Name: 使用桅杆细胞敲击小鼠分析体内桅杆细胞的功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 了解利用骨髓来源培养肥大细胞进行体内功能分析的方法，通过过继转移至肥大细胞缺陷小鼠，评估其在各解剖部位的表型与分布特征，为免疫学研究提供关键技术支持。

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N.G. 获得法国“医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale FRM）”和Philipp基金会的资助；R.S. 获得Lucile Packard儿童健康基金会以及斯坦福大学NIH/NCRR临床与转化科学奖（CTSA）项目编号UL1 RR025744的支持；P.S. 获得Max Kade基金会的Max Kade奖学金、奥地利科学院以及奥地利科学基金（FWF）的Schroedinger奖学金（J3399-B21）资助；S.J.G. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目U19 AI104209、NS 080062以及加州大学烟草相关疾病研究计划的支持；L.L.R. 感谢关节炎国家研究基金会（ANRF）和美国国立卫生研究院资助项目K99AI110645的支持。

所有动物护理和实验操作均遵循美国国立卫生研究院的指导方针，并获得斯坦福大学机构动物护理与使用委员会的特别批准。
1. 骨髓来源培养肥大细胞（BMCMCs）的制备与鉴定。
注意：供体骨髓来源的肥大细胞（BMCMCs）应由与受体肥大细胞缺陷型小鼠相同遗传背景的骨髓细胞生成。雄性来源的供体BMCMCs不适用于雌性小鼠的移植。雌性来源的供体BMCMCs可成功移植至雄性和雌性受体小鼠中。
<ol>
	<li>骨髓提取
	<ol>
		<li>将无菌磷酸盐缓冲液（PBS）加入6孔培养板中（每只小鼠1孔），置于冰上。</li>
		<li>将解剖器械浸泡在70%乙醇中进行消毒。</li>
		<li>使用二氧化碳（CO₂）安乐死供体小鼠2吸入麻醉后行颈椎脱位处死，随后用70%乙醇喷洒小鼠操作部位。</li>
		<li>使用无菌解剖器械完整取出股骨、胫骨和腓骨，避免切割任何骨骺部位。</li>
		<li>用镊子固定骨骼的同时，使用无菌剪刀（或手术刀片）刮除骨骼上的所有组织（并丢弃腓骨）。将骨骼置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至收集完所有骨骼。</li>
		<li>在无菌组织培养罩内完成所有后续步骤。使用无菌器械，用镊子固定骨骼，剪除两端骨骺以暴露骨髓腔。</li>
		<li>使用3 ml注射器和30 G针头，以及冷灌注培养基（添加10%胎牛血清[FCS，热灭活]、2 mM L-谷氨酰胺、1%抗生素-抗真菌溶液、50 &#181;M &#914;-巯基乙醇），将红骨髓冲洗至培养皿中。</li>
		<li>使用同一支注射器通过反复轻柔地吸取和推出液体来解离冲出的骨髓细胞团块。</li>
		<li>将每只小鼠的股骨和胫骨骨髓汇集至一个15 ml离心管中。用预冷的冲洗液充满离心管以洗涤骨髓细胞，于4℃下以400 × g离心5分钟 &#176;C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）培养
	<ol>
		<li>移去上清液，用10 ml培养基（DMEM添加10%胎牛血清[FCS，热灭活]、2 mM L-谷氨酰胺、1%抗生素-抗真菌溶液、50）重悬沉淀的骨髓细胞 &#181;M &#914;-巯基乙醇和20% WEHI-3细胞条件培养基（作为IL-3来源；或 alternatively 使用10 ng/ml重组小鼠IL-3）。</li>
		<li>将细胞置于适当大小的组织培养瓶中（例如，1只小鼠使用T25，2只小鼠使用T75 等等。).</li>
		<li>接种细胞后1-2天，将培养基及悬浮细胞转移至新培养瓶中（留下碎片及贴壁细胞附着于原培养瓶底部），并加入新鲜培养基（每只小鼠10 ml）。</li>
