Name: 低聚淀粉样蛋白-β的立体灌注到小鼠海马 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解立体定位注射低聚淀粉样蛋白-β至小鼠海马齿状回的实验方法。该技术可精确递送Aβ1-42至特定脑区，用于研究阿尔茨海默病中神经元毒性机制及神经退行性病变过程。

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本工作获得了美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目NS081333（资助对象：CMT）、阿尔茨海默病协会资助项目NIRG-10-171721以及美国国家精神卫生研究所资助项目MH096702（资助对象：UH），以及由美国国家老龄化研究所资助的哥伦比亚大学阿尔茨海默病研究中心试点项目AG008702（资助对象：YYJ和JB）的支持。

注意：所有动物实验均遵循机构和国家关于实验动物护理与使用的指南。
1. 准备手术器械和手术用溶液
<ol>
	<li>将所有不锈钢外科手术器械进行高压灭菌。</li>
	<li>用无菌分子级去离子蒸馏水稀释200 proof的无水乙醇，配制70%乙醇。</li>
	<li>将29 G针头连接至汉密尔顿注射器。用纳米纯水反复吸取并推出1分钟，清洗汉密尔顿注射器和针头内部。再用70%乙醇重复此操作。
	<ol>
		<li>从汉密尔顿注射器上取下活塞和针头，在层流罩中过夜晾干。</li>
		<li>使用前用紫外线照射针头和注射器30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将NaCl溶解于分子级水中，配制成终浓度为0.9%（重量/体积）的生理盐水溶液。用0.2 μm孔径滤器过滤溶液，进行灭菌。</li>
</ol>
2. 准备寡聚化 Aβ1-42
<ol>
	<li>按照 Fa' 及其他作者发表的方法13，将重组人 Aβ1-42 在 DMSO 中单体化并重悬至 5 mM。</li>
	<li>在手术前一天，用无菌（1×）PBS 将 5 mM Aβ1-42 稀释至 100 µM。</li>
	<li>通过吹打充分混匀溶液。</li>
	<li>将 Aβ1-42 溶液在 4˚C 下孵育 12 小时。 
	注意：对照溶液（如将 DMSO 稀释于 PBS 中，或使用错序/反向 Aβ1-42 肽）应与 Aβ1-42 以相同方式制备。</li>
</ol>
3. 确定注射坐标
<ol>
	<li>利用成年小鼠脑图谱确定目标脑区的精确前后（AP）、内外（ML）和背腹（DV）坐标14。 
	&#8203;注意：为说明该技术，我们选择海马齿状回作为靶区，其相对于前囟的坐标如下：AP，-2.00 mm；ML，±1.3 mm；DV，-2.2 mm。AP值前的负号表示该位置位于前囟后方2.00 mm处。ML值前的±符号表示从中线向左和向右的方向。最后，DV值前的负号表示从脑表面向腹侧方向移动。</li>
</ol>
4. 立体定位仪设置
<ol>
	<li>佩戴外科口罩、洁净的实验服和无菌外科手套。</li>
	<li>使用70%乙醇擦拭立体定位仪和小鼠适配器。</li>
	<li>在操作台面上铺上无菌手术单。</li>
	<li>将带有小鼠适配器的立体定位仪放置在无菌手术单上。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭小鼠加热垫。将加热垫置于立体定位仪底座上方，并使用通用实验室标签胶带将其固定在小鼠适配器床面上。
	<ol>
		<li>根据制造商说明，将加热垫连接至温水循环泵。</li>
