Name: 巨细胞病毒特异性的自动化细胞富集的T细胞用于使用细胞因子捕获系统的临床应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T15:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用细胞因子捕获系统自动化富集巨细胞病毒特异性T细胞的方法。该技术无需GMP设施即可生产临床级CD4和CD8阳性T细胞，用于过继免疫治疗，提高细胞治疗的可及性和效率。

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我们感谢德国 Miltenyi Biotec 提供用于评估研究的试剂和 CliniMACS Prodigy 仪器。我们感谢 George T. McNamara（美国安德森癌症中心儿科）对稿件的校对。基金支持：癌症中心核心资助（CA16672）；RO1（CA120956，CA124782，CA141303；CA141303）；R33（CA116127）；P01（CA148600）；Burroughs Wellcome 基金会；德克萨斯州癌症预防与研究所；CLL 全球研究基金会；Noelan L. Bibler 遗产基金；Gillson Longenbaugh 基金会；Harry T. Mangurian, Jr. 白血病免疫治疗基金；个性化癌症治疗研究所；白血病与淋巴瘤学会；淋巴瘤研究基金会；MDACC 姐妹机构网络基金；Miller 基金会；Herb Simons 先生；Joe H. Scales 先生及夫人；Thomas Scott 先生；国家癌症研究基金会；儿科癌症研究基金会；William Lawrence 和 Blanche Hughes 儿童基金会。

