一种利用电穿透图（EPG）获取和测量韧皮部筛管元件电信号的新应用

以下实验的总体目标是研究植物中由毛虫取食区域向完整区域通过筛管分子长距离传递的电信号。该目标通过构建电穿透图谱（EPG）电路实现，该电路将半体昆虫（如蚜虫）与植物整合在一起。蚜虫将其口针插入植物组织，从而闭合电路，开始EPG记录。

最终，蚜虫将其口针插入筛管分子，并向其中分泌唾液数分钟，随后进入长期的取食阶段。无论是唾液分泌（E1阶段）还是取食（E2阶段），均包含微小而有节律的流电位。接下来，将一只毛虫放置在叶片上，任其取食。当EPG记录的蚜虫继续从邻近叶片的韧皮部汁液中取食时，毛虫对主叶脉造成的损伤会引发一个电信号，该信号将通过韧皮部传递至其他叶片，包括正在用EPG装置监测取食蚜虫的叶片。

信号的大小可通过与已知大小的校准脉冲进行比较来测定，该校准脉冲此前已在E两个或摄入阶段施加。结果表明，毛虫对叶片造成的损伤始终会在邻近叶片中引发电信号，该信号复杂且幅度显著，包含第一个缓慢组分以及叠加在第一个组分之上的第二个快速组分。电穿透图技术于20世纪60年代被引入。

EPG 监测极大地增进了我们对蚜虫及其他半翅目昆虫刺探植物过程的认识。其主要经济意义在于研究寄主植物抗性机制以及植物病毒传播机制。因此，我提出了将 EPG 作为一种植物细胞内电生理学研究方法的概念，通过将 EPG 记录与传统玻璃电极记录进行关联来实现，这两种记录方式均使用氯化钾溶液填充的玻璃电极进行细胞内记录。

存在两个电压水平：一个相对较高的电压水平，对应于玻璃电极尖端或AEs笔尖的细胞内位置；另一个相对较低的电压水平，对应于玻璃电极或AEs环状结构的细胞内位置。在进行EPG记录时，若为获取植物-蚜虫电生理图谱（PG记录）而饲养蚜虫，则植物和蚜虫种类的选择取决于研究目的；对于快速取食行为的研究，选用蚜虫是合适的，可在温室中用围绕饲养容器的网罩进行饲养。

必须使用网孔小于1毫米的细密网筛将植物包裹起来，以防止蚜虫和寄生蜂侵入，但笼子的顶部应采用透明材料，以允许光合作用进行。每两周需将蚜虫种群转移至新的植株上。仅需保留10至20只成虫，其余蚜虫可予以淘汰。

进行昆虫EPG记录时，必须使用黄铜连接针、一段1至2厘米长的铜线（例如电线中的金属丝）以及一段长约1.5厘米的极细金线来制作专用电极。同时需准备水性银胶，以及一个简易的小型烙铁、助焊剂、松香芯焊锡丝。开始操作时，先将一段焊锡丝熔化在烙铁尖端。

然后将黄铜钉的头部浸入一滴焊剂中。立即将铜丝的末端接触焊料螺栓的尖端，从而将其熔接到黄铜针上。现在充分振荡或涡旋银胶，使乳液均匀悬浮，不发生沉降。

打开瓶盖，在体视显微镜下将铜丝的自由端浸入瓶盖上的胶水中。将金网重叠至少一毫米后连接，并让银胶干燥。胶水干燥后，尽量避免将胶水沾到显微镜载物台上，检查银胶与金丝之间的接触情况，注意连接处未被胶水粘合的部分。

用细针或铜线添加新鲜胶水，直至昆虫固定完毕。制作完成的电极可安全地存放在泡沫塑料上。固定蚜虫时，使用一个简易的家用真空装置。

通过覆盖在进气孔上的一小片纸来控制吸力。打开真空装置，并在体视显微镜的载物台上移动，使吸头位于视野中央。用一支较小的2号水彩画笔或更小的画笔拾取一只蚜虫，并将蚜虫腹面朝向吸头固定，以便于接触其背面。