		<li>打开温水循环泵，将温度设定为37 °C，然后等待其达到设定温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明，通过将装有29 G针头的50 µl Hamilton注射器旋紧到电动垂直注射轴上，将其固定在立体定位仪上。</li>
	<li>打开 bead sterilizer（珠式灭菌器），并等待其达到制造商预设温度。 
	注：该设备用于在不同动物之间对不锈钢器械进行灭菌。器械需与灭菌珠接触20秒方可完成灭菌。</li>
	<li>打开加热板并将其温度设置为42 °C，然后将一个洁净的空笼子放在上面。</li>
	<li>当Hamilton注射器固定在立体定位仪上时，使用电动立体定位注射器吸取Aβ1-42 溶液。 
	&#8203;注：先吸入超过4 μl的溶液至注射器中，然后使用立体定位注射器设定注射体积。操作注射器时请遵循制造商的说明。</li>
</ol>
5. 动物准备
<ol>
	<li>使用电子天平测定小鼠的体重。</li>
	<li>通过腹腔注射（IP）给予氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉，剂量为氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg。通过夹趾反射消失来监测麻醉深度。</li>
	<li>小鼠麻醉后，使用毛发剪刀剃除头部毛发，暴露颅骨表面的皮肤。</li>
	<li>将小鼠放置在立体定位仪的加热垫上。</li>
	<li>使用刮匙打开小鼠口腔，并将门齿固定在门齿夹中。将鼻部固定装置覆盖在小鼠面部，轻轻夹紧，避免过紧。</li>
	<li>将双侧耳杆插入外耳道以固定头部。移动每侧耳杆直至接触颅骨，然后旋转螺钉将其锁定。
	<ol>
		<li>为确认头部已牢固固定，可用食指轻轻下压头部。若头部固定良好，则按压时不会松动或移动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小鼠眼部滴加眼膏或眼药水以保持湿润。确保在整个手术过程中眼睛保持湿润。</li>
	<li>使用无菌棉签对颅骨表面皮肤进行手术区域消毒，先涂抹聚维酮碘溶液，再使用70%乙醇。重复交替使用聚维酮碘和70%乙醇清洁过程共两次。</li>
</ol>
6. 手术与灌注
<ol>
	<li>使用手术刀在头皮正中线处做一个 2-3 mm 的切口，然后使用直头精细剪刀将切口延长至 1.0-1.5 cm，以暴露颅骨上的矢状缝、前囟（bregma）和后囟（lambda），这些是立体定位坐标所依据的解剖标志。使用微型夹钳将皮肤固定并分开。 
	注意：前囟（bregma）和后囟（lambda）的位置详见小鼠脑图谱《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》14。</li>
	<li>取一根棉签，蘸取无菌生理盐水，清洁颅骨表面，然后使用干净干燥的棉签将颅骨擦干。</li>
	<li>使用无菌细尖笔在前囟（bregma）处标记一个点。使用立体定位仪上的微操纵器调整 Hamilton 注射器的位置，使针尖刚好接触前囟处的标记点。
	<ol>
		<li>记录背腹（DV）坐标。</li>
		<li>为检查颅骨的前后（AP）轴是否水平，将 Hamilton 注射器向后移动，使针尖接触后囟（lambda）点。</li>
		<li>记录此时的 DV 位置。确保前囟与后囟的 DV 坐标差异在 0.5 mm 以内。 
		注意：目标是尽量减小前囟与后囟之间的 DV 坐标差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖重新移回前囟标记点。</li>
	<li>记录起始的前后（AP）位置。</li>
	<li>通过从起始 AP 坐标减去 2.00 mm，计算出目标 AP 位置。</li>