		<li>在接下来的几周内，每隔3-4天更换一次饲养细胞（每只小鼠添加10 ml培养基）。维持细胞密度在2.5 × 105-1 × 106 细胞/ml。每周将非贴壁细胞转移至新的培养瓶，直至原培养瓶中无贴壁细胞残留。使用前检测细胞成熟度（见下文）。 体外 检测或移植到肥大细胞缺陷型小鼠体内。 
		注意：骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）的完全分化需要4-6周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMCMC成熟度评估
	<ol>
		<li>使用流式细胞术。
		<ol>
			<li>洗涤细胞（5 × 104-5 × 105 细胞/条件）加入5 ml聚苯乙烯圆底管中，用预冷的FACS缓冲液（PBS，0.5% FCS）重悬。4℃下400 × g离心5分钟 &#176;C. 吸去上清液。</li>
			<li>稀释抗小鼠 CD16/32（克隆 93 或 2.4G2）单克隆抗体至 1:200（2.5 &#956;g/ml) 溶于 FACS 缓冲液中。加入 10 &#181;l 加入每个沉淀中，短暂涡旋重悬。冰上孵育5分钟以阻断Fc结合。 
			注意：后续所有步骤中均需避免样品暴露于直射光下。</li>
			<li>稀释藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠 Fc 抗体 &#949;RI &#945; （克隆 MAR-1）1:200（1 &#956;g/ml）以及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠KIT（CD117；克隆2B8）1:200（2.5 &#956;g/ml）（“染色溶液”），或分别用FACS缓冲液中的相应标记同型对照抗体（“同型对照溶液”）。</li>
			<li>将步骤 1.3.1.2) 中阻断的细胞取一半分装至另一聚苯乙烯圆底管中，并加入 20 &#181;“染色液”1升置于一支试管中，另取20 &#181;另一管中加入 l “同型对照溶液”，冰上孵育 30 分钟。</li>
			<li>加入 3 ml 冰冷的 FACS 缓冲液，在 4°C 下以 400 x g 离心 5 分钟 &#176;C. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 300 &#181;含1的FACS缓冲液 &#181;g/ml 碘化丙啶（PI，用于鉴定死细胞）。进行流式细胞术分析（参见 图2A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用甲苯胺蓝染色。
		<ol>
			<li>洗涤 1 × 105 以 PBS 洗涤细胞一次，于室温下以 400 × g 离心 5 分钟，然后吸除上清，将细胞重悬于 200 &#181;毫升 PBS</li>
			<li>将细胞悬液转移至已准备好的、连接在显微镜载玻片上的细胞离心套管中，使用细胞离心机进行细胞离心（40 × g，5 分钟）。</li>
			<li>空气干燥载玻片10分钟，使用PAP笔在细胞周围画蜡圈。加入0.1%甲苯胺蓝溶液覆盖细胞，孵育1分钟。用流动自来水冲洗载玻片1分钟，然后空气干燥10分钟。</li>
			<li>使用封片剂封片，随后进行光学显微镜分析（参见 图2B)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）移植到肥大细胞缺陷型小鼠体内。
<ol>
	<li>皮内注射移植耳组织 
	注意：对于将骨髓来源的肥大细胞（BMCMCs）过继转移至肥大细胞缺陷型小鼠耳廓，我们建议每只耳朵进行两次注射，每次注射 1 x 106 每个细胞（总计 2 x 10）6 每耳廓植入细胞数）。肥大细胞缺陷型小鼠耳廓皮内移植骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）的方法已被多位研究者应用于多种模型，包括被动皮肤过敏反应（PCA）模型。24,27，针对毒液的宿主防御28，以及慢性超敏反应（CHS）29,30.
