分析肥大细胞的功能 在体 内 使用“肥大细胞敲入小鼠

以下方法的总体目标是利用肥大细胞基因敲入小鼠在体内分析肥大细胞的功能。该方法首先通过生成骨髓来源的培养肥大细胞（BMC MCs），将其移植到肥大细胞缺陷型小鼠体内。第二步，将BMC MCs过继转移至肥大细胞缺陷型小鼠的不同解剖部位，从而建立肥大细胞基因敲入小鼠模型。

最终，通过流式细胞术和免疫组织化学分析，评估过继转移的肥大细胞的数量及其解剖分布，以确定移植的细胞群体在多大程度上与野生型小鼠中的细胞群体相似。该技术的主要优势在于，能够直接评估移植的野生型或基因修饰的肥大细胞群体在体内的功能。因此，该方法有助于回答肥大细胞生物学领域的一些关键问题，例如肥大细胞或其产物在多大程度上可参与生理性、免疫性或病理性过程的小鼠模型的特征表现，包括人类疾病模型。

通常情况下，学习该方法的人员可能会遇到困难，因为肥大细胞的植入和缺陷程度可能因骨髓来源肥大细胞（BM CMCs）的制备方法、注射途径、注射的骨髓肥大细胞数量，以及植入后进行体内实验前的观察周数等因素而有所不同。该方法的可视化演示至关重要，因为植入操作中的许多细节若不亲眼看到具体操作过程，很难掌握。首先提取骨髓时，应使用无菌解剖器械从野生型小鼠中完整取出股骨、胫骨和腓骨，注意避免破坏任何骨骺端。

每块骨骼解剖后，用镊子夹住，并刮除所有多余组织。待所有骨骼收集完毕后，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后转移至无菌组织培养操作台，逐个用镊子固定骨骼，剪去两端的骨骺以暴露骨髓腔。接着，使用装有30号针头的3毫升注射器，以冷培养基冲洗，将每块骨骼中的红骨髓冲洗至新的培养皿中。所有骨骼冲洗完成后，使用同一注射器通过反复轻柔地吸液和排液，使骨髓细胞团解离。

然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中。用冷灌注培养基充满离心管，离心收集细胞。用10毫升培养基重悬细胞沉淀。

然后将骨髓细胞转移至适当大小的组织培养瓶中。培养一到两天后，在接下来的数周内，将非贴壁细胞连同每只小鼠10毫升新鲜培养基转移至新的培养瓶中。每三到四天换液一次，如上所述。

每周将非贴壁细胞转移至新的培养瓶，直至无贴壁细胞残留，用于耳廓皮内移植。将骨髓来源肥大细胞（BMC MCs）重悬于冷DMEM中，浓度为4 × 10⁷ 个细胞/毫升。然后用配备30号针头的1毫升注射器吸取细胞悬液，并将注射器置于冰上。

接下来，通过夹捏一只4至6周龄的肥大细胞缺陷型受体小鼠的足垫来确认麻醉深度是否合适，并涂抹眼药膏以防止角膜干燥。用食指暴露并拉伸耳廓的腹侧面，同时对耳廓背侧面施加垂直压力。然后将1 × 10⁶个骨髓来源肥大细胞（BMC MCs）溶于25 µL溶液中，进行耳廓中部皮内注射；再在耳廓尖端附近注射第二份25 µL相同细胞悬液。

对于腹腔移植，将骨髓来源肥大细胞（BMC MCs）以每毫升1 × 10⁷个细胞的密度重悬于冷DMEM中。然后使用配有25号针头的1毫升注射器，将200微升含2 × 10⁶个骨髓来源肥大细胞（BM CMCs）的培养基注入肥大细胞缺陷型受体小鼠的腹腔内。对于静脉移植，将骨髓来源肥大细胞（BM CMCs）以每毫升2.5 × 10⁷个细胞的密度重悬于冷DMEM中，通过尾静脉注射200微升含5 × 10⁶个BMC MCs的培养基。

在腹腔移植后四到六周，使用带有25号针头的5毫升注射器，向受体动物的腹腔内注入5毫升冷PBS。按摩腹部20秒以收集腹腔细胞。然后使用带有22号针头的5毫升注射器缓慢抽吸腹腔灌洗液。

随后可通过流式细胞术或组织化学方法评估腹腔灌洗液中的肥大细胞百分比和总细胞数。为评估肠系膜窗中的肥大细胞，需切开腹膜以暴露肠道。将每只小鼠的四至五个肠系膜窗置于载玻片上，随后在卡诺氏液中固定一小时。

在孵育结束后加入室温条件，将载玻片空气干燥并移除肠组织。固定的肠系膜窗将保持附着在载玻片上。最后，在室温下用查巴染色液对制备样本染色20分钟，以进行流式细胞术分析，并对在DMEM中培养15天和45天后的骨髓肥大细胞（BM CMCs）进行碘蓝染色。补充IL-3培养45天的BM CMCs显示纯度达95%，且含有大量胞质颗粒。

因此，这些培养物中的细胞适用于移植实验，而培养15天的细胞则不适合，如图所示。按预期显示了耳部皮内移植后四周、肠系膜窗移植后六周、腹腔内移植后六周以及静脉移植后十二周肺部的成功移植情况。在从野生型小鼠分离的组织样本中可观察到肥大细胞，而在肥大细胞缺陷型动物及肥大细胞基因敲入小鼠中均未检测到肥大细胞。

然而，过继转移的BMC肥大细胞出现在与野生型动物中观察到的相似位置。在进行此操作时，需要注意的是，移植与实验观察之间的时间间隔会因肥大细胞注射部位的不同而有所差异。必须严格遵守相应的时间间隔，以确保移植的细胞有足够的时间成熟并最终定位于体内。

这种方法已经并将继续提供有关大量细胞及其产物在体内能够或不能够发挥何种作用的重要信息。请务必牢记，使用活体动物进行实验需要经过专门培训，实验方案须经过适当的审查和批准，并且必须严格遵守动物护理的最高标准，包括在实施这些操作时注意减轻动物的疼痛和应激。