1. 在无菌条件下准备材料（参见材料与设备表）
<ol>
	<li>配制3 L PBS/EDTA缓冲液，并加入人血清白蛋白（HSA）至终浓度为0.5%（w/v）。</li>
	<li>准备1 L临床级0.9%氯化钠（NaCl）溶液和2 L符合GMP标准的细胞培养基。</li>
	<li>通过将一管CMV pp65溶解于8 ml无菌水中，重悬获得60 nmol的CMV特异性肽抗原混合物。</li>
	<li>使用鲁尔接头/穿刺连接器将CMV pp65肽混合物转移至50 ml冷冻袋中，并用锁紧止血钳夹闭，防止混合物进一步流入管路系统。在无菌条件下打开细胞富集管路系统（TS 500）。</li>
	<li>使用无菌管路焊接仪，将肽混合物冷冻袋连接至管路系统TS 500的阀2管路接口。此时切勿打开肽混合物袋的夹子。</li>
	<li>从起始细胞产品中取出1 × 109个总核细胞（TNC），重悬于含2.5% HSA的PBS/EDTA缓冲液中，总体积为50 ml。将细胞产品注入150 ml转移袋中。</li>
</ol>
2. 自动化细胞富集系统的制备与使用（参见材料与设备表）
<ol>
	<li>启动细胞富集系统（图1B），并选择程序“CCS_IFN-γ Enrichment”。观察用户界面，屏幕上会显示操作步骤说明和图片，指导操作人员完成整个流程。</li>
	<li>输入参数“操作人员”和“管路套装部件号”。随后，根据交互式监视器屏幕上的指示，将管路套装500安装到自动细胞富集装置上。</li>
	<li>按照屏幕显示的逐步说明，将培养基和缓冲液连接至设备。在连接仪器前，记录试剂的目录号和批号。</li>
	<li>完成管路套装的最终检查后，打开肽混合物袋的夹子。打开培养基袋，启动管路套装的自动预冲洗程序。</li>
	<li>预冲洗步骤完成后，使用无菌管路焊接仪将HSA（2.5%）加入储液袋中的NaCl缓冲液（200 ml）。使用无菌管路焊接仪将起始细胞产品转移至“上样袋”中。</li>
	<li>通过适配器将CCS（IFNγ）试剂连接至相应的管路。输入在富集过程开始前希望收集的细胞材料部分的目标时间。检查并确认所有输入数据/参数的准确性，然后启动程序。</li>
	<li>在自动细胞富集过程开始前，取下质量控制袋（QCB，原始组分（ori）包含约1.3 ml，来自100 ml腔室内容物，用PBS/EDTA缓冲液稀释）。密封QCB，称重，并在4 °C下保存。</li>
	<li>启动富集过程。过程结束后，目标细胞将从储液袋中以一定体积的洗脱缓冲液被洗脱出来。</li>
	<li>密封非目标细胞袋（NTCB，阴性组分 = neg）和目标细胞袋（TCB，阳性组分 = pos），并对每个袋子进行称重。这些重量数据将用于后续细胞数量的计算。</li>
	<li>富集程序完成后，立即为每个组分取两份等分试样用于流式细胞术分析，其余样品在4 °C下保存。一份试样用于细胞计数测定，另一份用于富集效果分析（表1）。</li>
	<li>从细胞富集仪器上取下管路套装。将日志文件传输至U盘以备后续使用。 
	注意：&#160; 所有试剂均应在无菌条件下配制。强烈建议使用II级生物安全柜。使用从健康CMV血清阳性供体分离的稳态单采细胞产品（非动员型）来富集CMV抗原特异性T细胞。仅可使用经FDA批准的HSA。细胞制备所用缓冲液应保持在&#160;+19 °C至+25 °C范围内，因为环境温度过低或过高均会导致目标细胞纯度和得率下降。</li>
</ol>
3. 细胞计数测定
<ol>
	<li>取QCB、NTCB和TCB的等分试样进行细胞计数，如表1所示。向每份等分试样中加入CD45-VoBlue（滴度1:11），在4 °C避光孵育10分钟。</li>
	<li>向原始组分和阴性组分中加入1.5 ml新配制的红细胞裂解液（1x），向阳性组分中加入450 µl新配制的红细胞裂解液，并将所有组分在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>分析前立即加入碘化丙啶，使其终浓度为1 µg/ml（将100 µg/ml原液按1:100稀释）。使用自动细胞计数仪测定细胞数量和活力。使用细胞计数仪配套推荐软件进行流式细胞术分析。测定原始组分、阴性组分和阳性组分中白细胞的绝对数量。 
	&#160;注意：每毫升样品中活白细胞的数量通过细胞分析仪推荐软件确定。</li>
	<li>按图2所示设定区域（区域5，活白细胞）。采用以下设门策略确定细胞数量。原始组分中的一个活白细胞示例如图2所示。</li>
	<li>所示区域（图2, 1-6）的层级关系如下： 
	1: 时间门 → 2: 单细胞 → 3: CD45+ 细胞 → 4: 白细胞（排除碎片） → 5: 活白细胞 → 6: 活淋巴细胞</li>
	<li>重复相同步骤以测定阴性和阳性组分的细胞数量。根据样品的稀释因子和组分的总体积计算整个组分的细胞数量（表2）。</li>
</ol>
4. 分离性能的检测
<ol>
	<li>用预冷的PBS/EDTA缓冲液/0.5% AB血清洗涤QCB、NTCB和TCB组分细胞的等分试样。在4 °C下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在 100 µl 抗体-荧光染料染色混合液中重悬细胞，染色液包含：CD3-FITC、CD4-APC、CD8-APC-Vio770、CD14-PerCP、CD20-PerCP、CD45-VioBlue 和抗 IFNγ-PE（滴度 1:11），4 °C 避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入1 ml 新鲜配制的红细胞裂解液（1x），在室温下孵育15分钟。在4 °C下以300 x g离心5分钟，吸除上清液。用适量PBS/EDTA缓冲液/0.5% AB血清重悬细胞。</li>
	<li>在分析前加入碘化丙啶，使其终浓度为 1 µg/ml（将 100 µg/ml 的溶液按 1:100 稀释）。进行流式细胞术分析以评估样品纯度。</li>
	<li>使用以下设门策略计算 CD3+ 活细胞白细胞中T细胞的设门策略用于确定CD3+ T细胞在CCS富集过程后的阳性组分中显示。所示区域（图3A和3B，1-6) 按以下方式逐级关联： 
	1：时间门控 → 2：单细胞 → 3：CD45+ 细胞 → 4：细胞（排除碎片） → 5：活白细胞 → 6：活CD3⁺细胞+ 细胞群体</li>
	<li>确定 CD4+、CD8+、CD4+ IFN-γ 的频率+ 和 CD8+ IFN-γ+ 经过CCS富集过程后的T细胞（表2).</li>
	<li>使用门控策略确定CD4细胞的频率+，CD8+，CD4+ IFN-γ+ 和 CD8+ IFN-γ+ 经过CCS处理后，下图显示了原始和富集（捕获）阳性组分的T细胞。所示区域按层次结构连接，命名如下： 
	1：时间门控 → 2：单细胞 → 3：CD45+ 细胞 → 4：细胞（排除碎片） → 5：活白细胞 → 6：活CD3细胞+ 细胞 → 7：CD4+ 细胞 → 7a：CD4+ IFN-γ+ 细胞（盒）→ 8：CD8+ 细胞 → 8a：CD8+ IFN-γ+ 细胞（盒） &#160;</li>
</ol>
注意：层级链接中前6个所示区域与图3（1-6）相同，后2个区域如图4（6-8a）所示。