	<ol>
		<li>计数并将细胞重悬于 4 x 107 BMCMCs/ml（1 × 106 BMCMCs/25 &#181;l) 置于预冷的DMEM中。将BMCMCs悬液转移至装有30 G针头的1 ml注射器中，冰上保存直至注射。</li>
		<li>使用异氟烷（2.5% v/v）对4至6周龄的肥大细胞缺陷型小鼠进行麻醉。通过夹捏脚趾检查麻醉深度，必要时调整异氟烷浓度，并在手术过程中持续监测呼吸和脚趾夹捏反应。用棉签涂抹眼用软膏，防止眼睛干燥。</li>
		<li>用食指对耳廓的背侧施加垂直压力，以暴露并拉伸腹侧。</li>
		<li>进行两次 25 &#181;在耳廓腹面的两个不同部位皮内注射 BMCMC 溶液，第一针注射于耳中部，第二针注射于耳廓尖端附近。皮内移植后需等待 4–6 周，再进行后续操作 体内 实验。 
		注意：根据我们的经验，此时每毫米的肥大细胞（MCs）数量2 耳廓中央部位真皮层的结构通常与野生型小鼠相应部位相似，而每平方毫米肥大细胞（MCs）的数量2 耳廓边缘部位的数值通常显著低于相应野生型小鼠27,28在设计使用此类MC移植小鼠的实验时，应牢记这一点。例如., 应将可能影响肥大细胞功能的试剂注射至耳廓中央区域，且对这些处理效应的分析也应集中于该区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔内注射（i.p.）移植至腹腔 
	注意：将骨髓来源的肥大细胞（BMCMCs）过继转移至肥大细胞缺乏小鼠的腹腔，需进行一次注射，剂量为 2 x 106 每只小鼠的细胞数。许多研究团队已采用将骨髓来源的肥大细胞（BMCMCs）经腹腔注射至肥大细胞缺陷型小鼠的方法，用于研究腹膜肥大细胞在多种模型中的作用，包括机体防御毒液的模型31 或细菌性败血症32,33.
	<ol>
		<li>计数适量细胞，并重悬于 1 x 107 BMCMCs/ml（2 × 106 BMCMCs/200 &#181;l) 置于预冷的DMEM中。将BMCMCs溶液转移至配有25 G针头的1 ml注射器中，冰上保存直至注射。</li>
		<li>进行一次200的注射 &#181;将 l BMCMCs 溶液注入 4–6 周龄肥大细胞缺陷型小鼠的腹腔。腹腔移植后需等待 4–6 周，再进行后续操作 体内 实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过静脉注射（i.v.）进行移植。 
	注意：通过尾静脉注射将骨髓来源的肥大细胞（BMCMCs）过继转移至肥大细胞缺陷型小鼠，需进行一次 5 x 10⁶ 个细胞的注射。6 每只小鼠的细胞数。许多研究团队已采用静脉（i.v.）注射骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）至肥大细胞缺乏小鼠的方法，以研究肥大细胞在多种疾病模型中的作用，包括膀胱感染模型。34，哮喘35肺纤维化36和抗体介导性关节炎37.
