标攀爬距离（25 - 30 秒）。突变型果蝇的表现则从轻微（或延迟）到完全无法攀爬至目标位置不等。本文以两个不同的突变等位基因为例进行说明。第一个是spastin基因的严重等位基因，由spastin基因的完全缺失引起（spas5.75）18。在此品系（spas5.75 与 TM6b）中，出生一天的果蝇即使经过2分钟也无法达到野生型的攀爬表现。该突变品系即使使用试管法也表现出严重的缺陷（图1A, B）。本文所介绍方法的优势在研究同一基因的另一突变体时更为明显，该突变体为同一研究组报道的部分缺失突变（spas17-7 与 TM3）18。在此情况下，果蝇在8日龄之前的表现正常（图1C-F）。在8日龄时，这些果蝇在圆柱法中表现出轻微但显著的攀爬缺陷，而在相同重复次数的试管法中则未检测到缺陷。这可能表明，使用更大的目标距离有助于检测较轻度突变体中的缺陷。选择遗传背景匹配的对照可确保观察到的效应源于转基...

我们提出了一种优化的、低成本且可靠的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）负向趋地性实验方法，可作为神经退行性疾病的模型。由于该方法对轻微运动缺陷更为敏感，因此有助于筛选潜在的基因相互作用和药物靶点。

神经退行性疾病引起的运动功能障碍可能在多年亚临床期退化后，作为疾病的晚期症状出现，并……

本实验的总体目标是定量评估野生型果蝇以及运动相关基因突变果蝇的攀爬能力。首先将果蝇转移至玻璃量筒中，然后通过轻轻敲击量筒底部（置于泡沫垫上）使果蝇跌落至量筒底部，从而实现这一目标。接下来，使用摄像机记录果蝇在两分钟内穿过目标线的情况。最后一步是分析视频，每10秒绘制一次位于目标线上方的果蝇数量。最终，攀爬实验用于鉴定果蝇突变品系在攀爬能力方面的缺陷。该技术或现有技术（例如野生型方法）的主要优势在于能够检测攀爬能力中的细微差异。该方法有助于回答神经退行性疾病领域中的关键问题，例如特定基因在遗传性痉挛性截瘫导致进行性步态障碍中的作用。该技术的应用前景主要指向治疗手段的开发。由于IP可用于神经退行性疾病的药物反应和候选基因突变体的简单定量检测，因此在神经系统疾病研究中具有重要意义。首先，使用二氧化碳麻醉20只果蝇，并将所有果蝇放入一个含有食物的25毫米×95毫米收集管中。然后将装有果蝇的管子水平放置于纸板托盘内，以避免果蝇被困在管底可能积聚的液体中。将果蝇在12小时光照/12小时黑暗循环条件下于培养箱中孵育至少21小时。次日上午，通过将果蝇从收集管转移至一个250毫升玻璃量筒中来建立攀爬实验，并用封口膜密封量筒顶部，防止果蝇逃逸。在室温光线下，22摄氏度、40%湿度条件下进行实验。每次实验应选择一天中的同一时间进行，以避免睡眠周期带来的干扰。同时，应在实验台面上标记圆筒的位置，以确保每天位置保持一致。统计圆筒底部和食物小瓶中死亡果蝇的数量，并将该数值记录为死亡率。接下来，将摄像机安装在三脚架上，轻轻对准250毫升量筒上190毫升刻度线处进行聚焦。用足够的力度将圆筒在闭孔泡沫垫上敲击5到10次，使果蝇移至圆筒内底部表面。然后用另一只手按下相机的录制按钮。在相机录制过程中，以明显非节奏性的模式敲击圆筒6次。每次试验从果蝇最后一次被轻敲开始计时，持续两分钟。试验结束后，将果蝇置于95%乙醇中处理。完成一次试验后，重复此攀爬实验10次，每次使用20只新鲜果蝇，以检测各组间运动能力的微小差异。将圆柱体在洗碗机中清洗，并过夜晾干，以便实验完成后可重复使用。为分析果蝇行为表现，首先观看每只果蝇实验过程的录像，记录每10秒通过目标线的果蝇总数。若某只果蝇退回或掉落，则记为负一，并将下一只通过目标线的果蝇计数为退回或掉落果蝇的相同编号。例如，如果第15只果蝇位于目标线以下，则将下一只越过该线的果蝇视为第15只，而非第16只。然后从果蝇总数中减去死亡数，以得到试验区域中仍存活的果蝇数量。在研究严重突变时，通过在不同时间点记录位于目标线以上的果蝇百分比，可利用不同的攀爬实验观察到不同程度的攀爬缺陷。在此实验中，记录了八日龄果蝇在18秒内爬至空食物管顶部的数量，结果显示两组之间的爬行行为无显著差异。另一方面，通过本方案中的爬行实验检测，Bastin 17 dash seven over TM three 突变果蝇相较于对照组表现出爬行能力的缺陷。由于许多运动障碍具有进行性特征，因此观察果蝇随时间推移的行为演变非常重要。在出生两天时，能够爬过目标线的果蝇数量存在显著差异。与对照组相比，随着突变果蝇从两天龄继续老化，其攀爬能力持续下降。一旦掌握，该实验和分析可在三小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何对神经疾病相关的 dola 突变模型中的运动缺陷进行定量分析。

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神经科学

攀登缺陷的神经退行性疾病的果蝇模型定量分析

用于测量运动功能、学习和记忆能力的行为学实验 果蝇.

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本文介绍了两种已建立的实验方法，用于研究黑腹果蝇（Drosophila）中多巴胺能（DA）神经元随年龄增长而发生的神经退行性变化：攀爬/惊吓诱导的负向趋地性实验，可用于研究DA神经元功能退化的效应；以及酪氨酸羟化酶免疫染色，用于在全脑制片中识别并计数DA神经元。...

评估神经退行性表型 黑腹果蝇 通过攀爬实验和全脑免疫染色检测多巴胺能神经元

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。...

大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

本逐步实验方案利用一种可容纳数百只果蝇并由电动机同步其行为的自动化多圆筒系统，分析黑腹果蝇（Drosophila）的负向趋地性行为。在实现同步后，对果蝇的负向趋地性行为进行检测，并使用自主设计的RflyDetection软件进行数字记录与分析。...

一种用于分析成年果蝇攀爬行为的自动化快速迭代负向趋地性实验方法 果蝇 神经退行性疾病模型

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我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila...

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Drosophila melanogaster 运动功能障碍的行为学分析作为神经毒性的检测指标

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