Name: 先天免疫反应中的斑马鱼幼体型号无创成像链球菌iniae感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 了解斑马鱼幼体耳囊显微注射链球菌的无创活体成像方法。该技术结合光标记与共聚焦显微镜，实现宿主免疫应答的实时追踪，为研究宿主-病原体相互作用提供可视化平台。

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作者感谢实验室成员在斑马鱼饲养与维护方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院国家研究服务奖 A155397（授予 E. A. Harvie）和美国国立卫生研究院 R01GM074827 项目（授予 Anna Huttenlocher）资助。

成年和胚胎斑马鱼的饲养均遵循威斯康星大学麦迪逊分校实验动物资源中心的规定。
1. 制备显微注射针
<ol>
	<li>使用显微注射针拉制仪制备薄壁玻璃毛细注射针（外径1.0，内径0.75），仪器参数设置如下：气压200，加热502，拉力90，速度80，时间70，拉制开始时的气压时间5，拉制结束时的气压时间5。</li>
	<li>使用精细镊子折断拉制好的针尖，使针尖开口直径约为10 µm。</li>
</ol>
2. 准备幼虫注射培养皿
<ol>
	<li>用无菌水冲洗泳道宽度约为4-5 mm的凝胶梳，然后使其干燥。</li>
	<li>在E3培养基中配制1.5–2%的高熔点琼脂糖溶液19 微波加热至溶液澄清。冷却后，取部分琼脂糖倒入培养皿（100 × 15 mm）中，轻轻旋转，加入适量琼脂糖以完全覆盖皿底。</li>
	<li>一旦琼脂糖层凝固，将清洗并干燥后的凝胶梳放在其上，使无齿的一端刚好接触培养皿顶部，而有齿的一端接触琼脂糖。确保梳子尽可能保持水平，与底部琼脂糖层形成约30°角。</li>
	<li>在梳子与底部琼脂糖之间的界面处再倒入少量琼脂糖&#160;铺上一层新鲜的琼脂糖，使其完全覆盖梳孔。待其彻底冷却后，再移去梳子。用移液器吸头小心去除加样孔中悬垂的琼脂糖碎片。</li>
	<li>将E3培养基倒入注射模具顶部，于4 °C保存。</li>
	<li>每次使用前，更换为新鲜培养基，并在注射前于28.5 °C下预热注射斜坡至少一小时。</li>
	<li>注射前立即用含有200 µg/ml乙基-3-氨基苯甲酸酯（三卡因）的E3培养基替换注射斜面上的E3培养基。</li>
</ol>
3. 准备S. iniae接种物
<ol>
	<li>制备并高压灭菌添加了0.2%酵母提取物和2%蛋白胨的Todd Hewitt肉汤培养基（THY+P）：每升含30 g Todd Hewitt、2 g酵母提取物、20 g蛋白胨。若制备琼脂平板，加入14 g/L琼脂。</li>
	<li>在感染前一天晚上准备细菌培养物：用移液器将冻存的细菌原液100 µl加入装有10 ml THY+P肉汤的密封15 ml离心管中。于37 °C静置培养过夜。培养14–16小时后，使用该过夜培养物制备冻存菌种或用于注射。</li>
	<li>制备冻存菌种时，将1 ml过夜培养物与500 µl 80%甘油混合，置于1.7 ml离心管中。为避免反复冻融，将此混合液分装为每份100 µl的单次使用小份，于-80 °C保存。</li>
	<li>用于感染实验的S. iniae，将过夜培养物按1:100比例稀释，总体积为10 ml，即取0.1 ml过夜培养物加入9.9 ml THY+P肉汤中。于37 °C静置培养约4–5小时。使用Nanodrop分光光度计监测600 nm处的光密度（OD），并在对数生长期中期（OD600 nm达到0.250–0.500时）收获细菌。OD600 nm为0.250时，相当于约108菌落形成单位（CFU）/ml。</li>
	<li>取1 ml细菌培养物于1.7 ml离心管中，在1,500 × g离心5分钟以收集菌体。用1 ml新鲜PBS重悬，重复一次。测定PBS中细菌的OD600 nm值，离心后重悬于PBS中，调整至所需浓度。</li>
	<li>为便于显微注射时观察，可在注射前向细菌悬液中加入酚红，使其终浓度为0.1%。</li>
	<li>对于需注射热灭活细菌的实验，将细菌在PBS中于95 °C加热30分钟。通过将注射体积（约1 nl）涂布于固体THY+P琼脂平板并在37 °C过夜培养，确认热灭活处理已将活菌数量降至无法检测水平。</li>
</ol>
