Name: 从排序的永生B细胞产生的重组人IgG单克隆抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解从永生B细胞产生重组人IgG单克隆抗体的实验方法。该技术通过EB病毒永生化B细胞，结合流式分选和ELISA验证，为自身免疫病研究提供高效抗体生产方案。

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西班牙国家卫生研究所（ISCIII）米格尔·塞尔韦特研究合同（CD14/00032）资助（G.N.-G.）。荷兰科学研究组织“转化神经科学研究生项目”奖学金（022005019）资助（C.H.）。
Prinses Beatrix Fonds 基金会（项目编号 WAR08-12）和法国肌病协会（Association Française contre les Myopathies）向 P.M.-M. 提供的资助；以及荷兰科学研究组织（Netherlands Organization for Scientific Research）Veni 人才项目（916.10.148）、荷兰脑基金会（Brain Foundation of the Netherlands，项目编号 FS2008(1)-28）和 Prinses Beatrix Fonds 基金会（项目编号 WAR08-12）向 M.L. 提供的资助。
我们感谢 Jozien Jaspers 在通过流式细胞术进行 B 细胞分选方面的帮助。

已获得研究参与者的知情同意。本研究经机构伦理委员会批准。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
<ol>
	<li>在采血后尽快将25 ml&#160;受试者的肝素抗凝血以900 × g离心15分钟。若血液量较少，应相应减少试剂用量。所有后续操作均需在生物安全柜中进行。</li>
	<li>将血清转移至洁净离心管中。该血清可用于后续步骤中PBMC的冻存，或针对自身免疫性疾病患者用于检测自身抗体。</li>
	<li>用10 ml&#160;RPMI 1640培养基稀释血液，并通过反复吹打重悬细胞。</li>
	<li>向一个新的50 ml&#160;离心管中加入15 ml&#160;含多蔗糖和泛影酸钠（密度为1.077 g/ml）的溶液。</li>
	<li>将步骤1.3中的血液轻柔地叠加至步骤1.4的溶液上方：将两支离心管管口靠近，使液体缓慢接触，然后缓慢倾注PBMC悬液至50 ml&#160;离心管液面上方。此步骤对实现PBMC的良好分离至关重要。</li>
	<li>将步骤1.5获得的离心管在室温下以400 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。</li>
	<li>离心结束后，用移液器小心吸取管中部出现的白色环状层，其中含有PBMCs。</li>
	<li>用25 ml&#160;RPMI 1640培养基洗涤细胞。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用10 ml&#160;RPMI 1640培养基重悬细胞并洗涤，再次按照步骤1.9的条件进行离心。</li>
	<li>使用Neubauer计数板对PBMC进行计数，方法如前所述14。</li>
	<li>按第2节所述方法立即处理PBMC，或按以下方法保存以备后续使用：每支冻存管中加入1000万个PBMC，用1 ml&#160;含10%二甲基亚砜（DMSO）和90%步骤1.2中获得的血清的混合液稀释后进行程序性降温，并长期保存于液氮中。</li>
</ol>
2. 通过细胞流式技术对PBMCs进行染色以分选CD22+和IgG+细胞
<ol>
	<li>将PBMC接种于25 cm²培养瓶中2 6 ml 细胞培养瓶&#160;含L-谷氨酰胺、10 mM HEPES缓冲液、50 U/ml&#160;青霉素，50 µg/ml&#160;链霉素和10%胎牛血清）中，过夜恢复&#160;在37 °C、5% CO₂的培养箱中2.</li>
