Name: 混合μCT-FMT成像和图像分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学习混合μCT-FMT成像技术，用于麻醉小鼠体内荧光分布的定量评估。该方法结合荧光分子断层扫描与显微计算机断层扫描，通过交互式器官分割实现精准数据分析，为神经科学研究提供功能与解剖信息。

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感谢Marek Weiler完成模体实验。本工作由欧洲研究理事会（ERC起始资助309495：NeoNaNo）、德国北莱茵-威斯特法伦州（NRW；高技术.NRW/欧盟目标2计划（EFRE）；ForSaTum）、德国联邦教育与研究部（BMBF）（资助项目：虚拟肝脏（0315743）、LungSys（0315415C）、LungSys2（0316042F）、光子学研究德国（13N13355））、亚琛工业大学（I3TM种子基金）以及飞利浦研究（德国亚琛）提供支持。

该方案详细描述了以下步骤：首先，准备用于成像的模体或小鼠以及多模态小鼠成像床。随后，在 µCT 中获取全身扫描图像。接着，将小鼠成像床转移至 FMT 系统，在正向和倒置两种位置下各采集一次扫描图像。该过程可针对多只小鼠在多个时间点重复进行。数据采集完成后，需将数据导出并分类，以实现自动分割（需要 Definiens 软件许可）、图像融合及荧光重建（需要 Imalytics Preclinical 软件许可）。最后，展示了如何可视化多模态数据集，以及如何对器官进行交互式分割，以定量分析荧光探针在体内的生物分布。
1. 模体制备
注意：模体不仅可用于测试成像系统，还可用于确定新探头的校准因子。
<ol>
	<li>制备200 ml水、2%琼脂糖、1.8 g TiO2粉末和50 µl台盼蓝的混合溶液。煮沸后，将该溶液倒入一个长约8 cm、宽约3 cm、高约1.5 cm的矩形模具中。</li>
	<li>使用移液器吸头在模体中制备多个含有荧光剂和µCT对比剂混合物的荧光包埋物。为制备这些包埋物，可将移液器吸头剪断，并用打火机将其封口。</li>
	<li>待溶液完全凝固后，将包埋物插入模体中。切除模体的部分区域，使其呈现不规则形状，以便适配多模态小鼠固定装置。</li>
	<li>为确定新探针的校准因子，需进行若干次模体扫描。此时，使用标准FMT模体并结合已知浓度的探针进行。为提高准确性，可在溶液中添加4%的脂质乳剂，使包埋物内部的散射系数与模体其余部分一致。同时加入少量（2%）µCT对比剂，以利于图像分析。</li>
</ol>
2. 小鼠准备
注意：µCT-FMT 成像需要特殊准备，包括麻醉和脱毛。
<ol>
	<li>成像前 7 天将小鼠置于无叶绿素的食物上饲养。这将减少背景信号，对于 750 nm 以下的 FMT 通道尤其重要。</li>
	<li>所有动物实验均在麻醉状态下进行。麻醉诱导时，将小鼠放入充满含 2% 异氟烷的空气混合气体的麻醉舱内（气体流速 5 L/min），直至小鼠进入睡眠状态。通过轻捏脚趾或皮肤以及检查肌肉张力是否松弛（例如，下颌肌）来确认麻醉效果。维持麻醉时，使用鼻罩导管持续给予异氟烷（2% 异氟烷，空气流速 1 L/min）。为防止角膜干燥，需在麻醉小鼠的眼部涂抹兽用眼膏。</li>
	<li>注射造影剂时，用胶带将麻醉后的小鼠固定在加热垫上。将导管（连接于软管的注射针头）插入尾静脉，并注射荧光造影剂（例如，2 nmol，最大注射体积为 5 ml/kg 体重，即，30 g 小鼠注射 150 µl）。</li>
	<li>对毛发较多的小鼠进行扫描前，需预先去除扫描区域的毛发。可使用剃毛器或脱毛膏进行脱毛。某些品系的小鼠可能对脱毛膏产生皮疹反应，因此应密切观察小鼠皮肤变化，必要时联系兽医人员进行处理。在使用新的小鼠品系时，应先在少量动物中测试其耐受性。</li>
	<li>在进行 µCT 和 FMT 成像期间，需持续保持小鼠处于麻醉状态（2% 异氟烷，空气流速 1 L/min）。</li>
</ol>
3. 小鼠垫料准备
注意：对于 µCT-FMT 扫描，请使用一种适用于小鼠的多模态床，该床可同时适配 µCT 和 FMT 设备。
<ol>
	<li>成像前，使用湿巾清洁小鼠床。请勿使用乙醇，因为这可能会损坏亚克力玻璃。确保标记物上无水分，因为水分可能影响自动标记检测。</li>
	<li>拧开多模态小鼠床的螺丝，取下上半部分。</li>
	<li>将麻醉气体管连接至小鼠床上，并用胶带固定。</li>
	<li>将已麻醉的小鼠放入小鼠床中，并将鼻部插入气体管内。确保小鼠头部位于小鼠床前端的指示位置（图&#160;1）。</li>
	<li>确保小鼠位于小鼠床中央，以充分利用FMT的视野。</li>
	<li>合上小鼠床并拧紧螺丝，使小鼠被牢固固定。通过目视监测胸式呼吸运动，确保小鼠能够稳定呼吸。</li>
</ol>
4. µCT 成像
注意：使用 µCT 进行全身扫描。生成的解剖学数据用于图像融合，以改善荧光重建并用于图像分析。
<ol>
	<li>将带有小鼠的鼠床放入 µCT 中。确保小鼠以“尾部优先”的方式进入 µCT，这对自动融合至关重要。</li>