	<li>使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖重新定位至最终的 AP 坐标。</li>
	<li>记录当前的内外侧（ML）坐标。</li>
	<li>通过在起始 ML 坐标基础上加或减 1.3 mm，计算出左侧和右侧的目标 ML 坐标。</li>
	<li>使用微操纵器将 Hamilton 注射器针尖移动至任一侧的目标 ML 坐标。
	<ol>
		<li>将针尖轻触颅骨表面两侧的目标 ML 坐标点，记录各自的 DV 坐标，并确保两者差异在 0.5 mm 以内。 
		注意：目标是尽量减小两个目标 ML 坐标点之间的 DV 坐标差异。</li>
		<li>在任一侧目标坐标处，将针尖抬高 0.5-1 cm 超出颅骨表面。使用无菌细尖笔在颅骨表面标记一个点。对对侧颅骨重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Hamilton 注射器移开操作区域。</li>
	<li>将 0.8 mm 钻头安装至钻机上。双手持握钻机，将肘部置于操作台面以保持稳定，将钻头置于左侧或右侧 ML 标记点略上方。启动钻机，缓慢下压钻头在颅骨上钻孔。对对侧颅骨重复此步骤。 
	注意：新钻的孔可能会有少量出血。若发生出血，使用干净干燥的棉签轻轻吸除血液。</li>
	<li>将 Hamilton 注射器重新移至任一侧新钻的 ML 孔上方。缓慢下放注射针，使其刚好穿过颅骨。此时需特别小心，避免刺入脑组织。为确认针尖已穿过颅骨但未穿出骨孔，可用食指轻轻推动针体，确保针尖未从孔中滑出。</li>
	<li>记录起始的背腹（DV）坐标。</li>
	<li>通过从起始 DV 坐标减去 2.2 mm，计算出目标 DV 坐标。</li>
	<li>将针缓慢下放至目标 DV 坐标位置。</li>
	<li>启动立体定位注射泵，以 0.5 µl/min 的速率向齿状回注入 4 µl 的 Aβ1-42。</li>
	<li>注射完成后，保持针尖在原位静置 1 分钟，以尽量减少溶液从注射部位回流。</li>
	<li>将针移至大脑对侧，重复步骤 6.13–6.18。</li>
</ol>
7. 动物移除与术后护理
<ol>
	<li>拧下耳杆和面部/鼻部护具，将小鼠从装置中取出。</li>
	<li>使用标准学生用镊子闭合头皮，然后用缝线封闭伤口。</li>
	<li>通过腹腔注射1 ml无菌生理盐水，以补充水分。</li>
	<li>皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）以缓解疼痛。</li>
	<li>将小鼠置于放置在42 °C加热板上的清洁空笼中，直至其苏醒，随后将其放回饲养笼，提供充足的食物和饮水。</li>
	<li>为缓解疼痛，每12小时皮下注射一次布托啡诺，持续3天。</li>
</ol>
8. 拆线
<ol>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉，剂量为每千克体重100 mg氯胺酮和10 mg赛拉嗪。注意：此操作在手术后7-10天进行。</li>
	<li>使用学生标准型镊子和直头精细剪刀拆除缝线。</li>
	<li>通过腹腔注射向小鼠注入1 ml无菌生理盐水以补充水分。</li>
	<li>将小鼠置于设置在42 °C加热板上的清洁空笼中，直至其苏醒，然后将其放回饲养笼，提供充足的食物和饮水。</li>
</ol>
9. 动物安乐死与组织处理
<ol>
	<li>麻醉小鼠，并用4%多聚甲醛灌流15，取出脑组织，进行冷冻切片处理16。 
	注意：动物处死的时间由实验者决定。但在我们的研究中，选择术后7天和14天进行。</li>
</ol>