	<li>用无菌的4%牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液（PBS）在FACS管中封闭过夜。用PBS洗涤管子两次，然后每管加入500 µl完全RPMI 1640培养基。用于分选后细胞的回收。</li>
	<li>将PBMC收集至离心管中，在室温下以400 × g离心5分钟。</li>
	<li>用标记缓冲液重悬细胞（参见步骤 2.5 和 2.6），并进行计数14标记缓冲液为含2%胎牛血清和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌PBS溶液。</li>
	<li>准备3个含有10的荧光激活细胞分选（FACS）管5 每个细胞重悬于100 µl&#160;标记缓冲液。这些试管将用于设定分选门。
	<ol>
		<li>在第一个试管中加入 5 µl&#160;20 µl 抗 CD22 PerCP 抗体（以生产商说明书推荐为准），在第二个试管中加入 20 µl&#160;加入推荐量的抗IgG PE（以制造商数据表为准），第三管中不加任何物质。冰上避光孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将500万个细胞重悬于200 µl中&#160;FACS 管中加入标记缓冲液，并加入 10 µl&#160;抗CD22 PerCP 和 40 µl&#160;加入抗IgG PE。将细胞置于冰上避光孵育30分钟。若需分选更多细胞，可按比例增加所有试剂用量。</li>
	<li>以400 × g离心5分钟，低刹车&#160;室温下</li>
	<li>轻轻倒出上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 500 µl 中&#160;标记缓冲液。在400 × g离心力下，以低刹车力度离心5分钟&#160;在室温下。重复步骤 2.7 和 2.8</li>
	<li>轻轻倒出上清液，并将细胞重悬于 300 µl 中&#160;RPMI 完全培养基</li>
	<li>将细胞通过0.45 µm滤器过滤。细胞已准备好进行分选。</li>
</ol>
3. B细胞CD22+和IgG+的分选
<ol>
	<li>使用3个对照管以评估细胞的活力。在未染色的对照管中，利用前向散射光和侧向散射光图确定淋巴细胞的设门范围。CD22 PerCP 和抗 IgG&#160;PE 的对照管用于设定设门参数及分选门。操作步骤参照先前报道的数据15。 
	注意：设门是一组数值界限（边界），用于从大量细胞流式事件中分离出特定的细胞群体。在分选门的情况下，这些数值界限允许回收位于设定边界内的流式事件，即细胞，此处为 CD22+ 和 IgG+ 细胞。</li>
	<li>在分选过程中，使用步骤2.2中获得的含500 µl&#160;完全RPMI 1640培养基的封闭管作为收集管。</li>
	<li>开始分选双阳性细胞15：CD22+ IgG+。记录每种条件下最终获得的细胞数量。尽快将分选后的细胞接种至饲养细胞层上。</li>
</ol>
4. 饲养层细胞的照射
注意：在分选前1至3天进行饲养细胞的制备。每孔96孔圆底培养板至少需要5,000个wi38细胞。步骤4.1、4.2和4.4需在超净台内进行。
<ol>
	<li>在完全 RPMI 1640 培养基（与 PBMC 培养所用相同）中，于 37 °C 和 5% CO2 条件下培养 wi38 细胞，直至达到所需细胞数量。</li>
	<li>按照先前描述的方案16，对细胞进行 50 Grays 的照射。可在 wi38 细胞经胰蛋白酶消化并重悬于完全 RPMI 培养基后进行照射，也可在细胞仍贴壁于培养瓶时照射，之后再进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化操作应遵循 wi38 细胞供应商提供的方法。照射的细胞数量应足以覆盖用于接种 IgG+ B 细胞的孔（即步骤 1.11 中计数的总 PBMC 的 1%）。</li>