4. 使用 CellTracker 红色荧光染料标记S. iniae
<ol>
	<li>为了标记活细菌细胞，需配制一种CellTracker荧光染料或等效染料的储存液。由于所用染料为每管20 × 50 µg的粉末形式，需用DMSO重悬，向每管中加入7.3 µl DMSO，以获得10 mM的储存液浓度。</li>
	<li>测试一系列染料浓度（例如， 0.5–25 µM）处理细菌，以确定可有效染色细胞的最低最适浓度。快速分裂的细胞或较长时间的实验可能需要更高浓度的染料。
	<ol>
		<li>在1.7 ml离心管中取1.0 ml细菌培养物，按上述方法（第3节）离心收集菌体。用1 ml新鲜PBS重悬菌体沉淀，并向细菌悬液中加入适量染料。</li>
		<li>37 °C 静置孵育 30 分钟。离心收集细菌，重悬于 1 ml 预热的 THY+P 培养基中，于 37 °C 静置孵育额外 30 分钟。</li>
		<li>离心收集细菌，并用PBS洗涤两次，然后测定OD600 nm值，按上述方法（第3节）将细菌稀释至适合显微注射的浓度。在白细胞募集和吞噬作用研究中，我们通常在1 nl的注射体积中注入约100 CFU。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 感染用斑马鱼幼虫的制备
<ol>
	<li>前一晚设置交配对，并按照Rosen所述方法收集胚胎 等27 将胚胎置于E3培养基中，在28.5 °C条件下孵育至感染所需阶段。</li>
	<li>对于需要成像的斑马鱼，在受精后24小时（hpf）向E3培养基中添加N-苯硫脲（PTU），终浓度为0.2 nM，以抑制色素（黑色素化）的发育。</li>
	<li>对于涉及2天龄胚胎的感染实验，可使用精细镊子手动去除胚胎的卵膜。或者，通过移除E3培养基并替换为蛋白酶（2 mg/ml）处理约5分钟，直至轻柔吹打即可使胚胎脱离卵膜。大多数幼鱼在3天龄时应已自然孵化。</li>
	<li>在感染前数分钟，将去壳的幼鱼置于含有 200 µg/ml 三卡因的 E3 培养基中以麻醉斑马鱼。</li>
</ol>
6. 向三天龄幼鱼的耳囊注射S. iniae
<ol>
	<li>打开显微注射仪，并将时间范围设置为“毫秒”。打开二氧化碳气罐的阀门，使气体进入管路。显微注射仪的压力应显示约为20 PSI。通过顺时针旋转黑色滚花旋钮以增加压力，或逆时针旋转以降低压力，调节显微注射仪单元中的压力。</li>
	<li>涡旋混匀已制备的 S. iniae 在酚红和PBS中培养，并使用微量上样吸头将2-3 µl培养物加入拉制的毛细管注射针中。</li>
	<li>将装好样品的针安装在连接磁性支架的显微操作器上，并置于体视显微镜下，使针与显微镜底座呈约45–65°角。</li>
	<li>踩下显微注射仪的脚踏板，将一滴接种液释放到针尖上。使用显微镜目镜中的标尺测量液滴的直径。
	<ol>
		<li>或者，可通过将一定体积的液体注入置于带刻度尺的玻璃显微镜载片上的矿物油滴中，来估算液滴的直径。液滴直径应约为0.10 mm，对应体积约为1 nl。</li>
		<li>通过调节显微注射仪的持续时间设置，或使用精细镊子剪去更多针尖部分来调整液滴大小。注意注射时间应控制在20–35毫秒之间，以避免造成过大的组织损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用塑料移液管将12条麻醉后的幼虫转移至注射模具的每个孔中。</li>
	<li>使用玻璃棒、毛细管环或塑料吸头轻轻调整幼鱼位置，使头部朝向显微镜后方，卵黄囊位于孔板的左侧。将幼鱼的左耳朝上指向天花板。</li>
	<li>通过体视显微镜的目镜观察，使用显微操作仪上的旋钮将装有样品的针头与耳泡对齐，使二者处于同一视野范围内。用针尖刺穿耳泡的外层上皮，使针尖刚好进入耳泡内部。</li>
	<li>踩下脚踏板，注入所需剂量的1 nl溶液 S. iniae确保使用足够低的压力，以免腔体破裂。如果注射成功，耳泡会充满酚红接种液，而周围组织则不会被填充。图1 Ai立即从注射板中移除任何注射失败的鱼。</li>
	<li>小心地将针头从幼虫体内抽出，手动移动注射板，使下一只幼虫进入视野。此操作应在5倍放大倍数下进行。 
	注意：针头回撤可能导致部分细菌沉积在耳囊外，从而影响存活率和白细胞募集结果的准确性。为避免此情况，建议注射荧光染料标记的细菌，并在荧光显微镜下观察注射后的幼鱼，剔除发生此类污染的个体。正确注射的幼鱼示于（图1 Bi).</li>