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<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

为了成功进行 Aβ1-42 注射，实验人员或外科医生必须做到：1）采用无菌技术；2）根据准确的坐标正确定位目标脑区；3）能够将小鼠正确固定在立体定位仪上，并使脑部在前后（AP）和内侧-外侧（ML）轴向上保持水平；4）具备精确操作显微操纵器的能力；5）确保术后护理得当。若遵循这些关键步骤，小鼠应能存活且无明显感染迹象。
与体外（in vitro）研究一致，我们及其他研究者已证实，将Aβ1-42直接注入海马体会导致神经元死亡1,4,9,10，这体现了阿尔茨海默病（AD）的关键特征之一。神经退行性变在注射部位周围表现明显，表现为齿状回体积减小，并伴随神经退行性变标志物的增加1。此外，投射至海马体的胆碱能神经元发生逆行性死亡，这通过基底前脑（BF）中胆碱能标记物减少以及TUNEL阳性染色增加得以证实1,10。因此，这种体内（in vivo）模型是研究Aβ1-42局部半急性效应的优良模型。该注射模型的主要优势在于其动态特性：可...

由淀粉样蛋白-beta（Aβ1-42）组成的淀粉样斑块沉积是阿尔茨海默病（AD）病理学的关键特征。大量研究表明，高水平或毒性浓度的重组寡聚体Aβ1-42可引发神经元死亡、突触营养不良、突触丢失与功能障碍，以及学习和记忆能力下降1-4。受累脑区包括海马、皮层以及基底前脑和杏仁核等皮层下结构5,6。迄今为止，已有多种转基因小鼠模型试图模拟AD中的Aβ1-42病理变化。根据不同品系，这些动物模型在研究AD特定病理特征方面具有一定价值。然而，遗憾的是，除APP23和5XFAD两个转基因品系外，其他小鼠模型均未能完全再现AD中神经元丢失这一关键病理特征。即使在APP23和5XFAD小鼠中观察到神经元丢失，其神经元死亡程度也较为轻微，且具有年龄依赖性，仅局限于少数特定脑区7,8。
将寡聚体 Aβ1-42 直接注入野生型小鼠脑内，可建立一种优良的体内模型，用以模拟淀粉样蛋白病（amyloidopathy）中的神经元死亡特征1,9,10。与常用的转基因小鼠模型不同，寡聚体 Aβ1-42 注入模型更适合在空间和时间上精确地急性升高 Aβ1-42 水平。采用野生型小鼠的优势在于可避免转基因小鼠品系中因引入突变而可能产生的代偿效应或副作用。以往研究表明，在海马体内注入毒性浓度的 Aβ1-42 后，注射部位周围神经元可在1周内出现死亡1。此外，由于已知 Aβ1-42 对胆碱能神经元具有毒性作用11，在小鼠中注入β-淀粉样蛋白后7至14天内，投射至海马体的基底前脑胆碱能神经元（BFCN）群体数量减少20%-50%1,10，从而有效实现对脑内特定神经环路的独立研究。由于BFCN主要同侧投射至海马体齿状回12，因此在大多数情况下，对照/溶剂和寡聚体 Aβ1-42 溶液可分别注射于大脑两侧，从而实现左右半球之间的比较1。
本报告将提供针对成年野生型 C57BL/6J 小鼠的详细外科手术及注射方法。选择该小鼠品系是因为其在科研中被广泛使用。从技术上讲，可将任何脑区作为灌注靶点，但本文将以海马齿状回作为靶区来演示该技术。