	<li>在 96 孔圆底培养板的每孔中加入 90 µl&#160;含 5,000 个经照射的 wi38 细胞的悬液。将板外圈的孔留空（因其蒸发较快），仅使用板中央的 60 个孔进行细胞接种。在围绕板边缘的外周孔中加入 200 µl&#160;PBS 以减少蒸发。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中，待后续使用时取出。</li>
</ol>
5. 分选后PBMC的铺板、EBV感染与培养
<ol>
	<li>将分选后的PBMCs稀释，以每50 µl体系接种50个细胞&#160;每孔加入 RPMI 1640 完全培养基，置于已接种 WI38 照射细胞的 96 圆孔板中。操作步骤需在配备 EBV 操作条件的生物安全柜中进行。 
	注意：每孔感染50个细胞已优化，可提高产生单克隆抗体的可能性8,&#160;然而，建议按照之前所述方法通过PCR进行验证1,6.</li>
	<li>加入 60 µl&#160;EBV 上清液（含 3 - 4 x 108 每孔加入病毒拷贝数（病毒拷贝数/ml）至96孔圆底培养板17.&#160;进行EBV操作时应格外小心。</li>
	<li>加入 1 µg/ml&#160;每孔含 CpG（ODN2006）。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养2.</li>
	<li>一周后在显微镜下观察克隆生长情况。 
	注：B 的一些示例&#160;可在结果部分下方观察到细胞生长情况。请注意，各克隆的生长速率可能存在差异。&#160;会有所不同，可能需要额外时间才能观察到细胞团块在孔中央开始生长。</li>
	<li>在1之后st 两周后在光学显微镜下观察克隆生长情况，并进行首次换液。缓慢吸取90 µl培养基&#160;吸走上层培养基，并收集至新的96孔板中。（B细胞位于孔底部，因此不会被吸出。）&#160;
	<ol>
		<li>每孔加入 100 µl&#160;含1 µg/ml的完全RPMI 1640培养基&#160;CpG（ODN2006）和 50 U/ml&#160;IL2的克隆若已开始生长，应按照步骤6通过ELISA分析首次培养基更换样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测克隆生长情况，并在第3天后更换培养基rd 以及 4th 再次生长的一周，取 90 µl&#160;培养基并加入100 µl&#160;含1 µg/ml补充剂的完全RPMI 1640培养基&#160;CpG（ODN2006）和 50 U/ml&#160;收集上清液，按照步骤6中的方法通过ELISA检测IgG的产生。 
	注意：培养一个月后，应可见圆形细胞聚集成团，通常位于圆底孔的中央，表明克隆形成。</li>
	<li>在此步骤中，以与前几周相同的方式更换培养基，但仅使用完全RPMI 1640培养基。判断更换培养基合适时机的一个良好指标是培养基的颜色：若培养基颜色开始变黄，则说明细胞需要更换培养基。</li>
	<li>当96孔板中含有较大的克隆（约5 x 105 细胞），转移至24孔板的平底孔中，加入300 µl&#160;向新孔中加入完全RPMI 1640培养基。通过反复吹打重悬96孔板中生长的克隆，并将细胞转移至新孔，使其均匀分布。根据需要添加新鲜培养基。
	<ol>
		<li>当24孔板的孔中充满细胞（约5 x 106 细胞），转移至6孔板的平底孔中。加入2 ml&#160;向新孔中加入完全RPMI 1640培养基。通过反复吹打重悬24孔板中的细胞，并将其均匀分布于新孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要添加培养基。若细胞无需继续培养，于室温下以400 × g离心5分钟收集细胞。保留上清液用于ELISA检测。用1 × PBS洗涤细胞沉淀一次，再次以400 × g离心5分钟，将沉淀干燥后于-80 °C保存，直至进行RNA提取。
	<ol>
		<li>当6孔板中的细胞达到汇合状态（约20 × 10⁶个细胞）时6 细胞），转移至60 mm培养皿中，加入4 ml&#160;向新培养板中加入完全RPMI 1640培养基。重悬6孔板中的细胞，并按照步骤5.9和5.10的方法进行转移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据需要添加新鲜培养基。此步骤中，将细胞以每毫升1000万至3000万个的密度进行冷冻保存&#160;在90%胎牛血清和10% DMSO中。若需要更多细胞，可继续在表面积更大的培养板中扩增克隆。</li>