	<li>为确保实验过程中注射体积/接种量保持一致，每间隔48小时后，将一滴细菌悬液注入含有100 µl无菌PBS的1.7 ml离心管中th 胚胎。将100 µl接种于THY+P琼脂平板上，37 °C过夜培养，以测定注射体积中的菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>当注射斜面上全部12只幼虫完成注射后，小心使用塑料移液管将幼虫从孔中取出，并转移至新的培养皿（35 × 10 mm）中2移除三卡因溶液，并加入约 2 ml 新鲜 E3 培养基，使幼鱼恢复。</li>
	<li>用移液器将感染的幼鱼注入96孔板的单个孔中，在28.5 °C下孵育。在这些孔板中随时间监测幼鱼的存活情况，或在后续取出用于成像或CFU计数。</li>
</ol>
7. 中性粒细胞的苏丹黑染色
注意：以下步骤除非另有说明，均可在室温下于小型培养皿（35 × 10 mm2）中置于旋转摇床上进行。每步所用试剂体积约为每皿2 ml，使用足够覆盖幼虫的液体量即可。
<ol>
	<li>对于感染幼鱼的固定，使用玻璃巴斯德吸管移除 E3 培养基，并替换为冰冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。立即将鱼置于 4 °C 下以实施安乐死。在 4 °C 下固定过夜。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用苏丹黑（0.18% 储存液以 70% 乙醇和 0.1% 苯酚按 1:5 稀释）染色 30 分钟至 5 小时。使用体视显微镜检查中性粒细胞颗粒是否已摄取染料。</li>
	<li>进行一系列每次 5 分钟的洗涤：首先用 70% 乙醇洗涤一次，接着用 70% 乙醇与 PBS 按 1:1 比例混合的溶液洗涤一次，最后用 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>将样品重新水化至含 0.1% Tween 的 PBS（PBT）中。</li>
	<li>为清除幼鱼中的色素，用 1% 氢氧化钾/1% 过氧化氢溶液洗涤约 6–10 分钟。密切监测样品，约 5 分钟后在体视显微镜下检查幼鱼色素清除程度。若处理时间过长，卵黄囊会膨胀并破裂。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将样品保存在 PBS 或 PBT 中，置于 4 °C 下最多可保存 1 周，直至准备成像和计数。</li>
	<li>对苏丹黑染色的幼鱼进行成像时，先将鱼转移至 PBT，再转移至 80% 甘油中，然后置于单凹槽载玻片上。使用吸头在体视显微镜下调整固定幼鱼的位置。使用体视显微镜上的彩色数码相机进行成像（图 1 Aii-iv）。</li>
</ol>
8. 感染幼虫中可存活细菌的计数
<ol>
	<li>在感染后所需时间点，将幼虫置于冰上冷的E3培养基中含200–300 mg/L三卡因的溶液中实施安乐死。</li>
	<li>用移液器将已安乐死的幼虫转移至1.7 ml离心管中，弃去三卡因溶液，加入100 µl含0.2% Triton X-100的PBS（PBSTx）。</li>
	<li>使用27 G针头将幼虫上下吹打10次以进行匀浆处理。</li>
	<li>用无菌PBS对匀浆液进行系列稀释。例如，若感染剂量为100 CFU，则取100 µl匀浆液加入900 µl无菌PBS中。使用新的移液器吸头，将100 µl稀释后的匀浆液转移至900 µl无菌PBS中。</li>
	<li>取100 µl稀释液接种于Columbia CNA琼脂平板上，用于选择性分离革兰氏阳性菌，并在37 °C培养48小时。该培养基相比THY+P琼脂平板具有更强的选择性，后者可支持革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的生长。</li>
	<li>对于菌落数少于500个的平板，计数菌落数量，并乘以稀释倍数以确定CFU数量。</li>
</ol>
9. 用于成像的幼虫固定
<ol>
	<li>按照第&#160;7节所述，用冰冻的4%多聚甲醛PBS溶液固定幼虫。</li>
	<li>室温下用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后成像。</li>
</ol>
10.&#160;活体成像用幼虫的制备
<ol>
	<li>制备&#160;在微波炉中加热 E3 中的 1.5% 低熔点琼脂糖溶液，直至溶液澄清。</li>