<table><tbody><tr><td>盐酸氯胺酮（100 mg/ml）</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>每1 kg动物使用100 mg氯胺酮</td></tr><tr><td>赛拉嗪（20 mg/ml）</td><td>Henry Schein Medical</td><td>暂无内容</td><td>每1 kg动物使用10 mg 咪唑啉酮</td></tr><tr><td>布托啡诺（Buprenex，0.3 mg/ml）</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>每1 kg动物使用0.1 mg布托啡诺</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>not available</td><td>100 &amp;mu;M；该淀粉样蛋白在论文中被使用</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用</td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>可替代Teplow实验室的淀粉样蛋白使用</td></tr><tr><td>随机序列 A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>可用作对照肽，用于比较 A&amp;beta;1-42</td></tr><tr><td>NU4 抗体（寡聚淀粉样蛋白抗体）</td><td>William Klein/西北大学惠赠</td><td>未提供待译文本</td><td>1:2,000 稀释度</td></tr><tr><td>抗淀粉样蛋白寡聚体抗体&amp;nbsp; （兔多克隆）</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>可替代 Nu4 使用；需要&amp;nbsp; 由最终用户进行测试</td></tr><tr><td>6E10 抗体（单克隆小鼠）（淀粉样蛋白抗体）</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>1:1,000 稀释度</td></tr><tr><td>ChAT 抗体（多克隆山羊）</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>1:100 稀释</td></tr><tr><td>DeadEnd 荧光 TUNEL 检测试剂盒</td><td>普洛麦格</td><td>G3250</td><td>遵循制造商的使用说明</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>使用于盖玻片盖片时</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>未提供待译文本</td><td>2% 溶液</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 proof）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>用于配制70%乙醇以进行消毒和灭菌</td></tr><tr><td>Novex 10-20% Tricine 胶</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>用于分离A&amp;beta;1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 电泳缓冲液 (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>用于运行10-20% Tricine凝胶</td></tr><tr><td>Novex Tris-甘氨酸转膜缓冲液（25X）</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>用于转移10-20% Tricine凝胶</td></tr><tr><td>SuperSignal 蛋白质印迹增强剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>46640</td><td>用于增强A&amp;beta;1-42 信号；遵循制造商方案</td></tr><tr><td>Protran BA79 硝酸纤维素印迹膜，0.1 &amp;mu;m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>用于转移10-20% Tricine凝胶</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>用于运行10-20% Tricine凝胶的电泳装置</td></tr><tr><td>GenTeal 润滑眼用凝胶</td><td>诺华</td><td>暂无内容</td><td>用于在手术期间保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买&lt;br /&gt;&amp;#160;&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[标题]</td></tr><tr><td>Refresh Optive 润滑型滴眼液</td><td>Allergan</td><td>未提供待译文本</td><td>用于手术期间保持小鼠眼睛湿润；可在当地药店购买；可替代GenTeal使用</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>斯托尔ティング</td><td>50998</td><td>用于消毒和灭菌</td></tr><tr><td>圆形/锥形刮铲&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>用于打开动物口腔</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefines 止血钳（钳口尺寸 9×1.6 mm；长度 28 mm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-28</td><td>可选；用于注射时保持头皮皮肤分离</td></tr><tr><td>直头精细剪刀（刃长25 mm；全长11.5 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>用于切割头皮</td></tr><tr><td>#3 手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>用于制作头皮切口</td></tr><tr><td>学生用标准型镊子（尖端尺寸 2.5×1.5 mm；长度 11.5 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>缝合时用于固定头皮闭合</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>用于剃除毛发</td></tr><tr><td>T/Pump 温水循环器&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>TP-700</td><td>用于手术期间动物保温</td></tr><tr><td>可重复使用加热垫（5&quot; 10 倍&quot;)</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>用于将其连接至T/Pump温水循环器，以在手术期间为动物保温</td></tr><tr><td>无线微型钻机</td><td>斯托尔廷</td><td>58610</td><td>使用0.8 mm钢钻头在颅骨上钻孔</td></tr><tr><td>用于小鼠的实验室标准立体定位仪 &amp;和新生大鼠适配器</td><td>斯托尔ティング</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>仅用于小鼠立体定位仪</td><td>斯托尔ティング</td><td>51730</td><td>可替代 Stoelting 目录号 #51615 使用</td></tr><tr><td>经典的立体定位注射器</td><td>斯托尔廷</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>干玻璃珠灭菌器</td><td>斯托尔廷</td><td>50287</td><td>用于不锈钢器械的灭菌</td></tr><tr><td>无菌手术巾（18&quot; x 26&quot;)</td><td>斯托尔ティング</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 50 ml 注射器，型号 705 RN SYR，NDL</td><td>Hamilton公司</td><td>7637-01</td><td>用于脑内注射时；不同溶液应使用不同的注射器</td></tr><tr><td>29 G 针头，小 hub RN NDL</td><td>Hamilton公司</td><td>7803-06</td><td>用于连接 Hamilton 注射器以进行脑部注射</td></tr><tr><td>1 ml BD 结核菌素注射器</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>用于麻醉和生理盐水给药</td></tr><tr><td>30 G 针头（0.5&quot;)</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>用于麻醉和生理盐水给药</td></tr><tr><td>Ohaus 便携式电子 CS 系列天平</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>用于称量动物以确定麻醉剂量</td></tr><tr><td>热板（顶板尺寸：7.25英寸×7.25英寸）</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>术后动物保温</td></tr><tr><td>Sofsilk 丝线缝合线 C-1 3/8弧，12 mm，带切割针</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>缝合伤口</td></tr><tr><td>Vetbond 组织粘合剂 (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>可选：辅助伤口闭合；与缝合线配合使用。</td></tr><tr><td>无菌棉签（木柄）</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>用于清洁和干燥手术伤口</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-550-15</td><td>用于收集脑切片</td></tr><tr><td>VWR 显微盖玻片 24 × 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>用于载玻片的封片</td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Nalgene 注射器滤器 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>用于生理盐水溶液的灭菌</td></tr><tr><td>Viscot Medical 无菌双头皮肤标记笔</td><td>医学索引</td><td>VIS1422SRL91</td><td>用于标记颅骨上的坐标</td></tr></tbody></table>