</ol>
6. IgG 抗体检测的 ELISA 方法
<ol>
	<li>在 ELISA 板中每孔加入 50 µl 的山羊 F(ab)2 抗人 Fc 抗体稀释 1&#160;200，溶于包被缓冲液中。包被缓冲液含有 50 mM Na2CO3 pH 9.6</li>
	<li>用塑料封板膜密封，37 °C孵育1小时。或者，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>每孔用 200 µl 洗涤 6 次&#160;洗涤缓冲液。洗涤缓冲液含有含0.05% Tween-20的1×PBS。不要触碰或刮擦抗体已结合的孔表面。</li>
	<li>用封闭液封闭，每孔100 µl。封闭液为含4%脱脂奶粉的PBS。密封酶标板，37 °C孵育1小时。</li>
	<li>不要洗涤。弃去封闭缓冲液，将平板倒置在纸巾上轻拍三次，以去除残留液体。</li>
	<li>孵育克隆的上清液和标准品。
	<ol>
		<li>首次检测时，将步骤 5.6 或 5.7 获得的克隆上清液用 RPMI 培养基按 1:3 比例稀释。标准品配制：用人 IgG 溶液以 RPMI 培养基稀释，得到以下浓度：1,000 ng/ml、500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.6 ng/ml&#160;以及空白对照。每孔加入50 µl，37 °C孵育60分钟。进一步分析该克隆上清液的不同稀释度（如1/10或1/100）以检测抗体亲和力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤6.3的方法进行洗涤。</li>
	<li>使用山羊 F(ab)2 抗人 IgG Fc 辣根过氧化物酶偶联物，用孵育缓冲液按 1:20,000 稀释后，每孔加入 50 µl。孵育缓冲液含 1% BSA 和 0.02% Tween 20 的 1x PBS 溶液。孵育&#160;37 °C 下孵育 60 分钟。</li>
	<li>按照步骤6.3的方法进行洗涤。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 含 0.1% 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的底物溶液。孵育 10 分钟&#160;直到孔中形成稳定的蓝色为止。注意：不要等待过久！</li>
	<li>加入50 µl终止反应&#160;2 M H的2SO4. 在30分钟内测定450 nm处的吸光度&#160;反应停止后。 
	注意：所有克隆上清液中，光密度值超过空白对照3个标准差的，均视为含有人源IgG抗体阳性。为确认阳性克隆，应在同一克隆的不同上清液中至少重复ELISA检测三次。此外，为排除非特异性交叉反应的可能性，建议确保在未包被抗原但已封闭的孔中孵育上清液时无信号产生。在此步骤中，可在进入第7部分之前，进行抗原特异性检测实验，以筛选目标抗体的抗原特异性。</li>
</ol>
7. 产生 IgG 克隆的 RNA 分离与第一链 cDNA 合成
<ol>
	<li>一旦通过 ELISA 确认 IgG 的产生，立即提取该克隆的 RNA。</li>
	<li>对于从步骤 5.7 或 5.9 中培养的细胞中提取 RNA，使用 superscript III cells direct cDNA 合成试剂盒，该试剂盒可从 10,000 个细胞至单个细胞中获得 cDNA。</li>
	<li>对于大量细胞或来自步骤 5.11 中保存的细胞沉淀，使用 high pure RNA isolation 试剂盒。其他 RNA 提取系统在此步骤中也可能适用。请遵循试剂盒制造商的说明。</li>
	<li>对于细胞数量在 1 × 106 至 1 × 104 之间的样本，按照制造商说明书使用逆转录系统进行操作。也可使用其他用于第一条 cDNA 链合成的系统。</li>