	<li>为了在 µCT 盖子关闭时维持麻醉状态，需重新连接管路，使气体通过 µCT 机箱内部。首先将长管从鼠床端拆下，并连接至 µCT 外部的接口，然后将另一端连接至 µCT 内部的接口。</li>
	<li>将鼠床推入 µCT 中。确保气体管路固定牢靠，不会被旋转机架夹住。如有必要，可用胶带固定，并将管路插入鼠床支架的切口处。</li>
	<li>关闭 µCT 并采集定位像（topogram）。选择至少两个子扫描区域，以覆盖小鼠和鼠床的大部分区域，这对后续的图像融合与重建非常重要。</li>
	<li>选择名为 HQD-6565-360-90 的 µCT 扫描方案，该方案在一次完整旋转中采集 720 个投影，每个投影分辨率为 1032 × 1012 像素，每子扫描耗时 90 秒。X 射线管工作电压为 65 kV，电流为 1.0 mA。或者，为降低辐射剂量和扫描时间，可选择扫描方案 SQD-6565-360-29，该方案采集 720 个投影，分辨率为 516 × 506 像素，每子扫描耗时 29 秒。</li>
	<li>启动 µCT 扫描。蓝色进度条显示扫描进程，子扫描将依次进行。由于扫描时间仅几分钟，低体温和体液丢失不是问题。扫描过程中切勿打开 µCT 盖子，否则系统将自动中断扫描以保护用户免受辐射。</li>
	<li>扫描完成后，打开盖子，重新连接麻醉气体管路，并将鼠床从支架上取下，转移至 FMT 系统。</li>
</ol>
5. FMT 成像
注意：在完成 µCT 扫描后，将小鼠在 FMT 中以两种构型（正置和倒置）进行扫描，这两种构型联合用于优化荧光重建。
<ol>
	<li>打开麻醉气体供应（空气中含2%异氟烷，流速1 L/min），在将小鼠床放入FMT之前启动。使用FMT控制软件，创建包含适当数量受试对象的研究组即，小鼠）。选择用于成像的探针（对于未列出的新型探针，请使用 OsteoSense）。</li>
	<li>将多模态小鼠床连同小鼠一起移至FMT。长而柔韧的麻醉气体管可维持气体流动。在将小鼠床插入FMT之前，需小心移除气体管，因在FMT内部无需此管。避免转动小鼠床的螺丝。</li>
	<li>将小鼠床以红色指示端朝前（“头部朝前”）的方式放入FMT。这对于图像融合与µCT保持一致至关重要。</li>
	<li>关闭 FMT。</li>
	<li>选择正确的研究组和受试对象。选择FMT所需的通道（对于OsteoSense 750EX，使用750 nm通道）。</li>
	<li>添加描述， 例如“上”或“下”，然后按“Capture”以获取概览扫描图像，该操作将捕获整个视野的反射图像。请确保未选中“仅反射图像”选项，否则将无法后续获取3D扫描图像。</li>
	<li>调整3D扫描的成像参数。扩大视野范围，尽可能包含更多的小鼠身体。通常情况下，头部和尾部无法完全纳入视野范围内。点击“高级”并检查成像设置。将采样密度设为3 mm，灵敏度设为正常，照明最小值/最大值分别设为5000和50000。</li>
	<li>单击“添加到重建队列”，然后单击“扫描”以开始FMT扫描。扫描过程大约需要5至15分钟，具体时间取决于小鼠的大小和厚度，因为较厚的样本需要更长的曝光时间。该设备配备有加热成像室，以防止动物体温过低。</li>
	<li>扫描完成后，将小鼠及其所在的鼠床一同翻转，然后进行第二次扫描。这将为荧光重建提供额外的数据。</li>
	<li>当 µCT 和 FMT 扫描完成且小鼠从麻醉中苏醒后，不得将其无人看管，直至其恢复足够的意识状态。 例如，走动或保持胸卧位。</li>
</ol>
6. 图像融合与重建
注意：完成 µCT-FMT 扫描后， 例如在研究结束时，需要对获取的数据进行分类，以实现自动化的图像融合和荧光重建。
<ol>
	<li>为便于后续处理，先创建一个用于该研究的文件夹。针对每次 µCT-FMT 扫描，创建一个子文件夹，其名称应包含小鼠编号和时间点。 例如., M01_02h</li>
	<li>每次进行 µCT-FMT 扫描时，将 FMT 扫描文件（上、下）导出为 .fmt 格式，并保存至子文件夹中，文件名以“_up.fmt”或“_down.fmt”结尾。每个 .fmt 文件包含采集的原始数据。 即相机采集的激发和发射图像、曝光时间等元数据，以及FMT生成的荧光重建结果。</li>
	<li>使用 µCT 软件创建各向同性体素尺寸为 35 µm 的重建图像。选择平滑重建核（T10）。调整视野范围，确保覆盖整个小鼠床及其标记物。选择 MIFX/RAW 作为输出格式，并开始重建。重建完成后，将 µCT 重建文件移至 µCT-FMT 扫描的子文件夹中。</li>
	<li>导出所有扫描的µCT和FMT数据。确保每个子文件夹包含两个.fmt文件（上行和下行）以及以MIFX/RAW格式保存的µCT重建数据。为检查完整性，请选择菜单-&#62;CT-FMT-&#62;使用 Imalytics Preclinical 软件检查完整性。系统可能会显示一系列错误，例如缺少 .fmt 文件或 µCT 重建文件。请修正这些错误并重新检查完整性，直至所有错误均被排除。</li>
	<li>使用菜单-&#62;CT-FMT-&#62;设置中，检查 Definiens 软件的服务器名称，并在必要时进行调整。默认设置为 http://localhost:8184，前提是 Definiens 软件安装在同一台计算机上。下一步需要使用 Definiens 软件，以实现对小鼠垫和标记物的自动分割。</li>