小鼠海马内立体定位注射寡聚化β-淀粉样蛋白

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

阿尔茨海默病是一种影响老年人群的神经退行性疾病。该疾病的关键神经病理学特征是淀粉样蛋白-β的过度产生及其在患者脑区的淀粉样蛋白-β斑块沉积。多年来，科研人员已构建了多种阿尔茨海默病小鼠模型，试图模拟淀粉样蛋白-β的病理过程。然而，这些小鼠模型仅能部分模拟疾病的特征。在阿尔茨海默病患者大脑中显著存在的神经元死亡现象，在这些小鼠模型中却明显缺失。因此，我们及其他研究者采用了一种直接将可溶性寡聚态淀粉样蛋白-β——已被证实对神经元毒性最强的形式——通过立体定位注射方式注入脑内的方法。本报告中，我们使用雄性C57BL/6J小鼠，记录这种在特定脑区提高淀粉样蛋白-β水平的外科手术技术。注射靶点为海马体的齿状回，因为该脑区与通过胆碱能神经环路相连的基底前脑共同构成了疾病中发生退变的主要区域之一。通过立体定位注射在齿状回提高淀粉样蛋白-β水平的结果显示，1周内即可观察到齿状回神经元丢失增加，同时伴有基底前脑Broca斜角带垂直支中细胞死亡及胆碱能神经元丢失的同步增加。这些效应可持续至2周。我们的数据表明，当前的淀粉样蛋白-β注射模型为在短期内研究特定脑区神经元死亡提供了一种替代性小鼠模型。该模型的优势在于，淀粉样蛋白-β的升高可实现空间和时间上的精确控制。

本方法制备的人重组寡聚体Aβ1-42可获得由单体、二聚体、三聚体和四聚体组成的可溶性寡聚物（图1A）。大量研究表明，这些低分子量的Aβ1-42物种（而非纤维和斑块）在多种情况下对神经元毒性最强1,4,9,17-19。为确定寡聚体Aβ1-42是否可诱导小鼠脑内神经元死亡，将Aβ1-42（4 µl，100 µM储备液）注入9月龄野生型C57BL/6J小鼠单侧海马齿状回（DG）。C57BL/6J小鼠海马重量约为0.018 g，因此Aβ1-42的递送剂量约为100 μg/g。同一只小鼠脑的对侧DG则注入对照/载体溶液作为比较，该溶液由溶解Aβ1-42时所用等体积的DMSO稀释于（1×）PBS中制成。如前所述，也可使用乱序或反向Aβ1-42肽段作为对照，因为我们先前发现其对海马神经元无影响1。由于注射针头进入脑组织会造成局部损伤（图1B），并最终导致DG塌陷，因此我们选择在注射 tra...