</ol>
8. 1st&#160;和 2nd 用于扩增IgG产生型B细胞克隆重链和轻链的PCR
<ol>
	<li>使用第5.6和5.7步获得且在第6步IgG ELISA中呈阳性的细胞克隆cDNA，采用下表所列引物进行PCR扩增 表1.</li>
	<li>为每种IgG重链、κ链和λ链分别设置独立的PCR反应。将正向和反向引物按等浓度配制为贮存液，加入反应体系中，使其终浓度为0.4 µM。</li>
	<li>使用 1 µl&#160;cDNA合成以进行1ST PCR。此处进行20 µl反应体系&#160;根据宝生物（Takara）Taq 酶的生产商说明书进行反应。也可选用其他聚合酶。</li>
	<li>将1st PCR反应的循环条件如下：94 °C 预变性5 min；随后进行50个循环：94 °C 变性30 sec，58 °C 退火30 sec，&#160;72 °C 下 45 秒；72 °C 下 7 分钟；在 4 °C 下冷却。反应中应设置空白对照，以检测可能的污染。</li>
	<li>配制1×TBE（89 mM Tris-硼酸盐和2 mM EDTA）。总体积为100 ml&#160;加入1 g琼脂糖（制成1%琼脂糖凝胶）至1×TBE溶液中。将溶液放入微波炉加热约1分钟，直至琼脂糖完全溶解。然后加入4 µl&#160;10 mg/ml&#160;溴化乙锭（或等效的DNA染料）并混匀。
	<ol>
		<li>将内容倒入培养皿中，等待其聚合。加入5 µl并运行&#160;在凝胶中加入PCR混合物以观察条带。重链片段大小应在400–550 bp左右，轻链片段应在300–400 bp左右。如果未检测到条带，则同样进行下一步操作至2nd PCR</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1 µl&#160;第一次PCR混合物中的2nd PCR。使用与步骤8.2相同的试剂，但采用合适的引物混合物（参见 表1）。对于第2nd PCR 使用以下条件：94 °C 预变性 5 分钟；（50 个循环：94 °C 变性 30 秒；56.5 °C 退火 30 秒）&#160;72 °C 下 55 秒）；72 °C 延伸 7 分钟；置于 4 °C 冷却。反应中需设置空白对照，以检测可能的 PCR 污染。</li>
	<li>按照8.5中的方法制备琼脂糖凝胶，参照8.5.1中的步骤电泳以观察PCR产物。选择含有正确大小片段的扩增产物用于第9步的克隆，并用于第10步抗体的制备。</li>
	<li>使用10 µl进行DNA测序&#160;反应体系包含：100 ng 的 2nd PCR，0.2 µM 引物或引物混合物，1 µl&#160;终止子和1 µl&#160;缓冲液。在以下条件下进行测序反应：（25个循环：96 °C 变性10秒；50 °C 退火5秒；60 °C 延伸4分钟）；60 °C 继续延伸7分钟；然后在4 °C 下冷却。</li>
	<li>使用 microspin G50 柱纯化测序反应，具体操作按照制造商说明书进行。按照之前所述方法，在自动测序仪中分析连接产物的序列。18 电泳图谱应清晰，并对应于单一免疫球蛋白序列。 
	注意：如果PCR产物显示出不清晰或混合的免疫球蛋白序列，建议使用TopoTA系统进行克隆，以获得单一序列，然后继续进行第9步。</li>
</ol>
9. 产生IgG克隆的重链和轻链的克隆与测序
<ol>
	<li>准备1 µg的pFUSE2ss-CLIg-hk、pFUSE2ss-CLIg-hl2和pFUSEss-CHIg-hG1载体DNA。</li>
	<li>用适当的限制性内切酶消化这些载体。使用 生态RI 和 BsipFUSE2ss-CLIg-hk 的 WI 生态RI 和 AvrII 对于 pFUSE2ss-CLIg-hl2，以及 生态RI 和 NheI 对应 pFUSEss-CHIg-hG1。每 1 µg 载体 DNA 使用 3 单位的每种限制性内切酶。
	<ol>