<ol><li>Syed, B. A., Evans, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+Analyst%27s+Couch+Stem+Cell+Therapy+Market%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).</li>
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<li>Peggs, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+selected+cytomegalovirus-reactive+donor+T+cells+confer+rapid+and+safe+systemic+reconstitution+of+virus-specific+immunity+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation.</a> Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Tischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+clinical-grade+antiviral+T+cells%3A+selection+of+suitable+T-cell+donors+and+GMP-compliant+manufacturing+of+antiviral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells.</a> Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336(2014).</li>
<li>Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Costs+after+Allogeneic+Haematopoietic+Sct+Are+Associated+with+Major+Complications+and+Re-Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).</li>
<li>Leen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+of+banked+third-party+virus-specific+T+cells+to+treat+severe+viral+infections+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).</li>
</ol>

MD 安德森癌症中心和库珀博士均在 ZIOPHARM Oncology, Inc. 和 Intrexon Corporation 拥有经济利益。2015年5月7日，库珀博士被任命为 ZIOPHARM Oncology 的首席执行官。&#160; 目前，库珀博士是 MD 安德森癌症中心的访问科学家。库珀博士创立并拥有 InCellerate, Inc. 公司。他与 Sangamo BioSciences 公司在人工核酸酶方面拥有多项专利。他担任 Targazyme, Inc.（前身为 American Stem Cells, Inc.）、GE Healthcare、Ferring Pharmaceuticals、Fate Therapeutics、Janssen Pharmaceuticals 和 Bristol-Myers Squibb 公司的顾问。他还是 Cellectis 公司科学咨询委员会成员。他从 Miltenyi Biotec 公司获得酬金。

过继性T细胞治疗已成为治疗B细胞恶性肿瘤的一种可行方案4。其治疗潜力取决于输注足够数量、具有靶向抗原特异性且未发生复制性衰老的T细胞2。为此，可在符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的条件下，从扩增后的T细胞中分选出高纯度的抗原特异性T细胞群体。目前广泛采用两种分选方法，即荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠激活细胞分选（MACS），用于制备巨细胞病毒（CMV）抗原特异性T细胞，我们近期已对此进行综述5。不同策略之间的优势比较见表5。与FACS技术相比，MACS技术在成本更低、速度更快的同时，可实现最高的细胞富集纯度。此外，使用一次性柱子和试剂进行细胞富集可完全避免样本间的交叉污染，更易于在临床环境中应用。半自动化的细胞富集设备劳动强度大且耗时较长，因此为满足临床需求，开发自动化细胞富集设备势在必行。
自动细胞富集CCS装置是一种多功能仪器，可用于分离临床级细胞，例如造血干细胞、体细胞干细胞以及用于过继性转移的T细胞。该自动化装置集成了细胞处理的多个步骤，包括起始材料的组分分离、细...