使用毛刷去除蚜虫腹部表面的蜡质，因为甘蓝蚜虫体表的蜡质较为丰富。随后充分振荡或涡旋银胶，用细小的昆虫针在蚜虫背部滴加少量银胶。静置干燥两到三分钟。

再次摇动小瓶，并在已干燥的第一滴胶水顶部再加一滴胶水。然后将已准备好的昆虫电极的金线插入第二滴银胶中。在胶水未干时，保持金线位置固定，直至胶水完全干燥。

如果胶水不慎沾到蚜虫的足部或其体内任何部位，请更换新的蚜虫重新开始。昆虫电极可重复使用。待胶水完全干燥后即可。

关闭吸力，将蚜虫从真空装置中取出。此时，已连接导线的昆虫即可用于EPG记录。部分蚜虫可无需真空固定即可完成接线。

在这种情况下，将蚜虫放置在一片实验室用纸巾上，纸巾表面足够粗糙，可使蚜虫保持抓附。在涂抹胶水时，可将一根金丝插入第一滴银胶中。如果这滴胶水过小或干燥过快，金丝将无法牢固粘附。

在这种情况下，只需在第一个银胶滴上再放置一小滴银胶，然后插入金丝，等待胶水干燥。接着用细毛刷将蚜虫从纸巾上轻轻提起。将连接好金丝的蚜虫通过将黄铜钉插入泡沫塑料中保存，直至需要时使用。

首先，将实验植物放入法拉第笼中，并置于非导电支撑物（如培养皿）上。然后，将植物电极插入每个花盆的土壤中。注意：植物电极并非需要连接至法拉第笼的接地电极。

然后将电极的黄铜针插入EPG。预先调整植物和昆虫的位置，使昆虫与植物上所需位置接触。使用采样频率固定为100赫兹的Style plus接口软件，输入文件名，设定记录时间，并在注释行中输入文本以注明实验的详细信息。

然后通过软件点击左上角的开始按钮启动记录。通过将带线蚜虫放置到植物上开始实验，最多可同时记录八个通道，即一套EPG装置可同时记录八只带线蚜虫，可以每株植物一只蚜虫，也可以在一株植物上放置多只蚜虫。当蚜虫将其口针插入植物时，电路即被接通。

EPG 信号的波动电压将显示在计算机屏幕上，需调整植物电压和增益以获得最佳记录效果。在大多数情况下，蚜虫至少需要一小时才能进入取食流阶段。持续的流食取食由至少 10 分钟的 E2 波形来指示。

此时，电极已准备好采集筛管细胞的电信号，但仅在 E2 信号稳定时才应开始诱导。必须传递一个或多个校准脉冲，以便后续用于估算电信号的大小。用剪刀剪断叶片会稳定地诱导出远距离电信号，并由 EPG 记录的蚜虫采集到该信号。

在更为真实的实验中，使用饥饿的毛虫作为造成损伤的媒介。由毛虫造成的损伤会持续诱导出快速和慢速的电信号，这些信号会传递到其他叶片，并可通过EPG电极记录。引入毛虫所产生的噪声不会影响植物的电生理反应，但可能会掩盖该反应，因此应尽量减少此类噪声。

实验者应接地，以检测取食中的毛虫是否会在被取食的叶片上诱导产生电信号。将一只饥饿的毛虫放置在一片叶片上，该叶片同时承载着EPG记录的蚜虫，随后用剪刀依次在两片叶片的叶缘与叶柄连接处进行切割。将EPG电极置于与这两片被切割叶片相邻的一片完整叶片的中脉上，可在同一筛管元件中检测到对这些伤口产生的类似电生理反应。

这些电生理反应由缓慢去极化和叠加在缓慢去极化之上的快速去极化组成。在另一项实验中，也切除了两片叶片，但其中一片是装有EPG电极叶片的邻近叶片，而另一片则不是装有EPG电极叶片的邻近叶片。在这种情况下，单个筛管元件对伤口的反应不同。

对非邻近叶片造成的伤口最初仅诱导出缓慢的电信号，而对邻近叶片的伤口则诱导出包含慢速和快速组分的复杂信号。这些结果表明，筛管分子能够检测损伤的位置。在此实验中，利用连接至EPG系统的蚜虫，对拟南芥叶片边缘的筛管分子进行了细胞内记录。切割邻近叶片会诱导产生电信号，该信号传递至蚜虫口针所插入的筛管分子中。

与主脉中的筛管分子不同，边缘叶脉中的筛管分子对远端损伤仅产生一次缓慢的去极化波，这种去极化波可能对应于中央筛管分子中的缓慢去极化波。电穿透图技术（Electrical Penetration Graph，EPG）是一种有助于回答植物电生理学和植物生理学领域关键问题的方法，例如：哪些离子通道介导了从叶片到叶片的长距离电信号？更重要的是，这些信号在植物适应环境过程中发挥着怎样的作用？观看本视频后，您应了解如何为EPG实验准备植物和昆虫。

记录昆虫的神经连接看似复杂，但我们已经证明这一过程其实相当简单，这或许会激励您将其应用于您自己的研究中。