	<li>点击菜单-&#62;CT-FMT-&#62;在Imalytics Preclinical软件中对组别进行融合，以对整个研究执行自动的µCT-FMT融合。每例µCT-FMT扫描的融合过程耗时数分钟，并在研究文件夹旁生成一个以“Package”为后缀的文件夹。该文件夹包含一组较小的、与后续分析相关的文件（包括µCT数据和融合后的厂商提供的FMT重建结果）。</li>
	<li>点击菜单-&#62;CT-FMT-&#62;在Imalytics Preclinical软件中重建FMT组以执行荧光重建，包括生成吸收和散射图13. 尽管处理过程由 GPU 加速20每次重建所需时间为1至4小时，具体取决于小鼠的大小。结果将存储在程序包文件夹中。注意：为了提高通量，我们目前在配备56个GPU的GPU集群上执行这些重建。</li>
</ol>
7. 图像分析
注意：要从图像数据中提取定量测量结果，需要对病灶和器官进行分割。
<ol>
	<li>所有数据集融合并重建后，使用 Imalytics Preclinical 软件对每个 µCT-FMT 扫描创建分割。</li>
	<li>加载µCT文件作为底层，荧光文件作为叠加层。按下“3D”以开启体渲染并检查数据集。</li>
	<li>要分割肺部，请点击菜单-&#62;课程分类&#62;添加类别并创建一个名为“tmp”的类别。此操作也可通过上下文菜单完成。创建新类别后，系统将自动将其设置为后续分割操作的输出类别。
	<ol>
		<li>对 µCT 数据集执行阈值分割操作，以分割出所有低强度区域（点击菜单-&#62;分割-&#62;阈值分割-&#62;下方并输入600。此时，tmp类包含小鼠外部的空气以及肺组织。</li>
		<li>创建一个“Lung”类。执行“填充区域”操作（右键点击肺部区域，然后选择菜单-&#62;填充区域-&#62;填充区域无限制），以将肺与外界空气分隔开。</li>
		<li>删除 tmp 类，因为它已不再需要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分割凸区域， 例如，膀胱，使用涂鸦模式。首先创建一个类别“Bladder”。
	<ol>
		<li>按 F1 键可删除所有涂鸦。</li>
		<li>使用计算机鼠标绘制涂鸦线条以勾勒膀胱的边界。</li>
		<li>按 F3 键可将涂鸦所包围的区域填充为临时遮罩，该遮罩以红色叠加形式显示。在任意切片方向上逐步添加更多涂鸦，并反复按 F3 键，直至达到足够的精度。通常情况下，在 10 个切片中绘制涂鸦即可满足要求。</li>
		<li>按 F4 键将临时蒙版保存为“Bladder”。</li>
		<li>以相同方法对心脏和肾脏等其他凸形区域进行分割。许多区域， 例如例如，胃或肝脏等器官可用若干凸形区域来近似。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了分割脊柱，首先创建一个“Bone”类。
	<ol>
		<li>选择上下文菜单&#62;阈值化-&#62;上方用于执行阈值操作，以分类所有明亮的体素（例如，高于1,600）标记为“Bone”。</li>
		<li>区域填充操作会因脊柱与骨骼的许多其他部分相连而无法实现分割， 例如，肋骨。通过反复绘制涂鸦并按 F2 键，进行数次切割操作，将脊柱与颅骨、肋骨和骶骨分离。</li>
		<li>最后，创建一个“Spine”类，并执行区域填充操作以获取脊柱（右键点击脊柱内部，选择上下文菜单-&#62;填充区域-&#62;填充区域无限制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分割结果保存为 µCT-FMT 扫描子文件夹中的文件，使用一致的命名方式。 例如,&#160;organs.seg，以实现批量处理。</li>
	<li>选择菜单-&#62;统计学&#62;类别统计（叠加），用于生成包含每个类别的平均荧光强度、体积以及总量（平均值与体积的乘积）的电子表格。</li>
	<li>要生成包含所有 µCT-FMT 扫描各区域数值的单个电子表格，请点击菜单-&#62;批次-&#62;设置批次参数，然后点击菜单-&#62;批次-&#62;批次统计。这避免了创建和合并多个电子表格文件的工作量， 即，每次 µCT-FMT 扫描各对应一个。</li>
</ol>
8. 探针校准
<ol>
	<li>为计算探针的校准因子，需要进行多次已知不同探针含量的µCT-FMT模体扫描（参见步骤1.4）， 例如100 pmol、50 pmol、25 pmol 和 0 pmol。</li>
	<li>按照第4和第5节所述方法对模体进行扫描。对于模体扫描，还需在FMT中进行向上和向下的扫描。</li>
	<li>导出数据，并按照第6节所述进行融合与重建。</li>
	<li>使用每次扫描的µCT数据，通过阈值分割（高于1,200）和区域填充来分割包涵体。</li>
	<li>生成一个包含测量荧光值的电子表格，并将其相对于已知浓度进行绘图。计算线性回归拟合的斜率，该斜率即为探针的校准因子。</li>
</ol>

