从永生化分选B细胞中生成重组人IgG单克隆抗体

本实验的总体目标是克隆并表达由B细胞产生的抗体。首先从血液或胸腺等相关的组织来源中分离B细胞。第二步是进行分选，并筛选出能够产生IgG的B细胞群体。

接下来，通过EB病毒（Epstein-Barr virus）感染并联合使用C-P-G-O-D-N 2006激活Toll样受体9，使细胞永生化，并进行体外培养。后续步骤是从经ELISA检测确认可产生IgG的克隆中提取RNA，并对IgG轻链和重链分别进行cDNA合成。最终，可将IgG序列克隆至哺乳动物表达载体中，以大量生产人源单克隆IgG抗体。

与现有的噬菌体展示技术等方法相比，该技术的主要优势在于能够保持原始的IgG重链和轻链配对不丢失。该方法可回答自身免疫领域中的关键问题，例如致病性自身抗体的发现及其功能表征。请注意，操作患者样本和EBV病毒可能存在风险。

EB病毒是一种人类病原体，在执行这些步骤时应始终采取预防措施，例如使用VSL二级个人防护装备并穿戴充分的防护用品。在对PBMC进行染色前，将其接种于含六毫升完全RPMI 1640培养基的25平方厘米培养瓶中，过夜恢复。阻断并洗涤细胞后，用0.5毫升培养基将PBMC收集至离心管中，离心沉淀。然后将细胞重悬于标记缓冲液中并进行计数。

接下来，将两份各含500万个细胞的样品分别置于离心管中，每管体积为200微升缓冲液。向其中加入10微升抗CD22 PE-Cy5（PE-R-C-P）抗体或40微升抗IgG PE抗体，冰上避光孵育30分钟，随后洗涤、过滤并分选细胞。目标是计数双阳性细胞。

首先将分选后的P BMCs用RPMI 1640完全培养基稀释至每微升含一个细胞，并加入C PG 2006和EBV。然后在生物安全柜中，将110微升含有EBV和C PG 2006的细胞稀释液接种至已预先铺有经照射处理的WI 38细胞的96孔圆底培养板的两个孔中。每孔感染50个细胞的条件已优化，可提高获得单克隆抗体的概率。

然而，我们建议通过 PCR 确认此结果。孵育一周后，在显微镜下观察细胞以检查 B 细胞生长情况。两周后，缓慢更换培养基，从每个孔中吸取 90 µL 培养液，并转移至新的培养板中。

通过ELISA检测IgG的产生。然后向每个孔中重新加入100微升新鲜的完全培养基，其中包含IL-2。继续监测克隆在第三周和第四周生长期间的生长情况。

每周重复更换培养基。有关克隆扩增方法，请参见文字版实验方案。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测培养基更换上清液中的IgG产生情况。

首先，准备ELIZA板，向每个孔中加入50 µL用包被缓冲液按1:200稀释的山羊抗人FC抗体。孵育并洗涤平板后，每孔加入100 µL封闭缓冲液进行封闭，并再次孵育平板。封闭孵育结束后，将孔中的液体倾倒在纸巾上弃去。

完成板的制备后，用四倍体积的RPMI稀释上清液。对于标准对照，将人IgG溶液在RPMI中进行系列稀释，浓度从每毫升1000纳克稀释至每毫升15.6纳克。

同时设置一个空白对照。向每个孔中加入50 µL上清液或标准品，将ELISA板在37°C下孵育1小时，孵育方式相同；可额外设置ELISA板以分析上清液的进一步稀释液，用于检测抗体亲和力。孵育结束后洗涤平板。

然后向每个孔中加入含辣根过氧化物酶标记的Fab2的50微升孵育缓冲液。再孵育一小时并再次洗涤后，向每个孔中加入100微升含TMB的底物溶液。随后孵育平板最多10分钟，直至出现的蓝色稳定不变。

然后终止反应并测定吸光度。任何克隆上清液的测定吸光度值若超过空白对照三个标准差，则判为阳性。

对于人IgG抗体，可通过进一步的检测方法确定其抗原特异性。首先，按照文本方案从阳性克隆中合成互补DNA。然后针对IgG重链、κ和λ轻链设置PCR反应。

在结果中，于400至550个碱基对处找到重链，在300至400个碱基对处找到轻链。如果未出现目标条带，可取一微升扩增产物作为模板进行下一轮PCR扩增。

新产物应处于适当范围内。然后对最佳产物进行克隆。首先，对它们进行测序，其电泳图谱应清晰，并对应于单一的免疫球蛋白序列。

按照文本方案操作。将纯化的PCR产物克隆至1微克的质粒DNA中。务必在16摄氏度下连接过夜。

使用 T4 DNA 连接酶，在添加补充剂的 DMEM 培养基中制备 HX 细胞，并将其在 75 平方厘米的培养瓶中培养至 75% 融合度。对于每一轮重链和轻链转染，准备一个混合液，其中包含 1.75 毫升无血清的 DMEM，加入 4.5 微克重链载体、3 微克轻链载体以及 50 微升聚乙烯亚胺溶液。将此混合液轻轻加入 HX 细胞培养板中，并轻柔摇晃培养板使溶液均匀分布。

将培养板孵育过夜，随后开始每天收集培养基，并更换为无血清培养基。该培养基中含有抗体，可在对CD22和IgG阳性pBMCs进行分选并染色后连续收集四天。

将产生IgG抗体的双阳性细胞区域单独收集用于扩增。约1%的PBMC属于该双阳性群体。经过EBV永生化及CPG 2006刺激五周后，分离得到永生化克隆。

WI 30 饲养细胞呈更长的成纤维细胞样形态，而 B 细胞克隆则表现为生长在圆底多孔板中央的小型圆形细胞簇。使用 ELIZA 检测扩增克隆的上清液中 IgG。阳性克隆通过 ELI 值评估，即高于空白值三个标准差的数值。

至少三个来自阳性克隆的上清液在ELI检测中呈阳性。在克隆免疫球蛋白重链和λ轻链配对的可变区与恒定区后，对阳性克隆的抗体进行了测序，从而能够表征重链和轻链的特征。按照此流程进行。

还可以进行其他方法，如测序，以回答更多问题，例如抗体使用、基因使用、遗传多样性等。该技术的发展为自身免疫领域的研究人员探索重症肌无力等自身免疫性疾病的发病机制、病理过程及相关治疗策略铺平了道路。该技术的意义还延伸至疾病的诊断与治疗，因为致病性抗体的发现有助于开发新的治疗方法，例如缺乏炎症活性的竞争性抗体。