胞外DNA释放的高通量测量和人中性粒定量NET形成体外

该程序的总体目标是以高通量规模定量从人中性粒细胞释放的中性粒细胞细胞外陷阱或 NET。这里介绍的方法可以通过研究人中性粒细胞体外中性粒细胞胞外陷阱形成的机制和调节来帮助回答炎症和改变炎症性疾病领域的关键问题。该技术的意义涉及识别中央 NET 介导的信号通路和 NET 抑制或 NET 刺激分子。

为了从血液中分离中性粒细胞，将 20 毫升人血分装到 250 毫升锥形管中。加入 10 mL 6% 葡聚糖，然后轻轻混合，让溶液在室温下静置 20 分钟。小心地将富含白细胞的上层相转移到干净的 50 毫升锥形管中，并使用无菌 PBS 将管填充至顶部。

然后以 400 倍 G 离心样品 10 分钟，并使用 15 毫升无菌 PBS 重悬沉淀。再重复一次此洗涤步骤。接下来，在 215 毫升锥形管中准备 85%、80%、75%、70% 和 65% 的五步 percoll 梯度，并在每个梯度的顶部放置 2 毫升白细胞悬液。

然后，将梯度以 800 x G 离心 30 分钟，并断开。离心后，在 75-80% 和 70-75% 界面处收集细胞。使用 PBS 洗涤细胞两次，然后使用血细胞计数器对细胞进行计数。

为了测量细胞外 DNA 释放的动力学，在检测培养基中制备浓度为 2 倍 10 至 6 个细胞/毫升的中性粒细胞悬浮液。每升 SYTOX 橙加入 5 微摩尔 SYTOX 橙，SYTOX 橙是一种膜不渗透的 DNA 结合染料，并轻轻混合。将人嗜中性粒细胞分装到无菌 96 孔黑色透明底部微孔板中，确保检测培养基覆盖整个孔底。

如果没有，请轻轻敲击板的侧面。将盘子在 37 摄氏度下加热 10 分钟。同时，使用 37 摄氏度测定培养基制备含有其最终浓度两倍的刺激物的溶液。

作为阳性 NET 对照，制备 100 纳摩尔佛波尔肉豆蔻酸酯乙酸盐或 PMA，以处理人中性粒细胞 4 小时以触发最大 NET 释放。接下来，准备用于测量的微孔板荧光计。通过将 50 μL 刺激溶液添加到 50 μL 中性粒细胞悬液中来刺激中性粒细胞。

向一个孔中加入终浓度为 0.5 毫克/毫升的皂苷，以测量最大 DNA 释放信号。将板放入读数仪中，每隔两分钟测量一次荧光变化，持续 4 小时，不要摇晃。为了分析数据，通过从包括皂苷在内的所有孔的终点值中减去基线荧光来计算荧光随时间的标准化增加。

皂苷荧光的上升应该是最高信号，称为最大 DNA 释放。对重复的结果进行平均，并将其表示为最大 DNA 释放的百分比。要使用 MPO-DNA 和 HNE-DNA ELISA 测定定量 NET 形成，请将抗 MPO 或抗 HNE 捕获抗体添加到 96 孔高结合载量 ELISA 板中，并孵育过夜以包被。

第二天早上，使用每孔 200 微升 PBS 洗涤 ELISA 板 3 次。然后使用 200 微升 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.1% 人血清白蛋白 （HSA） 在室温下封闭孔 2 小时。同时，将嗜中性粒细胞以每孔 100， 000 个细胞的密度接种在 96 孔板上的 100 微升测定培养基中，并在 37 摄氏度下孵育 4 小时，在添加刺激后诱导 NET 形成。

接下来，向嗜中性粒细胞上清液中每毫升添加 2 单位的 DNAse 进行有限 DNase 消化，然后充分混合并在室温下孵育 15 分钟。然后，加入 15 微升 25 毫摩尔 EGTA 终止反应并充分混合。收集上清液和清洁微量离心管，并在 300 倍 G 和室温下旋转样品以去除细胞碎片 5 分钟。

在没有限制消化的情况下收集 NET 会导致数据不一致。有限的 DNA 消化步骤对于获得可重现的结果至关重要。因此，优化了 DNase I 酶的浓度和消化长度。

将上清液转移到干净的微量离心管中并保持在冰上。然后，使用先前制备的 NET 标准品的等分试样，在 PBS 和 EGTA 中制备 1 到 2 稀释液。现在，使用含 EGTA 的 PBS 将 DNase I 消化的样品稀释 20 倍，并将其分装在涂有捕获抗体的 ELISA 板上。

将板在 4 摄氏度下孵育过夜。在使用 PBS 洗涤板 3 次之前，每孔涂抹 100 微升检测抗体溶液，如辣根过氧化物酶偶联的抗 DNA 抗体，并在黑暗中孵育 1 小时。用 PBS 洗涤四次后，每孔添加 100 μL TMB 过氧化物酶底物，并孵育 30 分钟。

蓝色表示过氧化物酶活性和 NETs 的存在。为了终止反应，加入 100 微升一摩尔的 HCL。蓝色溶液将变为黄色。

使用微孔板光度计，读取 450 纳米处的吸光度。为了将测得的 MPO-DNA 或 HNE-DNA 复合物的量与 NET 标准品进行比较，从所有样品中减去背景最佳密度，并绘制稀释标准品样品的吸光度值与其相对 NET 含量的关系图。使用此标准曲线的非饱和范围，使用所用软件的最佳指数拟合建立趋势线。

将未知物的测量 OD 值插入趋势线方程中，该方程将给出未知样品中 NET 的数量，作为 NET 标准品的百分比。最后，计算重复的平均值，并将最终数据表示为 MPO-DNA 或 HNE-DNA 复合物的量。此处显示的是未经 PMA 或 P-铜绿假单胞菌刺激或激活的人中性粒细胞的基于荧光的 DNA 释放测定的代表性数据。

P-铜绿假单胞菌触发人类 PMN 中的 NET 形成。该图表明，计算了复制孔荧光增加的平均值，根据最大荧光进行归一化，并表示为 DNA 释放。这些荧光图像代表未经 PMA 处理或刺激的中性粒细胞。

此处显示的是来自 MPO-DNA 和 HNE-DNA Elisa 测定的未刺激、PMA 和 PA01 活化的人中性粒细胞的免疫荧光图像。细胞外 DNA 显示典型的 NET 形态，并与 MPO 和瓜氨酸组蛋白 H4（NET 形成的标志物）共定位。该实验显示使用相同的测定法在人中性粒细胞中释放 MPO-DNA 和 HNE-DNA。

NET-标准品平均含有 19.5 μg /mL 的细胞外 DNA、399 ng/mL 的 MPO 和 103.4 ng/ml 的 HNE。根据 MPO 和 HNE 的分子量，即 1 微克 DNA 含有 9.91 乘以 10 到 14 个核苷酸，NET 标准品每 1， 000 个核苷酸包含 109 个 HNE 分子和 147 个 MPO 分子。最后，NET 标准品的两次连续稀释实验表明，MPO-DNA 和 HNE-DNA ELISA 检测的动态范围在 19 至 609 ng/mL DNA 之间。

一旦掌握，SYTOX 橙基酸可以在一小时内轻松快速地组装，第二天即可获得结果。NET 定量分析也易于执行，如果作正确，将在第二天获得数据。观看本视频后，您应该对如何以高通量方式定量人中性粒细胞中的自然化酶有很好的了解。