高通量检测人中性粒细胞胞外DNA释放及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的定量分析 体外

本实验的总体目标是以高通量方式定量人中性粒细胞释放的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）。本文所介绍的方法有助于通过研究人中性粒细胞体外形成NETs的机制及其调控，回答炎症及炎症相关疾病领域中的关键科学问题。该技术的应用意义在于识别介导NET形成的核心信号通路，以及发现抑制或促进NET形成的分子。

为了从血液中分离中性粒细胞，将20毫升人血分装至250毫升锥形管中。加入10毫升6%右旋糖酐，轻轻混匀，室温静置20分钟。小心将富含白细胞的上层液体转移至干净的50毫升锥形管中，并用无菌PBS加至管顶。

然后以400 × g离心样品10分钟，并用15毫升无菌PBS重悬沉淀。重复此洗涤步骤一次。接下来，在215毫升锥形管中制备85%、80%、75%、70%和65%的五层Percoll梯度，将2毫升白细胞悬液分别加在每层梯度上方。

然后，以800 × g离心30分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，收集75-80%与70-75%界面层中的细胞。用PBS洗涤细胞两次，然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。

为了测定细胞外DNA释放的动力学，用检测培养基制备中性粒细胞悬液，细胞浓度为每毫升2 × 10⁶个细胞。加入5 µmol/L的SYTOX Orange（一种不能穿透细胞膜的DNA结合染料），轻轻混匀。将人中性粒细胞分装至无菌的96孔黑色透明底微孔板中，确保检测培养基完全覆盖每个孔的底部。

如果未混匀，可轻轻敲击培养板侧面。将培养板在37摄氏度下温育10分钟。在此期间，使用37摄氏度的检测培养基配制刺激物溶液，浓度为所需终浓度的两倍。

作为 NET 的阳性对照，配制 100 纳摩尔的佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA），用于处理人中性粒细胞 4 小时，以诱导最大程度的 NET 释放。接下来，准备微孔板荧光计进行检测。通过向 50 微升中性粒细胞悬液中加入 50 微升刺激液来刺激中性粒细胞。

向一个孔中加入终浓度为 0.5 毫克/毫升的皂苷，以测量最大 DNA 释放信号。将培养板放入检测仪中，在四小时内每隔两分钟检测一次荧光变化，期间不进行振荡。分析数据时，通过从包括皂苷孔在内的所有孔的终点荧光值中减去基线荧光值，计算随时间变化的归一化荧光增加量。

皂苷荧光强度的升高应为最高信号，被称为最大DNA释放量。将重复实验的结果取平均值，并以最大DNA释放量的百分比形式呈现。为了利用MPO-DNA和HNE-DNA ELISA检测定量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，需将抗MPO或抗HNE捕获抗体加入96孔高结合力ELISA板中，并于4℃孵育过夜以完成包被。

次日早晨，每孔加入 200 µL PBS，洗涤 ELISA 板 3 次。随后每孔加入 200 µL 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% 人血清白蛋白（HSA）的溶液，在室温下封闭 2 小时。与此同时，在 96 孔板中每孔加入 100 µL 检测培养基，以每孔 100,000 个细胞的密度接种中性粒细胞，并加入刺激物后于 37°C 培育 4 小时以诱导 NET 形成。

接下来，通过向中性粒细胞上清液中加入每毫升2单位的DNA酶进行有限消化，充分混匀后室温孵育15分钟。然后加入15微升25毫摩尔的EGTA以终止反应，并充分混匀。收集上清液至洁净的微量离心管中，以300 × g离心5分钟，室温去除细胞碎片。

若未进行有限消化而直接收集中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），将导致数据不一致。有限DNA消化步骤对于获得可重复的结果至关重要。因此，已对DNase I酶的浓度和消化时间进行了优化。

将上清液转移至洁净的微量离心管中，置于冰上保存。然后，取一份先前配制的NET标准品，用PBS和EGTA进行1:2稀释。接着，使用含EGTA的PBS将DNase I消化的样品稀释20倍，并分装至包被有捕获抗体的ELISA板中。

将培养板在4°C下孵育过夜。使用PBS洗涤培养板三次前，每孔加入100 µL检测抗体溶液（如辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体），避光孵育1小时。用PBS洗涤四次后，每孔加入100 µL TMB过氧化物酶底物溶液，孵育30分钟。

蓝色显色表明过氧化物酶活性及中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的存在。为终止反应，加入100微升1摩尔的HCl，蓝色溶液将变为黄色。

使用微孔板光度计，在450纳米处读取吸光度。为了比较所测得的MPO-DNA或HNE-DNA复合物的量与NET标准品的差异，需从所有样品中减去背景光密度值，并将稀释标准品的吸光度值对其相对NET含量作图。利用该标准曲线的非饱和范围，通过所用软件的最佳指数拟合建立趋势线。

将未知样品的测定OD值代入趋势线方程，即可得到未知样品中NETs含量相对于NET标准品的百分比。最后，计算重复样的平均值，并以MPO-DNA或HNE-DNA复合物的含量表示最终结果。此处展示的是基于荧光法检测人中性粒细胞DNA释放的代表性数据，细胞未经刺激或经PMA或铜绿假单胞菌（P-aeruginosa）激活。

铜绿假单胞菌（P-aeruginosa）可触发人中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）。该图显示，通过计算复孔荧光强度的平均增加值，并以最大荧光强度进行归一化，结果以DNA释放量表示。这些荧光图像代表未经处理或经佛波酯（PMA）刺激的中性粒细胞。

图中显示了非刺激、PMA 刺激以及 PA01 激活的人中性粒细胞的免疫荧光图像，来自 MPO-DNA 和 HNE-DNA ELISA 检测。细胞外 DNA 呈现典型 NET 形态，并与 MPO 及瓜氨酸化组蛋白 H4 共定位，后者是 NET 形成的标志物。本实验利用相同检测方法展示了人中性粒细胞中 MPO-DNA 和 HNE-DNA 的释放。

NET标准品平均每毫升含有19.5微克的胞外DNA、399纳克的MPO以及103.4纳克的HNE。根据MPO和HNE的分子量，以及每微克DNA含有9.91×10¹⁴个核苷酸的换算关系，该NET标准品中每1,000个核苷酸对应含有109个HNE分子和147个MPO分子。最后，对NET标准品进行两倍系列稀释实验表明，MPO-DNA和HNE-DNA ELISA检测方法的动态范围均为每毫升19至609纳克DNA。

一旦掌握，基于SYTOX orange的酸性检测方法可在一小时内快速完成组装，次日即可获得结果。NET定量检测实验操作也较为简便，若操作得当，次日即可获得数据。观看本视频后，您将充分理解如何以高通量方式对人中性粒细胞中的自然酶进行定量分析。