	<ol>
		<li>计数适量细胞并重悬于 2.5 x 107 BMCMCs/ml（5 × 106 BMCMCs/200 &#181;l) 置于预冷的DMEM中。将BMCMCs悬液转移至装有30 G针头的1 ml注射器中，冰上保存直至注射。</li>
		<li>使用异氟烷（2.5% v/v）对4至6周龄的肥大细胞缺陷型小鼠进行麻醉。通过夹捏脚趾检查麻醉深度，必要时调整异氟烷浓度，并在手术过程中持续监测呼吸和脚趾夹捏反应。用棉签涂抹眼用软膏，防止眼睛干燥。</li>
		<li>注射200一次 &#181;将 BMCMC 溶液注入肥大细胞缺陷型小鼠的尾静脉（或 alternatively，眶后静脉）。静脉移植后等待 12 周，再进行后续操作。 在体 实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 植入型肥大细胞缺陷小鼠的分析。
<ol>
	<li>耳部移植分析
	<ol>
		<li>实验结束时，通过 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。</li>
		<li>分离耳廓，并在4℃下用10%（体积比）缓冲福尔马林固定过夜 &#176;C. 将固定的耳廓包埋于石蜡中，切片，厚度为4 &#181;将耳廓组织切成 m 段并置于载玻片上。</li>
		<li>用0.1%甲苯胺蓝溶液在室温下染色1分钟。用自来水冲洗载玻片1分钟，然后在室温下晾干10分钟。</li>
		<li>使用封片剂封固盖玻片，然后在光学显微镜下计数每张耳廓切片中移植的肥大细胞（MCs）数量。通过比较移植小鼠耳部皮肤中肥大细胞的百分比与分布情况，评估移植效率。 与 野生型小鼠</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腹腔移植分析
	<ol>
		<li>评估腹腔内肥大细胞数量
		<ol>
			<li>实验结束时，通过 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位。小心移除小鼠腹侧皮肤，避免破坏腹膜腔。</li>
			<li>使用配备25 G针头的5 ml注射器，向腹腔内注入5 ml冷PBS或室温PBS。建议使用冷PBS以降低腹腔细胞被激活的风险（在评估腹腔肥大细胞脱颗粒或腹腔灌洗液中某些肥大细胞来源产物水平时，此步骤尤为关键）。腹部按摩20秒，以收集腹腔细胞。</li>
			<li>使用配备22 G针头的5 ml注射器缓慢抽吸腹腔灌洗液。记录抽吸得到的灌洗液体积（预期可回收注入体积的80%）。</li>
			<li>将腹腔灌洗液转移至一个5 ml聚苯乙烯圆底管中，在4℃下以400 × g离心5分钟 &#176;C. 吸去上清液。用400 μL缓冲液重悬沉淀 &#181;冷 PBS</li>
			<li>使用血细胞计数板计数腹腔细胞的总数。取一半细胞悬液用于流式细胞术分析（如步骤1.3.1所述），以评估移植的肥大细胞（MCs）在腹腔中的比例及标志物表达水平。将腹腔细胞总数乘以MCs所占百分比，得到腹腔MCs的绝对数量。</li>
			<li>按照1.3.2.2步骤所述，对剩余细胞进行细胞离心。室温下将载玻片空气干燥10分钟，并使用PAP笔在细胞周围画蜡圈。</li>
			<li>用未稀释的May-Grünwald染色液覆盖细胞，室温孵育5分钟，随后用PBS洗涤5分钟。用去离子水按1:20比例稀释的Giemsa染液覆盖细胞，室温孵育20分钟。用自来水洗涤载玻片2次，每次1分钟，然后将载玻片空气干燥。</li>
			<li>使用封片剂封片，利用光学显微镜计算移植的MCs百分比（至少计数400个总细胞）。通过比较移植小鼠腹腔灌洗液中MCs的百分比，评估移植效率 与 野生型小鼠</li>
		</ol>
		</li>
		<li>评估肠系膜窗中的肥大细胞
		<ol>
			<li>在完成3.2.1步骤中所述的腹腔灌洗后，切开腹膜以暴露小鼠的肠道。每只小鼠取4至5个肠系膜窗，置于载玻片上。</li>
			<li>在室温下用卡诺伊溶液（乙醇、氯仿和冰醋酸按3:2:1体积比混合）固定载玻片1小时。将载玻片自然晾干，并移除肠组织（固定的肠系膜窗将保留在载玻片上）。</li>