此处介绍一种直接立体定位脑内灌注淀粉样蛋白β的实验方案。该方法提供了一种替代性策略 体内 用于研究淀粉样蛋白-beta 对脑神经元短期影响的小鼠模型

阿尔茨海默病是一种影响老年人群的神经退行性疾病。该疾病的关键神经病理学特征是……

本实验的总体目标是将寡聚态 Aβ1-42 立体定位注射至海马齿状回。该过程首先需要配制寡聚态 Aβ1-42 溶液，第二步是确定注射的定位坐标。接下来，通过外科手术暴露动物的颅骨，并在颅骨上钻两个用于插入针头的小孔。最后一步是将注射器针头移至最终位置，并注入β1-42。最终，立体定位Abeta 1-42注射法用于研究Abeta 1-42在活体动物中的毒性作用。与现有的转基因 Aβ42 小鼠模型相比，该技术的主要优势在于能够以特定的空间和时间方式提高寡聚化 Aβ42 水平，并可可靠地重现转基因小鼠模型所缺乏的细胞死亡病理特征。该方法有助于回答阿尔茨海默病领域中的关键问题，例如阿尔茨海默病中病理过程如何扩散。开始该操作时，剃除麻醉小鼠头部的毛发以暴露皮肤。接下来，将小鼠放置于立体定位仪中的加热垫上。然后将小鼠的门齿固定在门齿夹中，并在其面部安装鼻部固定装置。随后，将耳杆插入小鼠的耳廓，以固定头部并进行检查。如果头部已固定，轻轻按压并确保其无移动。然后在双眼涂抹眼膏以保持湿润。之后用棉签蘸取碘伏对颅骨部位的皮肤进行消毒，再用70%乙醇擦拭。用碘伏和乙醇交替清洁再重复两次。现在用手术刀在头皮正中线处做一个2至3毫米的切口。使用直的精细剪刀将切口延长至约1.0厘米，以暴露颅骨的矢状缝bgma以及人字缝。之后，使用镊子将皮肤撑开。用无菌棉签蘸取无菌生理盐水清洁颅骨，再用干净的干棉签将颅骨擦干。接下来，标记一个点。使用显微操作器将Hamilton注射器置于Bregma位置，使针尖恰好接触bgma上的标记点。然后记录背腹（DV）坐标，并在Lambda点处标记一个点，通过将注射器向Lambda点后方移动，确保颅骨的前后（AP）轴处于水平位置。针尖应接触Lambda点，就像其接触bgma点一样。之后，记录DV位置。Bre、MA和Lambda的DV坐标应在0.5毫米以内。现在将针尖重新返回至 BMA 点。记录起始的前后位（AP）位置，然后通过从起始 AP 位置减去 2 毫米来计算终止的 AP 位置。将注射器针头调整并重新定位至最终的前后（AP）坐标。接着，记录当前的内外（ML）坐标。通过在起始的内外（ml）坐标上加减1.3毫米，计算左侧和右侧的终点ml坐标。将注射器针头移动并定位至终末的ML坐标位置。将针尖轻触颅骨表面的两个终末ML坐标点，并确保DV坐标在0.5毫米范围内。到达终末ML坐标后，将针头从颅骨上方上提0.5至1厘米。使用深色超细记号笔在颅骨上标记一个点。对颅骨的对侧重复此步骤。然后将注射器移开。在颅骨的左侧或右侧 ml 处使用 0.8 毫米钻头钻孔。对对侧重复此步骤。随后，将注射器移至新引入的孔之一。将针头降低至刚好穿过颅骨的位置，并注意不要刺破脑组织，以确保针头已通过颅骨。轻轻将针头抵住颅骨，以确保针头不会从孔中脱出。接下来，记录起始的背腹（DV）坐标。通过从起始DV坐标减去2.2毫米来计算终止DV坐标，并将针头降至终止的背腹位置。定位后，将立体定位注射泵设置为以每分钟0.5微升的速度向齿状回注入4微升的β1-42。注射完成后，让针头在原位停留额外1分钟，以尽量减少溶液从注射部位回流。随后，将针头移至大脑另一侧，并重复上述操作。现在，拧松耳杆。使用学生标准型镊子将头皮拉拢闭合，并用缝线封闭伤口。取下鼻罩，移走小鼠。首先，向小鼠注射一毫升无菌生理盐水以补充水分，并皮下注射布托啡诺（0.1 毫克/千克）以缓解疼痛。随后，将小鼠转移至置于 42 °C 加热板上的清洁空笼中，直至其苏醒。然后将小鼠放回饲养笼，提供充足的食物和饮水。该图显示了在九月龄小鼠的左右侧齿状回分别注入Aβ1-42和对照溶剂。虚线表示注射轨迹，箭头指示萎缩的齿状回。在注射Aβ1-42后一周内，齿状回的分子层及靠近注射位点的多形细胞层在第7天和第14天均表现出Aβ1-42水平升高。Abeta 1-42 引起了隧道阳性染色增加和齿状回厚度减少，证实了 Abeta 1-42 的神经退行性效应。在此实验中，逆行示踪剂氟金（fluoro gold）与 Abeta 1-42 共同注射至齿状回。注射后 7 天，在基底前脑检测到氟金，提示该标记物通过胆碱能神经元发生了逆行运输。选择基底前脑中FluoroGold阳性神经元进行定量分析。注射后7天，Aβ1-42引起TUNEL升高和ChAT降低。掌握该技术后，若操作得当，可在约30分钟内完成基底前脑阳性神经元的检测。通过该实验步骤，还可采用其他方法进一步回答更多问题，例如开展分子机制研究，以探讨淀粉样蛋白灌注对大脑的机制性影响。感谢您观看我们的视频，希望该方法对您的实验有所帮助。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