造血干细胞移植（HSCT）1 可与过继性T细胞治疗联合应用，以增强移植物抗肿瘤效应，并提供对机会性感染的免疫保护2。传统上，生成供体来源的抗原特异性T细胞用于输注需要熟练的技术人员以及符合GMP标准的专用设施。此类T细胞的输注已成功清除机会性感染3，并治疗潜在的恶性疾病4。最近，研究人员已证实，仅回输数千个病毒特异性T细胞（约 1 × 104 – 2.5 × 105 个细胞/kg 受体体重）即可有效治疗异基因HSCT后出现的机会性巨细胞病毒（CMV）感染5-9。然而，由于GMP设施数量有限、相关细胞制备对技术要求较高，以及细胞生产成本高昂，患者获得此类有前景的T细胞治疗的机会受到限制10。一种分离抗原特异性T细胞的方法基于CCS技术，使用一种双特异性试剂识别CD45和IFN-γ。如图所示，该方法可利用自动化细胞富集CCS装置制备符合临床级标准的CMV特异性T细胞（图1B）。
通过将来自CMV血清阳性供体的白细胞分离术获得的总核细胞（TNC）与CMV pp65抗原的重叠肽段共同孵育，可生成CMV特异性T细胞。这些肽段在人类白细胞抗原（HLA）的呈递背景下，激活TNC中的CMV pp65特异性T细胞分泌IFN-γ。随后这些T细胞可被“捕获”并通过磁性分离。第一代细胞富集装置（图1A）的操作需要具备GMP条件下细胞培养经验的技术人员，并需协调工作人员完成生成“捕获”产物所需的多个步骤。
该操作通常需要连续进行10至12小时，因此GMP设施中的工作人员可能需要轮班工作两个班次。第二代设备（见图1B）的应用现已消除了这些限制。该设备与第一代设备类似，可进行磁性富集，但以封闭式方法实现了CCS其他步骤的自动化。这显著减轻了GMP团队的工作负担，因为大部分步骤均可在无人值守的情况下完成。此外，由于该设备为封闭系统，抗原特异性T细胞的捕获和处理均可在实验台面上进行，仅白细胞分离以及仪器启动前的材料准备步骤除外。有关该第二代细胞富集设备的完整仪器配置和功能细节已有文献报道11。
本文介绍了利用自动化细胞富集CCS系统从稳态单采血液成分产品中富集巨细胞病毒（CMV）pp65特异性T细胞的步骤。分离获得的这些CMV特异性T细胞可直接输注给患者。

<table><tbody><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA 缓冲液 3 L 袋装</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>700-29</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy 管路套装 TS 500</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-182</td><td></td></tr><tr><td>5 L 废液袋</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>110-004-067</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS 细胞因子捕获系统（IFN-γ）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>279-01</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白（人源）25%&amp;nbsp;</td><td>Grifols</td><td>58516-5216-2</td><td></td></tr><tr><td>Luer/穿刺连接器</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-701</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl 溶液（1 L）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP PepTivator HCMV pp65</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-109</td><td></td></tr><tr><td>注射用水</td><td>Hospira, inc, Lake Forest, IL</td><td>NDC-0409-4887-10</td><td></td></tr><tr><td>MILLEX GV 滤器单元 0.22 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP 培养基 2 L 袋装</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>170-076-306</td><td></td></tr><tr><td>转移袋，150 ml（用于细胞起始材料）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-018-301</td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS 冻存袋 50</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>60 ml 注射器，无菌</td><td>BD, Laagstraat, Temse, Belgium</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CMV 血清学阳性单采产品</td><td>Key Biologics, LLC, Memphis</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流式细胞术材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;生产厂家&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AB 血清，GemCell</td><td>Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-080-401</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-033</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-065</td><td></td></tr><tr><td>CD14-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-072</td><td></td></tr><tr><td>CD20-PerCP</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-077</td><td></td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-098-136</td><td></td></tr><tr><td>aIFN-&amp;gamma;-PE，人源</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-940</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-091-374</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶溶液（100 &amp;micro;g/ml）</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;生产厂家&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy 仪器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>200-075-301</td><td></td></tr><tr><td>软件 V1.0.0.RC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>软件 2.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 5415R&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2</td><td>Nexelom Bioscience, Lawrence, MA</td><td>LB-001-0016</td><td></td></tr><tr><td>无菌管路焊接仪 SCDIIB</td><td>Terumo Medical Corp., Elkton, MA</td><td>7811</td><td></td></tr></tbody></table>

