Name: 测量去泛素酶的活性细胞系和组织样品的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习使用活性位点定向探针检测去泛素化酶活性的方法，通过Western blot和化学发光检测实现多种酶活性可视化，为神经科学和细胞生物学研究提供潜在治疗靶点分析工具。

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我们感谢明尼苏达大学的Lee实验室提供了所使用的小鼠脊髓组织样本。本研究由美国国防部卵巢癌研究项目（OCRP）OC093424（资助MB）、Randy Shaver癌症研究与社区基金（资助MB）以及明尼苏达卵巢癌联盟（MOCA）（资助MB）提供支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

1. 裂解缓冲液的配制
<ol>
	<li>将蔗糖溶解于去离子水（DI水）中，配制成2 M的储备液。使用真空驱动的0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜过滤2 M蔗糖溶液。</li>
	<li>将二硫苏糖醇（DTT）溶解于去离子水中，配制成500 mM的储备液，并在厌氧条件下保存。将氯化镁（MgCl2）溶解于去离子水中，配制成100 mM的储备液。将三磷酸腺苷（ATP）二钠水合物溶解于去离子水中，配制成50 mM的储备液。</li>
	<li>将Trizma盐酸盐溶解于去离子水中，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4，配制pH为7.4的Tris溶液。</li>
	<li>将上述储备液按一定比例加入去离子水中，配制成裂解缓冲液，其中含250 mM蔗糖、1 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和50 mM Tris。例如，取535.3 µl Tris溶液、500 µl MgCl2溶液、1.25 ml蔗糖溶液、20 µl DTT溶液、200 µl ATP溶液以及7.4947 ml去离子水，混合后定容至10 ml，即可得到10 ml裂解缓冲液。该缓冲液可用于约20次实验。</li>
</ol>
2. 实验用细胞的培养
<ol>
	<li>将 DMEM 加 10% 胎牛血清（FBS）分装至 50 ml 锥形管中，每管 30 ml，制备培养基。</li>
	<li>将冻存的 M17 或 HeLa 细胞从液氮中取出，放入盛有温水的小烧杯中进行解冻。</li>
	<li>将细胞转移至 50 ml 锥形管中。首先向细胞冻存管中加入少量培养基，然后在解冻后 5 秒内将重悬的细胞转移至锥形管。</li>
	<li>将细胞悬液在 450 × g 下离心 5 分钟，以获得细胞沉淀。同时，向 T75 培养瓶中加入 20 ml 培养基。</li>
	<li>用吸液法去除细胞沉淀中的上清液，向沉淀中加入 5 ml 新鲜培养基并重悬细胞。</li>
	<li>将 5 ml 细胞悬液转移至含有 20 ml 培养基的 T75 培养瓶中，于 37 °C 培养。每 3 天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 细胞收获
<ol>
	<li>用吸液法去除培养基，注意不要触碰细胞。</li>
	<li>用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后用吸液法去除 PBS。</li>
	<li>向 T75 培养瓶中加入 3 ml 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育 3 分钟。</li>
	<li>向培养瓶中加入 6 ml 新鲜培养基，重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 ml 锥形离心管中，在 290 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 5 ml PBS。轻轻敲击管底以充分分散细胞沉淀，然后在 290 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>重复步骤 3.6 三次。</li>
	<li>去除 PBS，将细胞重悬于 1 ml 新鲜 PBS 中，转移至 Eppendorf 管（1.5 ml），在 290 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
</ol>
4. 细胞裂解
<ol>
	<li>使用移液器测量沉淀物的近似体积，并按质量与体积比1:1称取玻璃珠。加入相当于沉淀物体积两倍的裂解缓冲液。 
	注意：先加入缓冲液，再加入玻璃珠。</li>
	<li>在4 °C下，将Eppendorf管中的细胞置于冷室中，以最大振荡速度涡旋振荡30分钟，进行细胞裂解。</li>
	<li>在200 × g下短暂离心30秒，使玻璃珠沉降。收集上清液。</li>
	<li>向上述上清液中加入与之前等体积的玻璃珠。</li>
	<li>再次在4 °C下以最大振荡速度涡旋振荡30分钟。</li>
	<li>在200 × g下短暂离心30秒，使玻璃珠沉降。收集上清液。</li>
	<li>在5,030 × g下离心5分钟，以去除细胞核、膜成分及未破碎的细胞。收集上清液，即为细胞裂解物。</li>
</ol>
5. 组织匀浆化
<ol>
	<li>按质量：体积比1:9将小鼠脊髓组织加入裂解缓冲液中配制成溶液。 
	注意：该方法适用于多种不同的组织样本。</li>
	<li>使用匀浆器在2级转速下匀浆30秒，确保无组织块残留。</li>
	<li>在5,030 × g离心3分钟，以去除细胞核、膜成分和未破碎的细胞。</li>
	<li>收集上清液，即为裂解物。</li>
</ol>
6. 样品衍生化
<ol>
	<li>使用 Pierce BCA 蛋白检测试剂盒说明书指定的比色 96 孔板读板仪，通过二辛可宁酸（BCA）法在 96 孔板中分析测定组织裂解液的蛋白浓度。</li>
	<li>用去离子水（DI 水）将相当于 20 µg 总蛋白的等分试样调整至 50 µl。</li>
	<li>向溶液中加入 2 µl 浓度为 1.35 µM 的 HA-Ub-乙烯基砜（VS），在 37 °C 下孵育 1 小时。最终反应体系中，20 µg 裂解液对应的探针浓度为 50 nM。该浓度具有显著的摩尔过量，以确保功能性去泛素化酶（DUBs）被充分标记。</li>
	<li>将样品在 Laemmli 上样缓冲液中于 95 °C 孵育 5 分钟。对于 52 µl 的反应体积，使用 26 µl 的 2x 上样缓冲液、13 µl 的 4x 上样缓冲液或 8.87 µl 的 6x 上样缓冲液。</li>
	<li>上样前将样品置于冰上冷却。</li>
</ol>
7. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>将40 µl制备好的样品加入12孔4-20% Tris-甘氨酸凝胶中</li>
	<li>以95 V电压电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部</li>
	<li>将凝胶中的蛋白在4°C下过夜转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上</li>
	<li>将膜置于氨基黑染色液中孵育，并对膜进行扫描，以获得显示每条泳道蛋白量的图像</li>
	<li>脱色后，将膜在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中于室温孵育1小时，进行封闭</li>
	<li>将膜与一抗HA抗体在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中孵育，抗体稀释比例为1:10,000，可选择在4°C孵育过夜或室温孵育4小时</li>
	<li>用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟</li>
	<li>将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（鼠源）在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中孵育，稀释比例为1:10,000，孵育时间至少2小时</li>
	<li>用含0.1% Tween-20的PBS缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟</li>
	<li>用PBS缓冲液洗涤膜1次，持续5分钟</li>
	<li>将膜与化学发光检测试剂孵育10分钟，并使用化学发光检测仪进行信号检测，检测时采用仪器的自动曝光模式</li>
</ol>