		<li>用一种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。用第二种酶进行消化，并使用凝胶回收试剂盒（按照制造商说明书）进行纯化。从琼脂糖凝胶中切下目标片段。按照步骤8.5制备琼脂糖凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化 2nd 产生IgG克隆的PCR产物： 生态RI 和 Bsi用于 kappa 链扩增的 WI， 生态RI 和 AvrII 用于λ链扩增，以及 生态RI 和 Nhe重链扩增。先用一种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。再用第二种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。所用酶的单位数和DNA用量与步骤9.2相同。</li>
	<li>使用T4 DNA连接酶按照生产商的建议在16 °C下过夜连接PCR片段与载体。所用比例应为1 : 2（载体 : 插入片段）。</li>
	<li>使用 1 µl&#160;连接产物转化DH5α细菌。按照DH5α生产厂家提供的条件进行转化。根据所用载体类型，将细菌涂布于含blasticidin或zeocin的平板上。37 °C过夜培养。</li>
	<li>培养单菌落，并按照质粒小提试剂盒说明书提取DNA。使用该DNA小提试剂盒厂商推荐的方法进行单菌落培养和DNA提取。使用步骤9.2和9.3中用于制备载体和插入片段的限制性内切酶对提取产物进行酶切分析。</li>
	<li>使用100 ng载体DNA进行测序，操作同8.8和8.9步骤。</li>
</ol>
10.&#160;在HEK细胞中生产抗体
<ol>
	<li>在150 mm细胞培养皿中，使用添加10%胎牛血清、1% L-葡萄糖和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM+），将HEK细胞培养至75%融合度。步骤10.1至10.7需在生物安全柜中进行。</li>
	<li>转染前，更换培养基为不含胎牛血清的相同培养基。</li>
	<li>针对每一对重链和轻链的转染，配制转染混合物：2.5 ml&#160;不含血清的DMEM、9 µg含重链的质粒载体、6 µg含轻链的质粒载体，以及100 µl&#160;聚乙烯亚胺（PEI）溶液（来自1 µg/µl&#160;的储备液）。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将步骤10.3中制备的2.5 ml&#160;转染混合物轻轻加入培养皿中的HEK细胞中，并轻轻摇动培养皿使混合物均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>更换为不含胎牛血清的培养基。</li>
	<li>4天后收集培养皿中的培养上清。 
	注意：培养基中的抗体可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）反应性表征。</li>
</ol>

<ol><li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文详细介绍了从人外周血单个核细胞（PBMC）产生IgG抗体的全部步骤。该方案相较于先前发表的技术具有一些优势。其中一项优势是，所产生的抗体保留了B细胞克隆中原始配对的重链和轻链。IgG抗体的鉴定可适用于任何类型的人类供体，且无需通过疫苗接种来增强免疫反应5。使用wi38成纤维细胞系作为饲养细胞，能够更快速地检测到生长中的克隆，因为它们在形态上与PBMC明显不同，易于区分，而此前报道的研究中所使用的饲养细胞为PBMC1,6-8。此外，使用wi38作为饲养细胞有利于大量细胞分装物的冷冻保存，可在每次实验前方便地解冻并进行培养。
本方案中的一个关键步骤是起始材料：外周血单个核细胞（PBMCs）。如果血液在离心前放置时间过长，或在PBMC提取后未保存于适当的冷冻条件下，则活细胞数量将减少，从而导致获得的IgG抗体产生型B细胞克隆数量下降。因此，为确保实验成功，建议尽早提取并妥善保存PBMCs。实验开始时IgG产生型克隆的数量受限于初始PBMC的数量；PBMC数量越多，获得的IgG产生型克隆数量也越多，抗体产物的多样性也越高。另一个关键步骤是抗体...