使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性t细胞的自动化富集及其临床应用

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

过继性转移病原体特异性T细胞可用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后发生的伺机性感染，例如巨细胞病毒（CMV）感染。来自异基因供体（包括第三方供体）的病毒特异性T细胞可在体外（ex vivo）通过符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的流程进行扩增，该流程采用多轮抗原驱动的刺激，以选择性扩增所需的T细胞。抗原特异性T细胞的鉴定与分离也可基于细胞因子捕获系统（CCS）进行，该系统针对已被激活并分泌γ-干扰素（IFN-γ）的T细胞。然而，由于该生产过程耗时较长且需要熟练操作人员，细胞因子捕获系统在人类免疫重建中的广泛应用受到限制。第二代细胞富集装置（如CliniMACS Prodigy）的开发使研究人员能够利用自动化、劳动强度更低的系统来生成病毒特异性T细胞。该装置采用磁性激活细胞分选技术，将磁标记细胞与未标记细胞分离，从而生成符合临床级标准的产品，其设计为封闭系统，可在实验台面上直接操作。本文展示了利用这一新型自动化细胞富集装置，从CMV血清学阳性供体的稳态单采血液制品中制备CMV pp65特异性T细胞的操作过程。所分离的T细胞可在机构和联邦监管监督下直接输注给患者。所有生物处理步骤，包括红细胞去除、T细胞刺激、抗原特异性T细胞分离、纯化和洗涤，均实现全自动化。此类装置的出现使得用于人体的T细胞制备可能不再局限于专用的药品生产质量管理规范（GMP）设施，而可在血库设施中完成，由工作人员监督自动化程序以生产多种产品。

本研究中，采用自动化细胞富集CCS系统，用于自动化制备针对巨细胞病毒（CMV）pp65特异性T细胞。从三个单采血液成分产品中富集获得CMV特异性T细胞。稳态单采血液成分产品自CMV血清阳性供者采集，历时2小时，共获得1010个总有核细胞（TNC）。取109个TNC，使用CMV pp65来源的肽段（60 nmol）激活4小时，随后利用自动化细胞富集装置上的CCS系统分离分泌IFN-γ的T细胞。实验开始时需操作人员加载所有试剂和管路组件。系统从初次拆包至启动设备的设置过程约需60至120分钟。需注意，设备可在加载试剂和管路组件后进行编程，实现自动启动，从而支持无人值守运行（例如过夜操作）。15小时后需再次由操作人员对终产品进行细胞纯度和活力的表征分析。富集后，收集细胞上清液检测支原体和内毒素是否存在。经验证合格后，处理后的细胞可直接输注给患者，或冻存以用于后续应用。
细胞计数根据细胞计数的标准操作流程，使用表2中提供的公式进行确定。每种类型的细胞计数均重复三次，结果以总细胞数的平均值±标准差（SD）表示。随后...