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Felix Gremse 是 Gremse-IT 的创始人和所有者，这是一家初创公司，与飞利浦以及亚琛工业大学实验分子影像系合作，提供用于医学图像分析的软件和服务。

我们描述并应用了一种多模态 µCT-FMT 成像方案。本研究使用了 commercially available 且 widely used 的 FMT 和 µCT 设备3,11,15–17,21。尽管该方案需要特定的 FMT 设备，但 µCT 设备可替换为具有相似功能和可比扫描参数的其他 µCT 设备，例如，其视野应足够大，以覆盖包含标记物的小鼠床。
粪便微生物移植（FMT）已被用于生物分布分析，而无需与µCT或MRI结合使用21然而，解剖学数据有助于提高可重复性，因为分割可以基于在µCT数据中可见的器官边界进行10虽然已开发出集成的 µCT-FMT 设备2,7，这些尚未商业化。此外，使用两种独立的设备可实现管道连接， 即第一只小鼠仍在进行FMT时，可对下一只小鼠进行µCT成像，以提高通量。
为了减轻人工工作量，我们进行自动化的标记点检测与融合。此外，小鼠的形状被自动分割，该信息显著改善了荧光重建效果11,13,22。为了实现定量荧光重建，需要吸收和散射图谱13,23。我们通过对µCT数据进行自动分割，并为多种组织类型（肺、骨、皮肤、脂肪和其余软组织）分配已知的散射系数，从而获得散射图谱24。随后，我们从光学原始数据中重建吸收图谱，这对于血流灌注良好的器官（如心脏和肝脏）尤为重要13,20。
在多个时间点对多只小鼠进行扫描会迅速产生大量需要分析的数据集。对于生物分布研究，每次 µCT-FMT 扫描都需要对多个器官进行分割。遗憾的是，由于小鼠在每次扫描时都需要重新放置到小鼠床中，因此无法重复使用之前的分割结果。我们使用本机构开发的一种交互式分割工具，但其他工具也可能适用25。我们采用基于体素的分割方法，因为与椭圆或立方体等简单几何形状相比，这种方法能更准确地匹配复杂器官的形态26。全自动的整体动物分割有助于进一步减少人工工作量27，但仍需借助交互式分割工具来修正分割错误。此外，自动分割工具很难准确预测病理等特殊情况。由于我们使用的是原位 µCT 扫描图像，某些器官（如脾脏）即使手动分割也非常困难。使用对比剂可能有助于改善分割效果，但存在耐受性问题，且在纵向成像过程中难以维持稳定的对比剂分布。
我们的模体研究表明，在荧光重建中利用形状信息可改善信号定位。 在体，早期时间点（15 分钟）也表现出类似的改善&#160;注射后），当大量探针已进入膀胱时。羟基磷灰石结合探针会在骨骼和关节处积聚。值得注意的是，这一过程发生得非常迅速， 即，信号在15分钟时已在脊柱处清晰可见&#160;注射后，这可能是由于探针分子量较低，能够快速渗出血管并扩散至靶区域。该探针与靶标羟基磷灰石共价结合，未结合的探针则被排出体外。在注射后6小时至24小时的后续时间点，脊柱区域的信号强度保持相对稳定，可能是因为几乎没有光能够深入小鼠体内导致荧光漂白。在本研究中，我们使用了750 nm通道，该通道在注射前获取的扫描图像中显示出较低的背景荧光。在较短波长下，背景信号会更高。28.
综上所述，我们描述了一种适用于市售FMT和µCT设备的多模态成像方案。我们证明了该联合成像方法在荧光重建方面具有优势。我们展示了如何通过交互式器官分割和批量处理，从大量图像数据中提取生物分布曲线。我们认为，这种标准化的工作流程可为药物开发及其他使用荧光标记探针的成像研究提供帮助。

