小鼠腹腔巨噬细胞的分离，以贯彻基因表达分析后Toll样受体刺激

该程序的总体目标是分离 murn 腹膜巨噬细胞，并在 toll 样受体的刺激下进行基因表达分析。这是通过第一次注射来实现的。将 3.8% 的 Brewer Thi 糖培养基放入小鼠腹膜腔中，以增加单核细胞向腹膜的迁移，从而增加三天后巨噬细胞的产量，对小鼠实施安乐死，并将冷 ECCOs 磷酸盐缓冲盐水注入腹膜腔以收获细胞。

膜腔上轻轻按摩后，小心抽吸腹膜液。接下来，培养获得的细胞，并通过流式细胞术表征引发的腹膜巨噬细胞。最后一步是用不同的 toll 样受体或 TLR 配体刺激这些巨噬细胞，并从样品中分离 RNA。

最终，定量逆转录酶聚合酶链反应用于测量目标基因的表达。以下程序的目标是使用 brewer 的 TIO 乙二醇培养基分离、镜像腹膜微噬细胞。这种培养基将增加单核细胞向腹膜的迁移，从而提高微噬细胞产量。

一旦分离出微噬细胞，将用不同的 toll 样受体配体刺激，以研究铁调素作为我们 Pinterest 基因的分子调控。首先，按照文本方案中的说明，使用连接到 23 号针头的 1 毫升注射器制备 3.8% brewer's bio glyco eight 培养基。将 1 毫升 3.8%brewer's bio glycol eight 培养基注射到每只小鼠的腹膜腔中，等待 3 天。

如文本方案中所述，在小鼠麻醉和安乐死后，为每只小鼠使用新的注射器和针头，用 70% 乙醇浸泡每只小鼠的腹部。用剪刀沿腹膜底部中线做一个横向切口。用镊子拉回腹部皮肤，露出透明的腹膜皮肤。

然后用连接到 20 号针头的 5 毫升注射器将 5 毫升冷 ECCOs 磷酸盐缓冲盐水注射到每只小鼠的腹膜腔中。对腹膜腔进行轻柔的按摩，然后小心抽吸液体，不要刺穿任何器官。取下针头并将腹膜液分配到 50 毫升锥形离心管中。

收集的腹膜液在冷冻离心机中以 400 倍 G 或 1500 RPM 离心 10 分钟，细胞应在整个过程中保持低温。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 RPMI 1640 培养基中。使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将样品调整至每毫升 100 万个细胞的细胞密度。

通过流式细胞术表征分离细胞的表型，以确认巨噬细胞富集。使用每只小鼠 100 万个细胞和针对 F four 80 的抗体，F four 80 是直接在巨噬细胞上表达的表面抗原。分离后，向 6 的每个孔中加入 100 万个细胞。

孔板。通过在 37 摄氏度下培养 1 到 2 小时，让小鼠腹膜巨噬细胞粘附在孔上。孵育后，用温热的磷酸盐缓冲盐水轻轻观察 3 次，去除非贴壁细胞。

然后向细胞中加入 900 μL 的无血清 DMEM。如文本方案中所列，制备 10 x 每种 toll 样受体或 TLR 配体的储备溶液。然后向每个孔中加入 100 微升储备溶液，从而进行 10 倍稀释培养。

细胞在 TLR 配体存在下放置 24 小时。首先进行 RNA 分离时，去除所有培养基并直接在 6 孔板中裂解细胞。向每个孔中加入 1 mL 三醇试剂，并将细胞裂解物通过移液管数次。

然后将匀浆样品在室温下孵育 5 至 10 分钟，以使核蛋白复合物完全解离。孵育后，将裂解物转移到 1.5 mL RNA 和 DNA spree 微量离心管中，并在每 1 mL 三醇试剂中加入 0.2 mL氯仿。用手用力摇晃试管 15 秒，然后在室温下孵育 5 到 10 分钟。

然后在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 15 分钟。观察混合物分离成下层红色酚氯仿相、间相和无色上层水相。RNA 仅保留在水相中。

小心地将上层水相转移到新试管中，不要干扰界面相。在室温下孵育样品 10 分钟后，与 0.5 mL 异丙醇混合，从中沉淀 RNA。在 4 摄氏度下以 12， 000 倍 G 离心 10 分钟。

RNA 沉淀在试管的侧面和底部形成白色颗粒。去除上清液，用 1 毫升 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。涡旋混合样品，然后在 4 摄氏度下以 7， 500 倍 G 离心 5 分钟。

去除上清液后，将 RNA 短暂风干 10 分钟。然后将 RNA 溶解在 100 μL 不含 RNA 的水中，并在 55 摄氏度下孵育 10 分钟。接下来，使用分光光度计定量 RNA。

用不含 RNA 的水稀释样品 100 倍，并在 260 纳米的波长下读取，均衡 RNA 浓度并按照制造商的说明合成 CD NA。使用 R-T-P-C-R 系统进行第一链 CD NA 合成试剂盒。然后在实时 DNA 检测系统中通过实时 PCR 测量基因 Mr.NA 水平，使用两个看家基因对基因表达水平进行标准化。

通过流式细胞术对分离的镜像腹膜巨噬细胞进行表征，以确定分离的巨噬细胞的百分比，并在分离过程中获得的细胞中区分它们。表达抗原 F four 80 的细胞百分比始终保持在 95% 以上，然后用几种 TLR 配体和 mRNA 处理分离的细胞。铁调素水平通过 R-T-P-C-R tolike receptor 1 和 2、tolike receptor 4 测量。

一个 olic receptor 6 和 2 配体能够刺激镜像巨噬细胞中的铁调素 mRNA。这些结果共同证明了该方案成功分离、镜像腹膜巨噬细胞和精确研究基因表达的分子调控的有用性。观看此视频后，您将对如何分离、识别和培养镜像腹膜巨噬细胞有很好的了解。