本文的目的是详细描述一种从人外周血单个核细胞（PBMCs）中获取并表征人源IgG单克隆抗体的方法学。
研究人类抗体的兴趣已在多个研究领域中不断增长。特别是，许多研究团队关注由自身抗体引起的病理机制1-3。我们已克隆并表征了致病性自身抗体1。对自身抗体的研究有助于鉴定其靶标，并开发治疗策略，例如，使用竞争性抗体4。此外，人类抗体的研究在其他研究领域也具有重要意义，即，评估疫苗接种后的免疫应答5，表征暴露于特定病原体后产生抵抗力的个体的抗体谱型6，或研究天然抗体库中存在哪些抗体7,12。
已开发出多种技术用于生成重组人源单克隆抗体8-12；其中大多数技术采用噬菌体展示和B细胞永生化方法。噬菌体展示技术已广泛应用于新抗体的发现13。然而，该方法存在一个主要缺点，即人免疫球蛋白的重链和轻链&#160;在过程中会发生解离。利用人B细胞生成杂交瘤或EBV转化可克服这一缺陷。
我们采用EBV感染胸腺B细胞，并结合通过Toll样受体9（TLR-9）进行的多克隆B细胞刺激6,12。
本文详细描述了我们用于开发人源IgG抗体的技术，全面概述了从外周血单个核细胞（PBMC）分离到后续所有步骤的完整流程 体外 抗体生成。该方案可用于分析任何类型的人IgG谱型。在我们的实验室中，经过分选后，已成功将产生IgG抗体的B细胞从其余外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出来。50个分选后的B细胞8 随后可将细胞接种于多孔板中，并通过EBV和TLR-9激活使其永生化，以实现单个B细胞的克隆扩增。作为饲养细胞，可使用人胚胎肺组织来源的成纤维细胞系WI38，该细胞系有助于永生化B细胞的观察。从这些B细胞中，可通过PCR扩增获得免疫球蛋白重链和轻链的序列，将抗体基因克隆至免疫球蛋白G表达载体中并进行表达生产。 体外利用该技术，可对具有与供体完全相同抗体序列的单个抗体进行研究。

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>含多蔗糖和泛影酸钠的溶液</td></tr><tr><td>FACSAria II 细胞分选仪&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔 U 型底微量培养板&amp;nbsp;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>高级罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>B95-8 细胞系含 EB 病毒的上清液（30% v/v）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3.4 × 10⁸ 拷贝/mL</td></tr><tr><td>CpG2006&amp;nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 细胞&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素-2</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>10799068001</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 板</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')₂ 片段山羊抗人 IgG、Fc&amp;gamma; 片段特异性（未偶联）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>4% 脱脂干奶粉（印迹级封闭剂）&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>人 IgG&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>纯化的人免疫球蛋白 IgG，5.6 mg/mL</td></tr><tr><td>山羊 F(ab)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 抗人 IgG Fc&amp;gamma;（与过氧化物酶（PO）偶联）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 读板仪（Perkin Elmer 2030）&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>过氧化物酶偶联的 AffiniPure 兔抗人 IgM、Fc&lt;sub&gt;5&amp;micro;&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Cells Direct cDNA 合成系统&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 系统 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Pure RNA 提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>逆转录系统试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>重组 Taq DNA 聚合酶</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>引物（2 &amp;mu;l）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 4.5.2（Gel Doc 2000）</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>0.1 ml 反应板（MicroAMP 光学 96 孔板）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>遗传分析仪 ABI300&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞（E. coli）</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1（4,493 bp）</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4（4,484 bp）&amp;nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk（3,875 