荧光介导断层成像，也称为荧光分子断层成像（FMT），是一种有前景的技术，可用于定量评估在散射组织中的荧光分布，例如麻醉小鼠甚至人体组织，如乳房或手指关节。与允许以亚细胞分辨率成像浅表目标的非侵入性显微技术相比1，FMT 能够对数厘米深度内的荧光源进行三维重建，尽管分辨率较低2。目前已开发出多种靶向性荧光探针，可用于成像血管生成、细胞凋亡、炎症等过程2–5。部分探针具有可激活特性，例如通过特定酶的切割作用使荧光染料去淬灭。此外，表达荧光蛋白的报告基因也可用于成像，例如追踪肿瘤细胞的迁移6。
FMT 与解剖成像模式相结合可显著获益， 例如，µCT2,7 或 MRI8虽然独立的粪便微生物移植（FMT）设备已有商业化产品9荧光图像若缺乏解剖学参考信息，则难以解读。近期我们已证实，融合的解剖图像数据可实现更可靠的分析10解剖学数据还可用于提供先验知识，例如小鼠的外部形状，这对于精确的光学建模和荧光重建至关重要11此外，可通过组织类型的分割及为各类别分配特定的系数来估计光学散射和吸收图谱。12,13对于近红外光，除黑色素和毛发外，血红蛋白是小鼠体内的主要吸收物质14由于相对血容量在不同区域差异可达几个数量级，因此吸收图对于定量荧光重建尤为重要。13.
使用非侵入性成像设备的一个优势在于能够对小鼠进行纵向成像， 即， 在多个时间点进行。这对于评估探针的动态行为至关重要， 即， 靶向富集、生物分布与排泄10,15或评估疾病进展16在对多只小鼠进行多个时间点成像时，会产生大量的图像数据集。为确保可比性，这些数据应以系统化的方式采集。 即，需采用明确且有文献记录的方案。大量的扫描图像为图像分析带来了挑战，而图像分析是从未处理图像数据中提取定量测量结果所必需的。
本研究旨在详细介绍我们在此前多项研究中使用并优化的µCT-FMT成像方案10,13,15,17,18。我们描述了数据集的生成、处理、可视化和分析方法。本文以一种已建立的分子探针OsteoSense为例进行说明，该探针可结合羟基磷灰石19，用于骨疾病和骨重建的成像2。所有涉及动物的实验程序均经政府动物护理审查委员会批准。

<table><tbody><tr><td>FMT（荧光分子断层成像）FMT2500 LX</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT2000</td><td>荧光分子断层成像设备</td></tr><tr><td>&amp;micro;CT（微型计算机断层扫描）Tomoscope Duo</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Tomoscope Duo</td><td>微型计算机断层扫描设备</td></tr><tr><td>多模态小鼠载物床</td><td>CT Imaging GmbH</td><td>Experimental builder</td><td>部分透明的动物固定装置</td></tr><tr><td>IsoFlo（异氟烷，USP）</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td>异氟烷吸入麻醉剂</td></tr><tr><td>小动物麻醉系统</td><td>Harvard apparatus</td><td>726419</td><td>完整的台式异氟烷麻醉系统</td></tr><tr><td>无叶绿素小鼠饲料</td><td>Ssniff</td><td>E15051</td><td>低叶绿素/低荧光饲料</td></tr><tr><td>OsteoSense 750EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10053EX</td><td>动物用FMT对比剂</td></tr><tr><td>Portex细孔聚乙烯导管</td><td>Smith medical</td><td>800/100/120</td><td>注射导管用管路</td></tr><tr><td>Sterican 30g</td><td>BBraun</td><td>4656300</td><td>导管用皮下注射针头</td></tr><tr><td>Imeron</td><td>Altana pharma</td><td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td><td>用于模体嵌入物的CT对比剂</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>90-12-36-6</td><td>用于模体制备的琼脂糖</td></tr><tr><td>TiO2</td><td>Applichem</td><td>A1900,1000</td><td>作为模体散射剂的二氧化钛</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Fluka</td><td>93595</td><td>用于调节模体光传播特性的台盼蓝</td></tr><tr><td>Cy7</td><td>Lumiprobe</td><td>15020</td><td>用于模体嵌入物的荧光染料</td></tr><tr><td>Lipovenoes 20%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3094740</td><td>脂质乳剂，FMT对比剂中的散射剂</td></tr><tr><td>Definiens Developer XD Server</td><td>Definiens AG</td><td>Server XD</td><td>用于自动分割的软件平台</td></tr><tr><td>Imalytics Preclinical</td><td>ExMI/Gremse-IT</td><td>Version 2.0.1</td><td>用于图像融合、重建与分析的软件</td></tr><tr><td>NVIDIA Geforce Titan</td><td>Asus</td><td>GTXTITAN6GD5</td><td>高端计算机显卡，6GB内存</td></tr></tbody></table>

混合 µct-fmt 成像与图像分析

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

荧光介导断层扫描（FMT）可实现荧光分布的纵向及定量测定 体内 可用于评估新型探针的生物分布，以及利用已建立的分子探针或报告基因评估疾病进展。与解剖成像模式相结合， 例如，微型计算机断层扫描（µCT）有助于图像分析和荧光断层成像重建。本文描述了一种多模态µCT-FMT成像的实验方案，包括提取定量测量结果所必需的图像处理步骤。在完成小鼠准备并进行成像后，对获得的多模态数据集进行配准。随后，执行改进的荧光重建，该重建过程考虑了小鼠的体形。为实现定量分析，利用我们开发的交互式分割工具，基于解剖学数据生成器官分割结果。最后，通过批量处理功能生成生物分布曲线。我们通过评估一种已知靶向骨骼和关节的探针的生物分布，展示了该方法的应用价值。