	<li>将琼脂糖溶液置于55 °C水浴中，使其冷却但不凝固。</li>
	<li>将三卡因加入琼脂糖中，使其终浓度为 0.016%。</li>
	<li>使用塑料移液管将4-5条麻醉后的幼虫转移至置于体视显微镜载物台上的玻璃底培养皿中。</li>
	<li>将三卡因和琼脂糖溶液从55 °C水浴中取出，在室温下冷却1-2分钟。在琼脂糖冷却的同时，尽可能吸除麻醉后的幼鱼中的液体。</li>
	<li>将冷却后的琼脂糖倒入培养皿中，覆盖约一半的表面。轻轻旋转培养皿以铺匀琼脂糖。注意，若琼脂糖温度过高，会杀死幼虫；此外，若加入过多琼脂糖，显微镜物镜在透过琼脂糖聚焦时可能会触碰到培养皿底部。</li>
	<li>使用移液管吸取漂浮到培养皿边缘的幼虫，并将其移回中央。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用毛环、长吸头或玻璃棒轻轻将幼虫调整至所需位置。若需成像耳囊，应将幼虫摆放至左侧耳囊紧贴培养皿底部。</li>
	<li>让琼脂糖冷却约10分钟后再移动培养皿。如果琼脂糖未完全凝固，幼鱼可能会发生位置移动。轻轻将一些三卡因和E3溶液滴加到琼脂糖层表面，以保持其湿润。</li>
</ol>
11. 感染的共聚焦成像
<ol>
	<li>将带有幼虫的玻璃底培养皿放置在配备 FV-1000 激光扫描共聚焦系统的倒置显微镜载物台上。</li>
	<li>将针孔设为200–300 µm，使用数值孔径0.75/20倍的物镜，设置z轴堆栈，每层切片厚度为3–6 µm。</li>
	<li>使用连续线扫描模式调节每个通道的激光功率和探测器增益。</li>
	<li>使用每个荧光通道的连续线扫描例如， 使用488 nm和543 nm激光以及微分干涉相差（DIC）显微镜，每隔3分钟对左侧耳囊进行一次延时成像，持续2-6小时，以观察中性粒细胞和巨噬细胞的初始募集及吞噬作用。对于更长时间的实验，需在培养皿上加盖，以防止琼脂糖蒸发干燥。</li>
	<li>获取固定样本的静态图像（图1B）或活体（图2在20倍或40倍放大倍数下观察幼虫。</li>
</ol>
12. 在耳泡处对 Dendra2 标记的白细胞进行光转化
注意：通过将405 nm激光（激光功率50-70%即可）聚焦在感兴趣区域（ROI）上照射1分钟，可使Dendra2从绿色荧光光转化为红色荧光。以下是FV-1000激光扫描共聚焦系统所用的逐步操作方案：
<ol>
	<li>使用488 nm和543 nm激光通过z轴扫描观察样品。采用连续线扫描方式调节激光功率和探测器增益。检查以确保没有意外的红色荧光光转化。</li>
	<li>在“图像采集控制”窗口的“刺激设置”下，选择“使用扫描仪”工具并选择“main”。选择405 nm激光，并将其功率设置为70%。使用圆形选项，在耳泡内定义ROI&#160;。</li>
	<li>在“刺激启动设置”下选择“序列激活”，预激活1帧，激活时间为60,000毫秒。在“采集设置”窗口的“时间扫描”标题下，选择2个时间间隔，每个为00:01:00（分别用于光转化前和光转化后）。 
	注意：完成延时扫描序列后，Dendra2应已光转化为其红色荧光状态。</li>
	<li>使用488 nm和543 nm激光对样品进行z轴扫描，以观察已光转化的红色荧光以及任何残留的绿色荧光（图3）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处使用的感染方法适用于研究宿主对2-3 dpf胚胎和幼鱼局部初始感染的免疫应答。将感染等炎性刺激局限在耳囊等封闭腔内，可便于研究中性粒细胞和巨噬细胞的趋化性及吞噬作用。将细菌注射至耳囊的一个局限性在于，中性粒细胞在充满液体的腔隙中高效吞噬细菌的能力可能依赖于特定的微生物种类。尽管Escherichia&#160;coli和Bacillus&#160;subtilis在耳囊中不易被中性粒细胞吞噬28，但我们发现中性粒细胞在此部位能够吞噬Pseudomonas aeruginosa和S. iniae16,24。当研究不同病原体的侵袭性时，局部感染同样具有应用价值。若微生物在注射进入耳囊等封闭腔后引发全身性感染，则其必须能够穿越宿主的物理屏障。此外，某些病原体可能依赖宿主细胞进行运输和从初始感染部位扩散。因此，局部注射可用于比较毒力发生改变的不同菌株。
进行显微注射时，为避免细菌沉降并堵塞针头，建议在每种实验条件后或每注射约50条幼鱼后更换针头。这有...