<ol><li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-+based+ubiquitin-specific+%28USP%29+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li>
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<li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Parkinson%E2%80%99s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li>
<li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Amyloid+%28A%CE%B2%29+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li>
<li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li>
<li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li>
<li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li>
<li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+%CE%B1-Synucleinopathy+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于泛素化是一种基本的细胞活动，理解其调控机制可能是揭示疾病和病理过程的关键。本文报道的使用HA标签的泛素衍生活性位点定向探针，为研究泛素介导的蛋白质降解提供了一种简便且高度适用的方法。该方法比单独研究每一种去泛素化酶（DUB）更快且成本更低。
该方法通过机械方式——使用玻璃珠来实现细胞裂解。这种温和的裂解方法能够保持细胞内代谢状态的真实情况。然而，该裂解方法的主要缺点是裂解效率较低，约为60-70%。这意味着需要大量细胞才能确保裂解液浓度足以满足实验需求。应使用细胞融合度为80-90%的T75培养瓶来制备高浓度的裂解液。此外，实验中的胰酶消化步骤至关重要，因为必须使绝大多数贴壁细胞悬浮于溶液中。在将细胞转移至50 ml离心管前，需在显微镜下检查培养瓶，确保培养物中有大量细胞处于悬浮状态。若贴壁细胞未充分消化，将导致细胞沉淀量减少，进而使裂解液产量降低且浓度不足。不立即使用的裂解液应保存在-80 °C，使用前24小时转移至-20 °C，并在使用当天置于冰上解冻。这样可使裂解液均匀缓慢解冻，避免因快速解冻对酶活性造成损伤。
将该...

