测量去泛素酶的活性细胞系和组织样品的方法

以下实验的总体目标是可视化细胞中去泛素化酶的活性。这是通过将细胞培养至高共流畅度并收获它们以促进浓缩裂解物的产生作为第二步来实现的。使用温和的机械裂解产生裂解物，以维持细胞质的代谢图像。

接下来，将酶与血凝素衍生的探针一起孵育，以便通过与活性位点半胱氨酸残基反应来标记 de ubiquitin 酶，结果显示了基于 Western blotting 和随后的化学发光检测的许多 de ubiquitin 酶的活性曲线。与常规蛋白质印迹等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许用户可视化多种酶的活性。在一项实验中，Ali 制备细胞培养基，将 30 毫升 dobe docos、改良的 eagles 培养基或 DMEM 加 10% 胎牛血清放入 50 毫升锥形管中进行培养。

用于实验的细胞将冷冻的 M 17 或 He A 细胞从液氮储存中转移到装有温水的小烧杯中。然后将细胞转移到含有 30 mL 培养基的 50 mL 锥形管中。接下来，向细胞瓶中加入一些培养基，并在解冻后 5 秒内转移重悬的细胞。

将细胞悬液以 450 Gs 离心 5 分钟，以获得细胞沉淀。然后将 20 mL 培养基加入 T 75 培养瓶中。使用抽吸从细胞中去除培养基。

向细胞沉淀中加入 5 毫升新鲜培养基，然后复苏 Suspend。将 5 mL 细胞悬液转移到 T 75 培养瓶中的 20 mL 培养基中，并在 37 °C 下孵育。每三天更换一次培养基以收获细胞。

通过抽吸去除培养基，注意不要接触细胞。用 5 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤细胞。使用抽吸去除 PBS。

接下来，向 T 75 培养瓶中加入 3 毫升 tripsin EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。孵育后，向培养瓶中加入 6 mL 新鲜培养基并复苏。悬浮细胞。

将悬浮液转移至 15 mL 锥形管中，以 290 Gs 离心 5 分钟，去除上清液并加入 5 mL PBS。轻轻敲击试管底部以打碎沉淀，然后以 290 Gs 离心 5 分钟。重复 PBS 洗涤 3 次后，去除旧的 PBS 并将细胞重悬于 1 毫升新鲜 PBS 中。

然后将细胞转移到 einor 管中，并以 290 GS 离心 5 分钟。为了进行细胞裂解，使用移液管测量沉淀的近似体积，并称取玻璃珠和一比一的质体积比。向沉淀中加入裂解缓冲液，体积为沉淀体积的两倍。

然后将玻璃珠加入沉淀中并裂解。通过在冷藏室中涡旋，在 4 摄氏度下以最大搅拌方式缓冲 einor 管中的细胞 30 分钟。在 200 GS 下短暂离心 30 秒。

沉淀珠子并收集上清液。将与之前相同体积的玻璃珠加入上清液涡旋中，在 200 Gs 离心 30 秒后，再次在 4 摄氏度下以最大搅拌 30 分钟。要沉淀玻璃珠，请收集上清液。

最后以 5， 030 GS 离心 5 分钟。要去除细胞核、膜和未破损的细胞，请收集上清液，上清液是用于组织衍生化的细胞裂解物，通过 Cinco nimic acid 或 BCA 分析进行。在 96 孔板中，使用 BCA 蛋白检测试剂盒方案规定的胆量法 96 孔板读数仪测定裂解物的蛋白质浓度。

确定蛋白质浓度后，使用去离子水将相当于 20 μg 总蛋白质的等分试样加入 50 μL。然后在溶液中加入两微升 1.35 微摩尔的 HAUB 乙烯基手机。结果是在最终反应混合物中，20 μg 裂解物与 50 纳摩尔探针混合。

这是大磨牙过量。为确保标记功能性泛素酶或 dubs，请将溶液在 37 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，向溶液中加入 laly 样品缓冲液。

对于 52 μL 的反应体积，使用 26 μL 的 2 x 样品缓冲液、13 μL 的 4 x 样品缓冲液或 8.87 μL 的 6 x 样品缓冲液。将样品在 95 摄氏度下孵育 5 分钟。冰上凉爽。

在加载凝胶进行蛋白质印迹之前，首先将 4% 至 20% tris 甘氨酸凝胶和 40 μL 制备的样品加载到 40 μL 中。在 95 伏电压下运行凝胶，直到离子前沿到达底部。然后将凝胶转印到聚藤 DI 氟化物或 PVDF 膜上过夜。

转移首先，将膜在 AMDO black 染色剂中孵育并扫描膜以获得显示每个泳道中蛋白质量的图像。然后保留膜并在 PBS 中的 5% 牛奶中孵育 1 小时以封闭。接下来，将膜以 1 至 10， 000 的浓度在 5% 牛奶中的 PBS 溶液中孵育，在 4 摄氏度下过夜或在室温下孵育 4 小时。

孵育后，在含 0.1% 吐温 20 去污剂的 PBS 中洗涤 3 次，每次洗涤 5 分钟。然后将膜在浓度为 1 至 10， 000 的小鼠辣根过氧化物酶中孵育在 5% 牛奶的 PBS 溶液中至少两个小时。像以前一样进行 3 次洗涤，然后在 PBS 中洗涤 1 次，每次 5 分钟。

最后，将膜在化学发光检测试剂中孵育 10 分钟，并使用发光检测器进行检测。使用探测器上的自动曝光设置。使用 AM mito 黑染色检查蛋白质上样量。

该控制步骤确保活性差异是由于实际的细胞过程而不是不相等的蛋白质负载。此处显示的泳道表明在第一个实验中使用了相等的蛋白质量。在第二个实验中，由于差异细胞系的活性谱的预期差异，加载了不相等的蛋白质量。

这样做是为了确保检测 M 17 细胞的活性曲线。裂解物与 Ethyl mide 一起孵育，乙基 mide 是一种胱氨酸抑制剂，应导致 Western 印迹上的信号减弱。膜在抗 HA 一抗中孵育。

小鼠辣根过氧化物酶，然后用化学发光成像进行检测。使用探针成功标记 dub 可在膜的每个泳道中产生一个轮廓。不同分子量的条带强度对应于 dub 酶的活性水平。

当在 he a 和 M 17 细胞中比较相似的蛋白质（如 U CHL one）时，不同细胞系中各种 dub 的活性水平差异变得明显。在此过程之后。可以执行其他方法（如亚细胞组分分离）来回答以下问题：病理过程如何影响膜结合细胞器中的泛素酶活性？

观看此视频后，您应该对如何使用活性定点探针测量去泛素化酶活性有很好的了解。