本方案的目的是利用一种台式、自动化、第二代细胞富集装置，制备针对病原体的临床级T细胞。该装置采用封闭式细胞因子捕获系统，无需专业人员操作，也无需使用GMP设施。所生成的巨细胞病毒pp65特异性T细胞可直接用于患者治疗。

使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性T细胞的自动化富集及其临床应用

过继性转移病原体特异性T细胞可用于预防和治疗机会性感染，例如巨细胞病毒（CMV）感染……

本实验的目的是利用细胞因子捕获系统分离具有临床级质量的抗原特异性T细胞，用于过继性免疫治疗。首先，将来自CMV阳性供体的单个核细胞与一组源自CMV PP65蛋白的重叠肽段共同孵育，以激活T细胞。随后，通过细胞因子捕获技术分离出活化的、抗原特异性的、CD45阳性且表达干扰素γ（IFN-γ）的T细胞。随后通过流式细胞术评估CMV特异性T细胞的数量和纯度。最终，利用该细胞因子捕获系统可收获高比例的CD4和CD8阳性且表达IFN-γ的CMV特异性T细胞。该技术相较于现有方法的主要优势在于其完全自动化，且无需在符合药品生产质量管理规范（GMP）的设施中操作，即可分离获得临床级T细胞。该方法有助于解答过继性细胞治疗领域中的一些关键问题，例如如何在降低细胞制备成本的同时提高这些细胞的可及性。对于大量患者而言，该方法可为分离针对CMB抗原的特异性T细胞提供思路。此外，通过使用来源于特定病原体的肽段抗原对细胞进行孵育，该方法也可应用于研究T细胞对其他病原体的应答反应。该自动化系统还简化了细胞因子捕获过程，使得捕获的T细胞产品能够按需生成，而无需操作人员直接监督。在开始操作前，使用鲁尔接头刺入连接器，将新近重悬的巨细胞病毒磷酸蛋白65（C-M-V-P-P 65）多肽混合物转移至一个50毫升体积的冷冻袋中，确保所有多肽均已转移。用止血钳夹闭该袋，然后在无菌条件下打开细胞富集管路装置，移除管路装置上的带通气孔小瓶适配器和无菌滤器，并通过将鲁尔接头刺入连接器旋入鲁尔接口，将多肽混合物袋与管路连接。然后将总计10亿个核细胞悬浮于50毫升新配制的含EDTA的磷酸盐缓冲液和人血清白蛋白中，并将细胞产物注入一个150毫升的转移袋中。现在启动细胞富集系统，并选择细胞因子捕获系统中的IFN-γ富集程序。此时将出现一个用户界面，显示该操作流程的说明和图片。输入操作员信息和管路信息，设置样本编号参数。然后根据交互式显示器屏幕上显示的说明，将 Prodigy 管路套装安装到自动细胞富集装置上。记录试剂的货号和批号后，按照屏幕显示的逐步说明，将培养基和缓冲液连接至设备。完成对管路组的最终检查后，打开肽混合液和培养基袋，启动管路的自动预冲。预冲完成后，使用无菌管路焊接仪将人血清白蛋白加入储液袋中的氯化钠缓冲液，并将起始细胞产物转移至加样袋中。接下来，使用接头将细胞因子捕获系统试剂连接至相应的管路，并输入细胞富集过程结束的预期时间。检查并核实输入的所有数据和参数的准确性。然后移除质控袋的密封条，称量袋子并将其置于 4°C 下保存。现在开始富集过程。目标细胞将从储液袋中的洗脱缓冲液中收集。富集结束后，从非目标细胞阴性组分和目标细胞阳性组分中分别收集两份等分试样。然后密封并称量非目标细胞袋和目标细胞袋的重量，并将其在4°C下保存。最后，从细胞富集仪器上取下管路组件，并将日志文件传输至U盘以供后续使用。为了确定每

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基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

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高效快速生成符合GMP可扩展设备的CAR-T细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞

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小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

学习使用细胞因子捕获系统自动化富集巨细胞病毒特异性T细胞的方法。该技术无需GMP设施即可生产临床级CD4和CD8阳性T细胞，用于过继免疫治疗，提高细胞治疗的可及性和效率。

使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性T细胞的自动化富集及其临床应用

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