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是哺乳动物细胞中主要的降解通路之一。靶向蛋白酶体进行降解的底物会被共价连接上泛素（Ub）多聚链标记1。在靶向底物进入蛋白酶体降解之前，必须去除多泛素标签。一类被称为去泛素化酶（DUBs）的酶负责泛素分子的切除与回收2。根据人类基因组预测，细胞中存在近一百种DUBs3。由于数量众多的DUBs调控着泛素介导的细胞过程，对这些酶的研究具有挑战性，因为mRNA技术无法提供活性信息，而蛋白质印迹（western blotting）仅能提供表达水平的信息。
使用带有流感病毒血凝素（HA）标签的泛素（Ub）衍生活性位点定向探针，可实现对功能性去泛素化酶（DUBs）的共价修饰，从而在蛋白质印迹实验中直接可视化这些酶的活性4。该探针具有一个C端硫醇反应基团，可作为活性位点半胱氨酸残基的自杀性底物5。利用这些探针，可以在细胞的病理和生理状态下，研究多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平。
DUB 活性的改变与多种病理状态相关，例如帕金森病、阿尔茨海默病、贫血以及多种癌症6-10。该技术为疾病研究提供了强有力的工具。在本文中，我们展示了该技术在使用玻璃珠裂解的 HeLa 和 M17 细胞中的应用。此外，我们还概述了如何在小鼠脊髓组织样本中使用该方法。通过该技术获得的信息可作为识别治疗靶点以及建立不同疾病状态研究模型的起点。该技术的真正优势在于其能够在单次检测中提供多种 DUB 的信息。

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125（匀浆器）</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>真空驱动滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>酸洗玻璃珠，&amp;le;106 &amp;micro;m（约140目美国标准筛）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fischer Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Trizma盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶，75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，带250 ml滤杯，每箱120个</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×）</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>小鼠来源的单克隆抗HA抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>泛素乙烯砜（HA标签）</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS样品缓冲液（4×，还原型）</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

泛素-蛋白酶体系统最近被发现与多种病理过程相关，包括神经退行性疾病和癌症。鉴于这一情况，研究该系统调控机制的技术对于阐明上述疾病的细胞和分子过程至关重要。本文所述使用来源于血凝素的泛素探针，为研究该系统提供了一种有价值的工具。本文详细介绍了一种方法，使研究者能够开展实验，直接可视化去泛素化酶的活性。去泛素化酶调控蛋白酶体降解过程，其活性位点具有功能同源性，这使得研究者可在一次实验中同时检测多种酶的活性。通过温和的机械方法裂解细胞获得裂解液，并与靶向活性位点的探针共同孵育。具有功能活性的酶会被探针标记，而无活性的酶则保持未结合状态。通过该实验，研究者可快速、简便地获得多种去泛素化酶的活性及其潜在表达水平的信息。目前的方法相较于针对人类细胞中预计存在的约一百种去泛素化酶逐一使用特异性抗体的方法，效率显著提高。

采用本方案中所述方法（3. 细胞收获）收集培养的 M17 和 HeLa 细胞，并获取小鼠脊髓组织。将细胞沉淀或脊髓组织置于含有试剂制备部分所述裂解缓冲液的离心管中。使用玻璃珠对细胞沉淀进行裂解（图 1A），使用匀浆器对小鼠脊髓组织样本进行匀浆处理（图 1B）。裂解或匀浆后，将样品在 5,030 ×g 条件下离心，以去除玻璃珠和/或未破裂的膜结构及细胞器（图 2）。这两种方法均为机械裂解方式，旨在保持酶活性。随后采用 BCA 法测定细胞中的蛋白质浓度。取 20 µg 总蛋白与 2 µl 浓度为 1.35 µM 的探针在 37 °C 下孵育 1 小时（图 3）。然后将样品置于 4× Laemmli 样品缓冲液中，在 95 °C 下孵育以终止反应。将制备好的样品上样至 4–20% 的 Tris-甘氨酸凝胶，在 95 V 条件下电泳，直至离子前沿迁移至凝胶底部。随后将蛋白质在 PVDF 膜上过夜转膜。使用氨基黑染色检测蛋白上样量（图 4）。该对照步骤可确保观察到的活性差异源于真...