Streptococcus iniae 是一种重要的人畜共患水生病原菌，可导致鱼类和人类发生全身性疾病1。尽管 S. iniae 给水产养殖业造成了巨大经济损失，它也是一种潜在的人畜共患病原体，可在免疫功能低下的人类宿主中引发疾病，其临床病理特征与其他链球菌人类病原体所致疾病相似。鉴于其与人类病原体的相似性，在自然宿主背景下研究 S. iniae 的致病机制具有重要意义。成年斑马鱼 S. iniae 感染模型显示，宿主白细胞显著浸润至感染局部，且宿主死亡时间迅速，这一时间过短，不足以激活适应性免疫系统7。为了深入探究 体内 情况下先天免疫系统对 S. iniae 感染的应答，有必要采用更适合无创活体成像的研究模型。
幼年斑马鱼具有多种优势，使其成为研究宿主-病原体相互作用的日益受欢迎的脊椎动物模型。与哺乳动物模型相比，斑马鱼相对便宜，易于使用和维护。其适应性免疫系统在受精后4至6周内尚未功能成熟，但幼鱼已具备高度保守的脊椎动物先天免疫系统，包含补体系统、Toll样受体、细胞因子，以及具有抗菌能力（包括吞噬作用和呼吸爆发）的中性粒细胞和巨噬细胞2-6,8-11。此外，斑马鱼胚胎和幼体发育阶段具有良好的遗传可操作性和光学透明性，可构建稳定表达荧光标记免疫细胞的转基因品系，从而实现在活体中实时观察宿主-病原体相互作用。in vivo。利用光转化蛋白（如Dendra2）构建这些转基因品系，可在感染过程中追踪单个宿主细胞的来源与命运12。
在建立斑马鱼幼虫感染模型时，选择的显微注射位点将决定感染最初是局部的还是全身性的。通常采用尾静脉或居维叶管的全身性血液感染来研究斑马鱼中的微生物病原体，这种方法有助于研究宿主与微生物细胞之间的相互作用、细胞因子反应以及不同病原菌株间的毒力差异。对于生长较慢的微生物，可在胚胎发育的16-1000细胞阶段早期注射至卵黄囊，以建立全身性感染13,14，其中最适合对生长缓慢的微生物进行显微注射的发育阶段为16至128细胞阶段15。然而，在宿主发育后期，向卵黄囊注射多种微生物往往会导致宿主死亡，原因在于该环境富含营养物质，有利于微生物生长，同时缺乏浸润的白细胞16-18。
局部感染通常会导致白细胞定向迁移至感染部位，这一过程可通过无创成像技术轻松量化。此类感染有助于解析介导白细胞迁移的机制，并可用于研究不同白细胞群体的迁移和吞噬能力。在比较不同细菌菌株毒力差异以及研究微生物入侵机制时，局部感染同样具有重要价值，因为局部感染若要发展为全身性感染，病原体必须穿越宿主的物理屏障。斑马鱼通常在25–31 °C的温度下饲养19，但为了研究某些对毒力具有严格温度要求的人类病原体的侵袭性，也可将其维持在高达34–35 °C的温度条件下20,21。
已有多种不同部位被用于建立初始的局部细菌感染模型，包括后脑室22、尾部背侧肌肉18、心包腔23以及耳囊（耳）5,16,24。然而，研究发现将细菌注射至尾肌可引起与细菌无关的组织损伤和炎症反应，在研究白细胞反应时可能干扰实验结果13。尽管向后脑注射引起的损伤较小，且在幼体胚胎中该区域最初无白细胞存在，但随着小胶质细胞定植，后脑室会随时间推移逐渐积累更多免疫细胞。此外，后脑室也较难进行成像观察。耳囊是一个封闭的中空腔体，不与血管系统直接相通25,26。正常情况下耳囊内无白细胞，但在感染等炎症刺激下可招募白细胞进入。由于易于成像且便于观察注射过程，耳囊也成为2-3天受精后（dpf）斑马鱼进行细菌显微注射的优选部位。因此，我们选择耳囊作为局部细菌感染的实验位点。