			<li>室温下用Csaba（阿利新蓝/沙黄O）染色液对制备样品染色20分钟。
			<ol>
				<li>配制500 ml Csaba染液时，先通过混合100 ml 1 M醋酸钠溶液与120 ml 1 M HCl制备500 ml醋酸盐缓冲液，用去离子水定容至500 ml，并将pH调节至1.42。然后溶解90 mg番红花红[将“成熟肥大细胞”染成红色]、1.8 g阿新蓝[将“未成熟肥大细胞”染成蓝色]和2.4 g硫酸铁铵NH4Fe(SO4)2 加入500 ml醋酸盐缓冲液中。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>使用封片剂封片，然后在光学显微镜下计数每个肠系膜窗中移植的肥大细胞（MCs）数量。通过比较移植小鼠肠系膜窗中肥大细胞的百分比和分布情况，评估移植效率。 与 野生型小鼠</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉移植分析
	<ol>
		<li>实验结束时，通过 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死，取所需组织例如 肺、皮肤或脾脏）并在 4℃ 下用 10%（体积/体积）缓冲福尔马林固定过夜 &#176;C.</li>
		<li>将固定组织包埋于石蜡中，切片厚度为4 μm &#181;m切片，置于载玻片上。用0.1%甲苯胺蓝溶液在室温下染色1分钟。用自来水冲洗载玻片1分钟，然后室温晾干10分钟。</li>
		<li>使用封片剂封片，并在光学显微镜下评估每张组织切片中移植的肥大细胞（MCs）数量及其分布情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

首次描述后近30年38， “肥大细胞基因敲入该方法仍在持续提供有关肥大细胞（MCs）能够或不能够执行哪些功能的宝贵信息 体内长期以来，人们认为肥大细胞（MCs）的功能仅限于其在过敏反应中的作用。利用“肥大细胞敲入’的方法通过提供证据表明，肥大细胞（MCs）除了其他功能外，还能在宿主防御某些病原体过程中发挥关键作用4,39 或毒液28,31，甚至可以抑制某些免疫反应29,34,40.
在我们的方案描述中，我们决定重点关注骨髓来源培养的肥大细胞（BMCMCs）的制备与移植，因为可大量获得此类细胞 体外 从小鼠的骨髓中分离野生型或突变型肥大细胞。然而，肥大细胞也可直接由胚胎干细胞培养获得（胚胎干细胞来源的培养肥大细胞 [ESCMCs]）41 并且，在基因型相容的情况下，这些细胞还可用于移植到肥大细胞缺乏的小鼠体内。这一替代方法对于研究某种蛋白质的功能特别有意义，该蛋白质的缺陷会导致小鼠胚胎致死，因而无法通过此...

肥大细胞（MCs）是来源于多能性骨髓前体细胞的造血细胞1-3。骨髓前体细胞离开骨髓后，迁移至多种组织，并在局部生长因子的作用下发育为成熟的肥大细胞1-3。组织驻留型肥大细胞战略性地位于宿主与外界环境的交界处，例如皮肤、呼吸道和胃肠道，它们在抵御外界侵害时发挥第一道防线的作用3-6。肥大细胞常根据其“基础”表型特征和解剖位置进一步分类。在小鼠中，已描述有两种类型的肥大细胞：“结缔组织型”肥大细胞（CTMCs）和黏膜型肥大细胞（MMCs）1-3,7,8。CTMCs通常位于小静脉周围和神经纤维附近，并存在于浆膜腔中，而MMCs则定位于肠道和呼吸道黏膜的上皮内区域1-3。
已采用多种方法研究肥大细胞的生物学功能9-13许多研究团队已致力于 体外 使用细胞系的方法（如人MC细胞系HMC1）14 或 LAD215,16), 体外 衍生的肥大细胞（如人外周血来源的肥大细胞）17或小鼠骨髓来源培养的肥大细胞 [BMCMCs]18，胎源性皮肤培养的肥大细胞 [FSCMCs]19 腹膜细胞来源的肥大细胞 [PCMCs]20）或 离体 从不同解剖部位分离的肥大细胞。这些模型被广泛用于研究肥大细胞生物学的分子机制，例如参与肥大细胞活化的信号通路。然而，肥大细胞生物学的一个重要特征是其表型和功能特性（例如，细胞质颗粒中的蛋白酶含量或对不同刺激的反应性可受解剖位置和微环境的调节2,7. 由于所遇到的这些因素的确切混合情况 体内 可能难以重复 体外，我们倾向于使用 体内 深入了解肥大细胞功能的方法9.