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。

泛素-蛋白酶体系统最近被发现与多种病理过程相关，包括神经退行性疾病和癌症。鉴于这一点，……

以下实验的总体目标是可视化细胞中去泛素化酶的活性。首先将细胞培养至高汇合度，然后收集细胞，以制备浓缩的裂解液作为第二步。采用温和的机械裂解方法制备裂解液，以保持细胞胞质的代谢状态。接下来，将酶与血凝素衍生的探针共同孵育，通过与活性位点的半胱氨酸残基发生反应，从而标记去泛素化酶。结果通过蛋白质印迹及随后的化学发光检测，显示出多种去泛素化酶的活性谱。该技术相较于常规蛋白质印迹等现有方法的主要优势在于，能够使研究人员同时观察多种酶的活性。在一项实验中，将30毫升Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）加入10%胎牛血清，置于50毫升锥形管中，用于细胞培养。将用于实验的细胞从液氮储存中取出，迅速转移至含有温水的小烧杯中。随后，将细胞转移至含有30毫升培养基的50毫升锥形管中。接着，在解冻后五秒内，向细胞冻存管中加入一些培养基，并将重悬的细胞转移至培养容器中。以450 ×g离心细胞悬液5分钟，以获得细胞沉淀。然后向T75培养瓶中加入20毫升培养基。用抽吸法去除细胞中的培养基。向细胞沉淀中加入5 mL新鲜培养基并重悬。将5 mL细胞悬液转移至T75培养瓶中含20 mL培养基的环境中，于37°C培养。每三天更换一次培养基以收获细胞。用吸液法移除培养基，注意不要触碰细胞。用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。通过吸液法移除 PBS。接着，向 T 75 培养瓶中加入 3 mL 胰蛋白酶 EDTA，于 37 °C 孵育 3 分钟。孵育结束后，向培养瓶中加入 6 mL 新鲜培养基，重悬细胞。将悬液转移至15毫升锥形管中，在290 G下离心5分钟，弃去上清液，加入5毫升PBS。轻轻敲击管底以重悬沉淀，然后在290 G下再次离心5分钟。重复PBS洗涤三次后，弃去旧的PBS，并将细胞重悬于1毫升新鲜PBS中。然后将细胞转移至离心管中，在290 ×g下离心5分钟。进行细胞裂解时，使用移液器估测沉淀的体积，并按1:1的质量与体积比称取玻璃珠。向沉淀中加入裂解缓冲液，体积为沉淀体积的两倍。然后将玻璃珠加入沉淀物中，并在低温室中于4°C条件下，通过涡旋振荡在最大振荡速度下裂解细胞30分钟。随后在200 ×g下短暂离心30秒。为了使珠子沉淀并收集上清液。向该上清液中加入与之前相同体积的玻璃珠，再次在4°C下以最大转速涡旋振荡30分钟，振荡前先短暂离心（200 ×g，30秒）。待玻璃珠沉降后，收集上清液。最后在5,030 ×g下离心5分钟。为去除细胞核、膜成分及未破碎的细胞，收集上清液，即为用于组织衍生化的细胞裂解液，该步骤可通过戊二醛或BCA分析完成。在96孔板中，按照BCA蛋白检测试剂盒说明书，使用比色法96孔板读板仪测定裂解液的蛋白浓度。确定蛋白浓度后，用去离子水将相当于20微克总蛋白的等分试样补至50微升。然后向溶液中加入2微升浓度为1.35微摩尔的HAUB乙烯基手机探针。最终反应体系中，裂解液中的蛋白量为20微克，探针浓度为50纳摩尔。这处于大量摩尔过量状态。为确保功能性的去泛素化酶（deubiquitin enzymes 或 DUBs）被标记，请将溶液在 37 摄氏度下孵育一小时。接着，向溶液中加入上样缓冲液（laly sample buffer）。对于52微升的反应体系，使用26微升的2×上样缓冲液、13微升的4×上样缓冲液或8.87微升的6×上样缓冲液。将样品在95摄氏度下孵育5分钟，然后置于冰上冷却。在进行 Western 印迹实验加载凝胶之前，先将 40 微升制备好的样品加入 12 孔 4 至 20% 的 Tris-甘氨酸凝胶中。以 95 伏电压电泳，直至离子前沿到达凝胶底部。随后，按照以下步骤将凝胶中的蛋白在低温条件下过夜转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。首先转移，将膜置于AMDO黑色染色液中孵育，并对膜进行扫描，以获得显示每条泳道中蛋白质含量的图像。