<table><tbody><tr><td>1.7 ml 离心管</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 圆底离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G × &amp;frac12; 英寸针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA 琼脂</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>凝胶梳</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4.2 mm 宽度，1.5 mm 厚度</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td></td><td></td><td>定制：在 35 mm 组织培养皿底部中心钻一个 16–18 mm 的孔，将一个 22 mm 圆形 #1 盖玻片放入孔中，并用一层薄的 Norland 光学胶 68 密封，再通过紫外光固化。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>高熔点琼脂糖</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>配备 FV-1000 系统</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>显微注射系统</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-苯硫脲（PTU）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 × 15 mm</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶蛋白胨</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>小型细胞培养皿</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 × 10 mm</td></tr><tr><td>苏丹黑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管注射针</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt 培养基</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>三卡因（乙基-3-氨基苯甲酸酯）</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fluka Biochemika</td><td>92144</td><td></td></tr></tbody></table>

streptococcus iniae 感染的斑马鱼幼体模型中先天免疫反应的非侵入性成像

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

水生致病菌Streptococcus iniae每年给水产养殖业造成超过一亿美元的经济损失，并可导致鱼类和人类发生全身性感染疾病。要更深入地理解S. iniae的致病机制，需要建立一个合适的模型系统。斑马鱼在早期发育阶段具有遗传操作便利和光学透明的优点，便于构建并进行非侵入性成像的转基因品系，其免疫细胞可带有荧光标记。虽然斑马鱼的适应性免疫系统需至受精后数周才发育完全，但其幼鱼已具备保守的脊椎动物先天免疫系统，包含中性粒细胞和巨噬细胞。因此，建立幼鱼感染模型可用来研究先天免疫在控制S. iniae感染中的特定作用。
显微注射的位点将决定感染是全身性的还是最初局限性的。本文介绍了对受精后2-3天的斑马鱼幼鱼进行耳囊注射的实验方案，以及感染过程中荧光共聚焦成像的技术方法。局限性感染位点可便于观察病原微生物的初始侵入、宿主细胞的募集以及感染的扩散过程。我们利用斑马鱼幼鱼S. iniae感染模型的研究结果表明，斑马鱼可用于研究中性粒细胞和巨噬细胞在局限性细菌感染中各自不同的作用。此外，我们还描述了如何利用光标记免疫细胞来追踪感染过程中单个宿主细胞的命运变化。

S. iniae 微注射至耳囊（图1 和 图2）可引发初始阶段局限性的宿主反应。若注射操作正确，细菌应仅存在于耳囊内，而不会出现在周围组织或血液中。此过程可在显微注射期间通过酚红染料进行观察（图1A）。或者，若使用标记过的细菌进行注射，可在注射后立即对感染的幼鱼进行快速扫描，以确认细菌仅位于耳囊内而未扩散至周围组织（图1B）。尽管仅需10 CFU的野生型 S. iniae 即可在感染后24–48小时（hpi）建立致死性感染，但注射1,000 CFU的无毒力菌株 cpsA 并不会导致致死性感染，且该菌株似乎无法在宿主体内增殖24。因此，这种局限性感染模型能够区分毒力改变的细菌菌株。
初始局部感染的显微注射位点可用于研究白细胞趋化作用。通过中性粒细胞颗粒的苏丹黑染色，可对白细胞募集进行定量分析（图1A）或荧光转基因品系的甲醛固定（<strong...