目前已存在多种遗传性肥大细胞（MC）缺陷的小鼠品系，例如广泛使用的 WBB6F1-Kit W/W-v 或 C57BL/6-Kit W-sh/W-sh 小鼠。这些小鼠缺乏 KIT（CD117）的表达和/或活性，而 KIT 是主要的肥大细胞生长因子干细胞因子（SCF）的受体21,22。因此，这些小鼠表现出严重的肥大细胞缺陷，但也存在其他与 c-kit 基因突变（如 WBB6F1-Kit W/W-v 小鼠）或与大片段染色体倒位导致 c-kit 表达降低相关（如 C57BL/6-Kit W-sh/W-sh 小鼠）的表型异常9,10,12,23。近年来，已报道数种不依赖于 c-kit 的组成型肥大细胞缺陷小鼠品系24-26。上述所有小鼠模型以及一些新型的可诱导型肥大细胞缺陷小鼠，已在近期得到系统综述9,10,13。
本文介绍了小鼠骨髓来源培养肥大细胞（BMCMCs）的制备方法、将其过继转移至肥大细胞缺陷型小鼠的方法，以及在不同解剖部位分析过继转移肥大细胞数量与分布的方法。这种所谓的“肥大细胞敲入”方法可用于在体内评估肥大细胞及其来源产物的功能。我们还结合近年来发展的其他替代方法，讨论了该方法的优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>1% 抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm 培养皿</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>阿尔新蓝 8GX</td><td>罗利生化丹佛</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R 离心机</td><td>贝克曼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32（克隆 93）纯化抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml 结核菌素注射器</td><td>BD 注射器</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1（0.7 mm x 25 mm）针头</td><td>BD Precision Glide 针头</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 针头</td><td>BD 注射器</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 针头</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Blue MAX Jr，15 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 封片介质</td><td>理查德-艾伦科学公司</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 笔</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，热灭活</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的大鼠 IgG2b κ 同型对照</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗小鼠KIT（CD117；克隆2B8）</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>改良吉姆萨染色</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>等感觉</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>迈-格鲁纳染色法</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>6孔多孔板</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 BX60 显微镜</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus 组织包埋介质</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE标记的叙利亚仓鼠IgG同型对照</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1×</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>藻红蛋白（PE）标记的抗小鼠 FceRIa 抗体（克隆 MAR-1）</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶染色液</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>藏红O认证</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>T25 组织培养瓶 25 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶 T75 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>贝克顿·迪金森</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>1% 甲苯胺蓝水溶液</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

分析肥大细胞的功能 在体 内 使用“肥大细胞敲入小鼠

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

肥大细胞（MCs）是存在于多种组织中的造血细胞，尤其在暴露于外界环境的部位（如皮肤、呼吸道和胃肠道）中含量丰富。肥大细胞最广为人知的作用是在IgE依赖性过敏反应中产生有害效应，但近年来也发现其在宿主抵御毒液以及入侵的细菌和寄生虫方面发挥着重要作用。肥大细胞的表型和功能可受到微环境因素的影响，这些因素可能因解剖位置的不同和/或免疫反应的类型或发展阶段而有所差异。因此，我们及其他研究者更倾向于采用体内方法而非体外方法来深入理解肥大细胞的功能。本文描述了小鼠骨髓来源培养肥大细胞（BMCMCs）的制备方法、将其过继转移至遗传性肥大细胞缺陷小鼠的方法，以及在不同解剖部位分析过继转移肥大细胞数量和分布的方法。该方法被称为“肥大细胞基因敲入”法，在过去30年中被广泛用于评估肥大细胞及其产物在体内的功能。我们还结合近年来发展的其他替代方法，讨论了该方法的优势与局限性。

“肥大细胞移植”方法的概述如图1所示，包括骨髓来源肥大细胞（BMCMCs）的制备、移植至肥大细胞缺陷型小鼠腹腔（i.p.）、皮内（i.d.）或静脉（i.v.）的细胞数量（可根据实验设计进行调整），以及根据移植部位确定移植后至实验开始的时间间隔（该间隔也可根据需要调整；例如，肥大细胞胞浆颗粒中储存介质的含量随时间逐渐增加38）。图2展示了在含有20% WEHI-3细胞条件培养基（作为IL-3来源）的DMEM培养基中培养1天、15天和45天后，BMCMCs的代表性流式细胞术分析结果及甲苯胺蓝染色结果。需要注意的是，培养45天的BMCMCs纯度达95%，富含大量胞浆颗粒，可用于移植实验；而培养15天的细胞则不适合用于移植。图3展示了移植后不同时间点在不同组织中成功定植的代表性结果：皮内移植4周后耳廓组织中的定植情况（图3A），腹腔移植6周后肠系膜窗（图3B）和腹腔（图3C）中的定植情况...

我们描述了一种用于生成 体外 衍生肥大细胞，将其移植到肥大细胞缺陷型小鼠体内，以及在不同解剖部位对移植后肥大细胞的表型、数量和分布进行分析。本方案可用于评估肥大细胞的功能 体内.

肥大细胞（MCs）是定居于多种组织中的造血细胞，尤其在暴露于外环境的部位大量存在，例如……

以下方法的总体目标是利用肥大细胞敲入小鼠在体内分析肥大细胞的功能。该方法首先通过生成骨髓来源的培养肥大细胞（BMC MCs），并将其移植到肥大细胞缺陷型小鼠体内。第二步，将BMC MCs过继转移至肥大细胞缺陷型小鼠的不同解剖部位，从而建立肥大细胞敲入小鼠模型。最终，通过流式细胞术和免疫组织化学分析，评估过继转移的肥大细胞的数量及其解剖分布，以确定移植的细胞群体在多大程度上与野生型小鼠中的细胞群体相似。该技术的主要优势在于，能够直接评估移植的野生型或基因修饰的肥大细胞群体在体内的功能。因此，该方法有助于回答肥大细胞生物学领域的一些关键问题，例如肥大细胞或其产物在多大程度上可参与生理性、免疫性或病理性过程的小鼠模型的特征表现，包括人类疾病模型。