我们采用所述方案评估了一种靶向探针OsteoSense的生物分布，该探针可结合羟基磷灰石。对3只小鼠（C57BL/6 Apoe-/- Ahsg-/-双基因敲除小鼠，10周龄）在静脉注射2 nmol OsteoSense前后，以及注射后15分钟、2小时、4小时、6小时和24小时进行成像。我们的软件自动识别了多模态小鼠床中内置的标记物（图1，图2A,B），从而实现了µCT解剖数据与FMT荧光重建结果的融合（图2C,D）。由于OsteoSense是一种分子量较低的探针，预期会快速经肾排泄，因此在膀胱中信号较强。FMT荧光重建的融合结果显示存在信号定位偏离膀胱等异常情况（图2C,D）。此类问题的产生是由于FMT不了解小鼠的真实形状，而默认采用方块形模型。我们的重建方法利用µCT数据确定精确的小鼠外形，并生成散射和吸收图谱13，从而实现更准确的荧光重建，改善信号定位，这一优势在膀胱区域尤为明显（图2E,F）。
为了将重建的荧光信号分配至相应区域，我们使用软件对多个器官进行了交互式分割（图 3）。对于全部18次扫描，根据以下7个区域进行分割 µCT 数据, 即心脏、肺、肝、肾、脊柱、肠和膀胱。随后，利用软件计算每个区域的平均荧光浓度，共126个区域。幸运的是，该软件提供批量处理模式，可自动计算所有数值并将其保存于单个电子表格中。
为了可视化荧光分布，使用相似的窗宽设置对每个时间点生成了三维重建图像（图 4A-F）。基于定量得到的器官数值，通过计算三只小鼠器官数值的平均值来确定生物分布情况（图 4G）。注射前采集的预扫描图像显示背景信号可忽略不计。注射后15分钟，由于肾脏快速排泄，膀胱中出现最强信号。在后续的时间点，残留探针在骨骼和关节处逐渐积累。
<img alt="Tomography setup with μCT tubes and markers; FMT indicator and mouse imaging results." src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 多模态小鼠床。 (A多模态小鼠固定板包含两块丙烯酸玻璃板，可牢固固定小鼠，通过两个螺丝调节紧固程度。固定板上设有用于图像融合的标记（空孔）。麻醉气体通过一根柔性导管输送，并用胶带固定。B小鼠床被固定在金属支架上，并置于旋转中心 µCT 机架。C) 避免小鼠床与金属支架之间出现间隙，否则可能导致标记物错误匹配，从而引起错误融合。麻醉气体管路应连接至管路连接器。D) 将小鼠床推入FMT时应先插入前端，以确保正确的自动融合。（E）FMT相机可观察到标记物，用于自动标记物检测与融合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡分割、融合与重建；带标记的成像分析示意图。" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 图像融合与重建。 （A, B）通过自动分割算法确定标记物及小鼠的外部轮廓。（C, D）注射 OsteoSense 后 15 分钟，已有大量探针排泄至膀胱。将厂商提供的重建结果与 µCT 数据融合后，问题显现出来：大部分信号出现在膀胱周围而非膀胱内部，部分信号甚至出现在空气中。此现象的原因为 FMT 假设小鼠为块状结构。（E, F）我们改进后的荧光重建方法利用 µCT 数据获取的小鼠形状，使膀胱内部的荧光信号定位更加准确。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Anatomy CT scan analysis; segmented organ visualization; radiological image data study." src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 器官交互式分割。 (A为了量化荧光分布，对多个器官进行分割：心脏（红色）、肺（粉红色）、肝脏（棕色）、胃（米色）、脊柱（紫色）、肾脏（黄色）、肠道（绿色）和膀胱（金色）。B肺部与周围组织对比明显，采用阈值分割和区域填充法进行分割。C) 膀胱、肾脏和心脏等圆形器官使用“涂鸦”法进行分割。D形状较为复杂的器官， 例如肝脏和胃通过涂鸦方式逐步分割。为了分割脊柱，应用高阈值分割所有骨骼，然后去除部分骨骼， 例如肋骨被切除，直至仅剩脊柱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Biodistribution analysis, urine excretion, bladder, timed imaging, and concentration graph." src="/files/ftp_upload/52770/52770fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 生物分布 为评估生物分布，对小鼠在多个时间点进行扫描（A-F). (A注射前的预扫描显示750 nm通道的背景信号很低。B注射后15分钟，已有相当数量的探针进入膀胱。C在2小时时间点，小鼠已排尿，导致部分荧光出现在小鼠体外。在后续时间点（D-F信号主要出现在骨骼和关节处， 即脊柱和膝盖处。G选定器官的定量荧光浓度如图所示。

我们介绍一种结合荧光介导断层成像（FMT）与微型计算机断层扫描（µCT）的融合成像方案。在完成图像融合与重建后，进行交互式器官分割，以提取荧光分布的定量测量数据。