低聚淀粉样蛋白-β的立体灌注到小鼠海马

阿尔茨海默病的一个特征是Aβ1-42肽水平升高。本文提供了一种合成Aβ1-42寡聚体的实验方案，该寡聚体可损害海马区的长时程增强作用（Long-Term...

制备寡聚态β-淀粉样蛋白1-42并诱导海马脑片突触可塑性损伤

本视频演示了一种将淀粉样蛋白β（Aβ）肽特异性抗体持续灌注至大鼠海马区的技术。该研究采用植入双侧套管系统，以实现对Aβ肽特异性抗体的可控灌注，同时向大鼠海马区灌注可溶性Aβ寡聚体（Aβo），用于研究寡聚体与抗体之间的相互作用。...

将 Aβ 肽特异性抗体和 Aβ 寡聚体可控灌注至大鼠海马区

本视频展示了将淀粉样蛋白 β 精确定位注入小鼠齿状回以建立阿尔茨海默病小鼠模型的操作过程。准确的坐标定位和可控的淀粉样蛋白 β...

直接立体定位脑内注射淀粉样蛋白-β构建阿尔茨海默病模型

来源：Arango-Lievano, M. 等，中枢神经系统疾病的脑血管纵向活体成像研究。J. Vis. Exp.

阿尔茨海默病小鼠模型中脑血管与淀粉样斑块的活体成像

来源：Slezia, A. et al. 电泳递送γ-氨基丁酸（GABA）至癫痫灶可预防小鼠癫痫发作。J. Vis. Exp.

电泳递送GABA至麻醉小鼠的癫痫灶

microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内...

向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

淀粉样蛋白-β（Aβ）注射动物模型可实现对特定数量和种类的Aβ片段进行给药，并减少各研究组内的个体差异。本方案描述了无需使用立体定位仪器即可进行脑室内（ICV）注射Aβ的方法，可在正常小鼠中诱导出类似阿尔茨海默病的行为异常。...

向正常小鼠脑室内注射淀粉样-β肽以急性诱导类阿尔茨海默病认知缺陷

本文阐述了如何通过光遗传学工具的病毒转导与冰冻断裂复型免疫标记技术相结合，对具有已鉴定的突触前和突触后成分的突触处神经递质受体的表达进行定量，并分析其分布模式。...

结合光遗传学与冰冻断裂复制免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布

通过渗透泵输注抗体治疗可抵消慢性β-淀粉样蛋白寡聚体灌注动物模型中的神经退行性变

超声引导下小鼠前脑微注射 子宫内 在E9.5时

了解立体定位注射低聚淀粉样蛋白-β至小鼠海马齿状回的实验方法。该技术可精确递送Aβ1-42至特定脑区，用于研究阿尔茨海默病中神经元毒性机制及神经退行性病变过程。

小鼠海马内立体定位注射寡聚化β-淀粉样蛋白

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