随后，将膜脱色，并在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中室温孵育一小时以封闭非特异性结合位点。接着，将膜与一抗HA抗体在含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液中孵育，抗体工作浓度为1:10,000，可选择在4°C孵育过夜，或在室温孵育4小时。孵育后，用含0.1% Tween 20的PBS缓冲液洗涤三次，每次五分钟。然后将膜置于含5%脱脂奶粉的PBS溶液中，加入辣根过氧化物酶标记的鼠源二抗（稀释比例为1:10,000），孵育至少两小时。按前述方法洗涤三次，再用PBS缓冲液洗涤一次，每次五分钟。最后将膜在化学发光检测试剂中孵育10分钟，并使用化学发光检测仪进行检测。检测时采用检测仪的自动曝光设置。蛋白上样量的检测使用AM线粒体黑色染色法。此对照步骤可确保观察到的活性差异源于真实的细胞过程，而非蛋白质上样量不均所致。本图所示泳道表明，第一次实验中各组使用的蛋白质含量相等。而在第二次实验中，由于预期不同细胞系的活性特征存在差异，因此上样的蛋白质含量并不相等。这样做的目的是确保检测到 M 17 细胞的活性谱。将裂解液与乙基马来酰亚胺（一种半胱氨酸抑制剂）共同孵育，应会导致 Western 印迹信号减弱。将膜与抗 HA 一抗共同孵育。使用小鼠辣根过氧化物酶，然后通过化学发光成像进行检测。利用探针成功标记去泛素化酶后，会在膜的每条泳道中产生相应的条带图谱。不同分子量处条带的强度对应于去泛素化酶的活性水平。当在 HEK293 和 M17 细胞中比较 UCHL1 等相似蛋白质时，不同细胞系中各种去泛素化酶活性水平的差异变得明显。经过该步骤后，可进行亚细胞组分分离等其他方法，以回答诸如病理性过程如何影响膜结合细胞器中泛素酶活性等问题。观看本视频后，您应能充分理解如何使用活性位点定向探针来检测去泛素化酶的活性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

测量去泛素酶的活性细胞系和组织样品的方法

泛素化是一种由三种酶共同完成的关键翻译后修饰过程。参与该修饰过程的基因突变与多种人类疾病相关。本文中，我们描述了在培养细胞中进行体内（in vivo）以及在试管中进行体外（in...

蛋白质泛素化检测

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

泛素化是一种翻译后修饰，在细胞过程中发挥重要作用，并受到去泛素化的严密调控。这两种反应的异常与人类疾病密切相关。我们提供了使用纯化组分在体外进行泛素化和去泛素化反应的实验方案。...

体外核小体组蛋白泛素化与去泛素化实验

本方案旨在高效定量啮齿类动物脑组织不同细胞区室中泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性。使用者可在同一只动物中检测核、胞质和突触组分内的UPS功能，从而减少进行此类复杂分析所需的时间和动物数量。...

量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。...

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

本实验采用分子对接结合探针技术的方法，预测并验证中药小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。...

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制UCHL3活性的中药化合物

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

学习使用活性位点定向探针检测去泛素化酶活性的方法，通过Western blot和化学发光检测实现多种酶活性可视化，为神经科学和细胞生物学研究提供潜在治疗靶点分析工具。

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

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