混合 µCT-FMT 成像与图像分析

荧光介导断层扫描（FMT）能够实现体内荧光分布的纵向和定量测定，可用于……

荧光介导断层成像是一种高灵敏度的成像技术，可用于定量评估荧光分布。在麻醉小鼠中，已有多种靶向荧光探针可供使用，能够实现对血管生成、细胞凋亡、炎症等过程的成像。在本视频中，我们将展示本机构如何开展FMT与Micro City的融合成像。在第一章中，这些设备是我们的 F-M-T-F-M-T，代表荧光分子断层成像。断层成像意味着可生成三维图像。FMT 对小鼠体内近红外荧光成像具有高灵敏度。现在打开前面板以显示 FMT 内部结构。底部是一个安装在二维伺服器上的激光器。该激光器向小鼠体内发射光线，小鼠被固定在一个半透明的小鼠固定床中。小鼠床层上方配备了一组LED，作为替代光源，可使FMT作为常规反射成像设备运行。滤光轮安装在镜头下方，用于采集来自设备顶部探测器的光线。这是我们的微型CT。微型CT配备有两个X射线管和两个平板探测器，可实现双能量扫描。第二章，微型CT与FMT扫描方案。微型CT和FMT均用于小鼠成像，成像前需使用异氟烷对小鼠进行麻醉。进行FMT扫描时，需要去除小鼠的毛发，使用鲱鱼霜（herring cream）效果较好。某些品系的小鼠可能对脱毛霜（deha cream）产生皮疹。因此，建议监测小鼠皮肤变化，必要时联系兽医人员进行处理。此外，首次使用任何新小鼠品系时，应先对小批量动物进行耐受性测试。为避免低体温，将小鼠置于加热垫上。由于尾静脉较细，需通过导管插入尾静脉以注射对比剂。这相当困难，需要一定的经验。如果血液回流到导管中，则说明导管位置正确。可注射荧光造影剂和CT造影剂，以避免容量超负荷。最多注射每公斤体重5毫升，即对于一只30克重的小鼠，注射量为150微升。进行扫描时，将小鼠置于多模态小鼠床内。小鼠的尾巴上可能已绘制了一些用于识别的标记。应避免在躯干上做此类标记，因为它可能影响光学扫描。关闭小鼠固定床，并调节深度，以牢固地将小鼠固定在指定位置。操作时需小心并监测呼吸，因为床铺过紧可能导致小鼠窒息。由于免疫抑制特性，裸鼠常被用于肿瘤学研究。其无毛特征是基因突变带来的一个有利的副作用。因此，可以省略繁琐的脱毛步骤。应检查小鼠呼吸是否正常，必要时相应调整小鼠床的位置。然后将小鼠床放入微型CT中。用于输送ISO氟气的管道已切换，以维持设备内部的气体流动。然后关闭微C装置，以启动X射线屏蔽。只有在盖子关闭的情况下，微C才会开始扫描。使用微型CT设备上的按钮，可将小鼠送入微型CT扫描仪中。在微型CT控制计算机上获取并显示定位像，调整窗宽窗位设置以更清晰地观察小鼠。可设置一个或多个ZUP扫描，其位置由浅蓝色区域标示。通常进行一到三次 ZUP 扫描就已足够。开始扫描后，将以深蓝色进度条显示进度。我们的平板微计算机断层扫描仪按顺序依次进行 ZUP 扫描，这与临床螺旋 CT 不同。通过按钮将小鼠载物台移至前方。再次打开屏蔽盖，切换麻醉管。小心地将固定器从小鼠载物台上取下，并拔出麻醉管。这是必要的，因为麻醉鼻（AN）和面罩转接器（FMT）并不依赖于这根小管。实际上，FMT 内部的小型腔室会被麻醉气体充满。现在将带有小鼠的鼠床移至 FMT 上，并在 FMT 控制计算机上进行插入。调整扫描视野以及采样密度。通常使用约120个点。按下按钮后开始扫描。FMT 的第一次扫描会为每个激光光源点获取透射照明或激发图像。本视频以快进模式展示，通常需要约五分钟。可以观察到，与下半身相比，穿过上半身的光线要少得多。这是因为具有较高相对血容量的器官，如心脏、肝脏和肾脏，主要位于上半身。血液是近红外光的主要吸收物质。第二次扫描采用相同的源点但使用不同的滤光片，该滤光片仅允许荧光通过。第三章，交互式油相与分割。为融合两台设备的数据，使用了内置于小鼠床中的标记物。这些标记物在FMT获取的反射图像中同样可见。这些标记物实际上是简单的孔洞，无需填充任何荧光剂或CT对比剂。在我们研究所，我们开发了一款软件程序，可自动完成标记物的检测与融合。小鼠的外形，以及异质性吸收和散射图，均通过微计算机断层扫描（micro CT）数据自动估算，方法详见我们近期发表在 Theranostics 的文章。这些参数对于定量荧光重建至关重要。为了测量荧光的生物分布，需要进行器官分割。我们通过本机构开发的名为 imulitic preclinical 的软件，在下文中以交互方式生成此类分割。该过程以快进形式展示，有经验的操作者可在大约 10 到 20 分钟内完成。首先，加载 CT 数据集。可以使用ISO表面渲染在三维中进行观察。通过更改窗宽窗位设置，可以改变ISO值。例如，若要可视化包含小鼠垫的整只小鼠的骨骼，则需加载叠加图像。本示例的信号出现在膀胱区域。现在关闭叠加显示，以便专注于解剖结构的分割。在原位显微扫描中，由于肺部与其他软组织之间存在强烈的负对比度，肺部很容易被识别。肺部内部较大的结构是心脏。我们先对肺部进行分割。通过阈值分割低于某一特定值的所有体素，该部分显示为绿色。肺部是一个连通区域，可通过填充操作将其分离。类似于绘图程序中的油漆桶工具。可以通过切割和填充将目标区域与肺部分开。对于膀胱等凸形器官，可通过绘制涂鸦来勾勒器官的边界，从而实现分割。继续添加更多涂鸦，直至达到足够的准确性。非凸形器官（如肠道）可以逐段分割。肝脏表现为一个均质区域，但具有更复杂的结构。由于它由多个叶组成，因此可以将分割结果保存到磁盘并加载到程序中。利用此类分割，可将荧光信号分配至各个器官。程序会计算这些信号量，并将其作为额外的工作表保存。对于纵向扫描，需要对每个时间点重新进行分割，因为通常时间间隔过长，无法使小鼠在固定位置持续保持麻醉状态。因此，如果涉及大量小鼠和多个时间点，分割工作将非常耗时。为了量化结果，请加载一个叠加图像和一个分割图像，然后单击“设置批处理参数”以使程序记住当前设置。现在，点击“批量统计”以让程序计算所有微CT FMT扫描中各个区域的数值。此过程需要几秒钟。随后，统计结果将保存在一个电子表格文件中。这非常方便，因为用户无需手动合并数十个文件。根据此文件，可计算出器官的曲线。第四章，代表性结果。为了测试融合效果是否正常，我们使用了一个 aros 模体。添加了一些二氧化钛粉末以实现散射。为了形成不规则形状，我们切除了一部分。在模体中构建了多个充满荧光物质和CT对比剂的小型包埋物。由于FMT无法获知物体的真实形状，而是假设其为简化的几何形状，因此对于不规则形状的物体，重建结果并不准确。为此，我们实现了另一种重建方法，该方法利用来自微型CT数据所获得的形状信息进行重建。如您所见，模体中的信号定位效果要好得多。为了检查体内数据，我们依次查看各成像时间点。这是扫描前的图像。我们看到的基本上只是噪声和伪影。如果切换到下一个时间点，即注射后的图像，会看到信号明显增强，但窗宽窗位设置过高。通过使用窗宽窗位调节对话框，可以调整这些设置。我们在膀胱中观察到大部分信号。如果查看注射后0.2小时的下一个时间点，会看到小鼠体外存在一些信号。这是因为小鼠已将荧光物质排尿至小鼠垫上。通过进一步调整窗宽，我们可以观察到脊柱和膝盖部位存在一些信号。现在让我们观察注射后0.4小时的时间点，此时尿液中的信号已消失，而在注射后6小时和24小时的后续时间点，我们观察到脊柱和膝盖部位出现荧光信号，情况相同。现在让我们转向下一个图像。使用这些窗宽窗位设置的扫描前图像显示无异常。注射后15分钟的扫描显示膀胱信号明显增强，依此类推。本研究中，注射后不久尿液膀胱中即出现高浓度信号，这是由于该探针快速经肾排泄所致。此外，脊柱区域的信号迅速升高，并在后续的成像时间点保持相对稳定。第五章，结论。综上所述，我们展示了一种多模态成像方案，可结合荧光成像、分子断层成像和微型计算机断层成像的优势。解剖学微CT数据可通过利用小鼠的形态形状，改善荧光信号的重建效果。此外，该数据还可用于生成器官分割结果，这对于从小鼠图像数据中提取定量测量信息至关重要。