通常，学习该方法的人员可能会遇到困难，因为肥大细胞的植入和缺陷程度可能因生成骨髓来源肥大细胞（BM CMCs）的方法、注射途径、注射的骨髓肥大细胞（BMC MCs）数量，以及植入后进行体内实验前的观察周数等因素而有所不同。该方法的可视化演示至关重要，因为植入操作的某些步骤若不亲眼看到具体操作过程，很难掌握。首先提取骨髓时，应使用无菌解剖器械从野生型小鼠中完整取出股骨、胫骨和腓骨，注意避免破坏任何骨骺端。每取出一块骨骼后，用镊子夹住，刮除所有多余组织。待所有骨骼收集完毕后，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后转移至无菌组织培养操作台，逐个用镊子固定骨骼，剪去两端骨骺以暴露骨髓腔。接着，使用装有30号针头的3毫升注射器，吸取冷培养基，将每块骨骼中的红骨髓冲洗至新的培养皿中。所有骨骼冲洗完成后，用同一支注射器通过反复轻柔地吸吹，使骨髓细胞团解离。 然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中。用冷灌注液充满离心管，离心收集细胞。用10毫升培养基重悬细胞沉淀。然后将骨髓细胞转移至适当大小的组织培养瓶中。培养一到两天后，在接下来的数周内，将非贴壁细胞连同每只小鼠10毫升新鲜培养基转移至新的培养瓶中。每三到四天换液一次，如上所述。每周将非贴壁细胞转移至新的培养瓶，直至无贴壁细胞残留，用于耳廓皮内移植。将骨髓来源的肥大细胞（BMC MCs）以每毫升4×10⁷个细胞的密度重悬于冷DMEM中。随后将细胞吸入一支配有30号针头的1毫升注射器中，并将注射器置于冰上。接着，通过夹捏一只4至6周龄的肥大细胞缺陷型受体小鼠的足垫来确认麻醉深度是否合适，并涂抹眼药膏以防止角膜干燥。用食指暴露并拉伸耳廓的腹侧面，同时对耳廓背侧面施加垂直压力。然后将1 × 10⁶个骨髓来源肥大细胞（BMC MCs）溶于25 µL体积中，进行耳廓中部皮内注射；再在耳廓尖端方向进行第二针相同体积（25 µL）的皮内注射。对于腹腔移植，将骨髓来源类肥大细胞（BMC MCs）以每毫升1×10⁷个细胞的浓度重悬于冷DMEM中。然后使用配有25号针头的1毫升注射器，将200微升含2×10⁶个骨髓类肥大细胞（BM CMCs）的悬液注入肥大细胞缺陷型受体小鼠的腹腔内。对于静脉移植，将骨髓类肥大细胞（BM CMCs）以每毫升2.5×10⁷个细胞的浓度重悬于冷DMEM中，通过尾静脉注射200微升含5×10⁶个BMC MCs的细胞悬液。在腹腔移植后四到六周，使用配备25号针头的5毫升注射器，向受体动物的腹腔内注入5毫升冷PBS。轻轻按摩腹部20秒，以收集腹腔细胞。然后使用配备22号针头的5毫升注射器，缓慢抽吸腹腔灌洗液。随后可通过流式细胞术或组织化学方法评估腹腔灌洗液中的肥大细胞百分比和总细胞数。为评估肠系膜窗中的肥大细胞，需切开腹膜以暴露肠道。将每只小鼠的四至五个肠系膜窗置于载玻片上，随后在卡诺氏液中固定一小时。在孵育结束后加入室温条件，将载玻片空气干燥并移除肠组织。固定的肠系膜窗将保持附着在载玻片上。最后，在室温下用查巴染色液对制备样本染色20分钟，代表流式细胞术分析以及培养15天和45天后骨髓来源类肥大细胞（BM CMCs）的碘蓝染色结果。在添加IL-3的DMEM中培养45天的BM CMCs显示纯度达95%，且含有大量胞质颗粒。因此，这些培养物中的细胞适用于移植实验，而在这些图像中，培养15天的细胞则不适合。如预期所示，耳部在皮内移植后四周、肠系膜窗在移植后六周、腹腔在腹腔内移植后六周以及肺部在静脉移植后12周均成功实现了移植。在从野生型小鼠分离的组织样本中可观察到肥大细胞，而在肥大细胞缺陷型动物及肥大细胞基因敲入小鼠中则未检测到肥大细胞。然而，过继转移的BMC肥大细胞出现在与野生型动物中观察到的相似位置。在进行此操作时，需要注意的是，移植与实验观察之间的时间间隔会因肥大细胞注射部位的不同而有所差异。必须严格遵守相应的时间间隔，以确保移植的细胞有足够的时间成熟并最终定位于体内。这种方法已经并将继续提供有关大量细胞及其产物在体内能够或不能够发挥何种作用的重要信息。请务必牢记，使用活体动物进行实验需要经过专门培训，实验方案必须经过适当的审查和批准，并且必须严格遵守动物护理的最高标准，包括在实施这些操作时注意减轻动物的疼痛和应激。

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免疫学与感染

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分析肥大细胞的功能在体内使用“肥大细胞敲入小鼠

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