本文介绍了一种在斑马鱼耳囊内建立并成像局部细菌感染的方法。

Streptococcus iniae 感染的斑马鱼幼体模型中先天免疫反应的非侵入性成像

水生病原体 Streptococcus iniae 每年给水产养殖业造成超过一亿美元的经济损失，并且能够……

本实验的总体目标是通过显微注射将细菌病原体无乳链球菌（Streptococcus IEA）注入斑马鱼幼体，以实现对宿主免疫反应的活体、非侵入性成像。该过程首先将细菌悬液装入显微注射针中，并将麻醉后的斑马鱼幼体排列在琼脂糖注射模具上。随后，将细菌悬液显微注射至幼体的耳囊内。然后将注射后的幼鱼固定在低熔点琼脂糖中。最后对宿主免疫细胞进行光标记，以便于追踪，并使用共聚焦显微镜观察感染过程。最终，通过向斑马鱼幼鱼耳囊内显微注射酿脓链球菌（Streptococcus iniae），结合后续的光标记与共聚焦显微成像，用于研究斑马鱼幼鱼的宿主免疫反应。与现有的如尾静脉注射等方法相比，该技术的主要优势在于耳泡注射能够产生局部细菌感染，从而可在透明的斑马鱼幼鱼中非侵入性地成像宿主与病原体之间的相互作用。首先，在E3培养基中配制1.5%至2%的高熔点琼脂糖溶液，微波加热至溶液澄清。待冷却后，将部分琼脂糖倒入培养皿中，用量以刚好覆盖皿底为宜，轻轻旋转混匀。待琼脂糖凝固后，将一块已清洗并干燥的凝胶梳置于其上，使梳子的末端刚好接触培养皿顶部，而带缺口的一端接触琼脂糖。确保梳子尽可能保持水平，与底层琼脂糖形成约30度角。在梳子与底层琼脂糖交界处再倒入少量琼脂糖，使新加入的琼脂糖层覆盖梳子的加样孔。待其完全冷却后，再取出梳子。然后用移液枪头去除加样孔中突出的琼脂糖块。在注射模具上倒入E三型培养基，并于4°C保存。根据文本方案制备SNEA接种物和斑马鱼幼鱼用于注射后，打开显微注射仪并将时间范围设置为毫秒级。打开二氧化碳气罐的阀门，使气体进入管路。显微注射仪的压力应约为20 PSI。将加入酚红的PBS中制备好的SNEA培养物涡旋混匀，使用移液器吸头吸取两到三微升培养物，注入拉制好的毛细玻璃注射针中。将装有培养物的注射针安装在连接于磁力支架的显微操作器上，并置于体视显微镜下，调整位置使注射针与显微镜载物台基面呈约45至65度角。首先使用精细的镊子折断针尖，然后踩下显微注射仪的脚踏开关，将一滴接种液释放到针尖上。利用显微镜目镜中的刻度尺测量液滴的直径。液滴的直径应约为0.10毫米，体积约为一纳升。为调整液滴大小，可调节显微注射仪的持续时间设置，或使用精细镊子剪去更多针尖部分。注射时间应控制在20至35毫秒之间，以避免造成过大的组织损伤。接下来，使用塑料移液管将每尾鱼逐个转移至注射模具的12个孔中，每孔一尾。然后使用玻璃棒、毛细环或塑料吸头，轻轻调整幼鱼的位置，使其头部朝向显微镜后方，卵黄囊位于孔板的左侧。将幼鱼的左耳朝上指向天花板方向。当幼鱼准备就绪进行注射时，使用显微操作仪上的旋钮，将装有样品的针头与耳囊对齐，使两者处于同一视野范围内。用针尖刺破耳泡的外层上皮，使针尖刚好进入耳泡内部。然后使用足够低的压力，以免腔体破裂，踩下脚踏开关，注入一纳升所需剂量的 SNEA。若注射成功，耳泡内部（而非周围组织）应充满酚红示踪剂。小心地将针头从幼虫体内抽出，在5倍放大镜下用手移动注射板，使幼虫进入视野。若在荧光显微镜下注射带有荧光标记的细菌，需目视检查已注射的幼虫，仅保留细菌沉积仅发生在耳囊内的个体，以确保整个实验过程中注射体积保持一致。每注射48个胚胎后，向含有100 µL无菌PBS的1.7 mL离心管中滴加一滴细菌悬液。然后将100微升样品接种于含P转接头的THY平板上，37摄氏度过夜培养。为确定注射体积中的菌落形成单位（CFU），当注射斜面上一整组12个幼虫完成注射后，小心使用塑料移液管将幼虫从孔中取出，并转移至新的培养皿中。移除三卡溶液，并更换为约2毫升新鲜E3培养基，以使幼虫恢复。根据文本方案孵育胚胎。在体视显微镜载物台上按照文本方案用三卡因麻醉胚胎后，使用移液管将四到五条麻醉后的幼虫转移至玻璃底培养皿中。