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科研

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我们通过四维计算机断层扫描数据来分析关节运动学。该连续三维-三维配准方法可从四维计算机断层扫描数据中半自动地获取运动骨相对于固定骨的运动学参数。...

基于连续三维到三维配准的四维CT分析

中国香港的鲸豚搁浅救护项目已引入死后计算机断层扫描技术，该技术可为死亡动物的生物学健康状况和特征提供重要信息。本研究描述了8种图像重建技术，这些技术对于识别和可视化搁浅鲸豚的死后发现至关重要，将有助于全球的临床医生、兽医及搁浅救护人员充分运用这一放射学手段。...

死后计算机断层扫描中的图像渲染技术：搁浅鲸类生物健康与特征评估

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

动态计算机断层血管成像（CTA）在表征主动脉内漏方面提供了额外的诊断价值。本方案介绍了一种利用时间-密度曲线分析对内漏进行定性和定量评估的方法。同时展示了将动态CTA成像与透视技术通过2D-3D图像融合相结合的技术，以在治疗过程中实现更优的影像引导。...

时间分辨动态计算机断层血管成像用于表征主动脉内漏及指导治疗 通过 2D-3D 融合成像

学习混合μCT-FMT成像技术，用于麻醉小鼠体内荧光分布的定量评估。该方法结合荧光分子断层扫描与显微计算机断层扫描，通过交互式器官分割实现精准数据分析，为神经科学研究提供功能与解剖信息。

混合 µCT-FMT 成像与图像分析

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