将盛有三卡因和aro溶液的容器从55摄氏度水浴中取出，在室温下冷却一到两分钟。与此同时，尽可能吸除麻醉后的幼虫中的液体。接着，将冷却的琼脂倒入培养皿中，直至覆盖约一半的表面。然后轻轻旋转培养皿，使琼脂均匀铺开。挑取漂浮到培养皿边缘的幼虫，用移液器将其移回中央。然后在体视显微镜下，使用长型移液器吸头轻轻调整幼虫位置，以满足成像需求。调整耳囊的位置，使幼虫的右侧耳囊朝上，左侧耳囊紧贴培养皿底部。将aROS放置约10分钟使其冷却，然后再移动培养皿。随后用移液器轻轻在aROS层上方加入一些Trica和E three溶液，以保持其湿润。为观察样本，使用Zack扫描仪配合488纳米和543纳米激光器。使用连续线扫描调整激光功率和探测器增益。在图像采集控制窗口中确认不存在意外的光转化红色荧光。在刺激设置中，选择扫描仪工具并选择主通道，选择 405 纳米激光器并将其设置为 70% 功率。然后使用圆形选项，在刺激起始设置中定义卵丘小体内的感兴趣区域，选择串联激活模式，预激活一帧，激活时间为60,000毫秒，在采集设置窗口中进行设置。在时间扫描标题下，选择两个各为一分钟的时间间隔，分别用于光转化前和光转化后。启动时间序列扫描，以启动对所定义感兴趣区域的光转化。最后，使用Zack以及488纳米和543纳米激光扫描样品。为了观察光转化后的红色荧光以及任何残留的绿色荧光，将SNEA注入含酚红的耳泡中，会引发局部宿主反应，若注射操作正确，该反应应仅出现在耳泡内，而不会出现在周围组织或血液中。 alternatively，若注射了标记的细菌，可在注射后立即快速扫描感染的幼虫，以确认细菌仅存在于耳泡内，而未进入周围组织。如本实验所示，初始局部感染的显微注射位点可用于研究白细胞趋化性。通过苏丹黑染色中性粒细胞颗粒，或使用表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼品系进行甲醛固定以观察荧光，均可定量分析白细胞的募集情况。利用在巨噬细胞或中性粒细胞中特异性表达Dendra2的转基因斑马鱼品系发现，将NEA注射至耳囊后，可在感染后60分钟内触发中性粒细胞和巨噬细胞的募集以及对细菌的吞噬作用。在本图中，DRA 标记了两个在感染后五小时被招募至耳囊的巨噬细胞，对其进行光转化后，再追踪接下来 24 小时内的迁移情况。尽管部分光转化后的细胞仍停留在耳囊或头部区域，但也有一些细胞扩散至幼鱼全身，如此处所示。观看本视频后，您应已充分掌握如何将无乳链球菌（streptococcus n EEA）微量注射至受精后三天龄的斑马鱼耳囊中。此过程包括：一、将麻醉后的幼虫排列在注射模具上，并用细菌接种物填充针头；二、向内耳囊内显微注射细菌；三、将感染的幼虫固定在低熔点琼脂糖中；四、使用共聚焦显微镜对宿主白细胞进行荧光标记，并在活体中成像白细胞与病原体的相互作用。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

先天免疫反应中的斑马鱼幼体型号无创成像<em&gt;链球菌iniae</em&gt;感染

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本研究描述了一种基于荧光显微镜技术的斑马鱼胚胎模型，可用于活体可视化及随时间动态进行生物材料相关感染的活体分析。该模型是一种有前景的研究体系，可作为小鼠等哺乳动物模型的补充，用于体内研究生物材料相关感染。...

一种用于活体可视化及活体分析生物材料相关反应的斑马鱼胚胎模型 金黄色葡萄球菌 感染

了解斑马鱼幼体耳囊显微注射链球菌的无创活体成像方法。该技术结合光标记与共聚焦显微镜，实现宿主免疫应答的实时追踪，为研究宿主-病原体相互作用提供可视化平台。

Streptococcus iniae 感染的斑马鱼幼体模型中先天免疫反应的非侵入性成像

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