bp）</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2（3,883 bp）&amp;nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>SOC 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>含 Zeocin 的 LB 琼脂培养基（Fast-Media Zeo Agar）</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>含 Zeocin 的 TB 液体培养基（Fast-Media Zeo TB）</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA 小量提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop（ND1000 分光光度计）</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的 LB 琼脂培养基（Fast-Media Blast Agar）</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的 TB 液体培养基（Fast-Media Blast TB）</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log DNA 标准分子量标记</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1–10.0 kb，1,000 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10,000 U/mL，溶于 10× CutSmart Buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10,000 U/mL，溶于 10× NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5,000 U/mL，溶于 10× CutSmart Buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP 热敏感碱性磷酸酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&amp;micro;L，溶于 10× FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记小鼠抗人 IgG</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD22，PerCP-Cy5.5，克隆号：HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

从永生化分选b细胞中生成重组人igg单克隆抗体

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

寻找生成人单克隆抗体的新方法是一个活跃的研究领域，对基础科学和应用科学（包括免疫治疗药物的开发）均具有重要意义。然而，用于鉴定和生产此类抗体的技术往往较为繁琐，有时还会导致抗体的重链与轻链配对分离。本文介绍一种相对简单、直接的方案，即利用EB病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）感染并结合Toll样受体9激活，从人外周血单个核细胞中制备人源重组单克隆抗体。通过适当的染色标记，可分离出产生抗体的B细胞，进而进行永生化和克隆扩增。由永生化B细胞克隆所产生的抗体转录本可通过PCR扩增，测序获得对应的重链和轻链配对序列，并克隆至免疫球蛋白表达载体中。利用该技术获得的抗体可成为研究相关人类免疫应答（包括自身免疫）的有力工具，并为新型治疗药物的开发奠定基础。

染色CD22和IgG阳性细胞后的分选设门策略如图1所示。该图中，双阳性细胞（即产生IgG抗体的B细胞）区域被选中，以将所有此类细胞分选至单独的离心管中。在分析中，该双阳性细胞群约占总PBMCs的1%。所获得的分选细胞数量将取决于第1节中获取的细胞数量。
EBV 永生化和 CpG（ODN2006）刺激处理 5 周后的不同结果如图 2所示。检测生长中的克隆较为容易：Wi38 饲养层细胞呈更长的成纤维细胞样形态，而 B 细胞克隆则表现为非常小的圆形细胞，聚集生长在圆底多孔板的中央区域。在此阶段，可明显观察到部分克隆开始生长。然而，生长速度可能存在差异，且某些含有永生化细胞的孔中可能完全无细胞生长。
如表2所示，通过ELISA检测增殖克隆的上清液以鉴定IgG。该ELISA中同时检测IgG的标准曲线、克隆上清液以及空白对照。当ELISA检测值高于空白对照值3个标准差时，判定为阳性克隆；阴性克隆的检测值则低于空白对照3个标准差。为确认结果...

人源单克隆抗体的合成是研究自身抗体介导的免疫反应病理生理机制的首要步骤。我们已建立一种从分选的血液B细胞中制备重组人免疫球蛋白G（IgG）单克隆抗体的实验方案，包括B细胞分离、抗体克隆及 体外 合成

从永生化分选B细胞中生成重组人IgG单克隆抗体

寻找生成人源单克隆抗体的新方法是一个活跃的研究领域，对基础科学和应用科学均具有重要意义，……

本实验的总体目标是克隆并表达由B细胞产生的抗体。首先从血液或胸腺等相关的组织来源中分离B细胞。第二步是进行分选，并筛选出能够产生IgG的B细胞群体。接下来，通过EB病毒（Epstein-Barr virus）感染并联合使用C-P-G-O-D-N 2006激活Toll样受体9，使细胞永生化，并进行体外培养。后续步骤是从经ELISA检测确认可产生IgG的克隆中提取RNA，并对IgG轻链和重链分别进行cDNA合成。最终，可将IgG序列克隆至哺乳动物表达载体中，以大量生产人源单克隆IgG抗体。与现有的噬菌体展示技术等方法相比，该技术的主要优势在于能够保持原始的IgG重链和轻链配对不丢失。该方法可回答自身免疫领域中的关键问题，例如致病性自身抗体的发现及其功能表征。请注意，操作患者样本和EBV病毒可能存在风险。EB病毒是一种人类病原体，在执行这些步骤时应始终采取预防措施，例如使用VSL二级个人防护装备并穿戴充分的防护用品。在对PBMC进行染色前，将其接种于含六毫升完全RPMI 1640培养基的25平方厘米培养瓶中，过夜恢复。阻断并洗涤细胞后，用0.5毫升培养基将PBMC收集至离心管中，离心沉淀。然后将细胞重悬于标记缓冲液中并进行计数。接下来，将两份各含500万个细胞的样品分别置于离心管中，每管体积为200微升缓冲液。向其中加入10微升抗CD22 PE-Cy5（PE-R-C-P）抗体或40微升抗IgG PE抗体，冰上避光孵育30分钟，随后洗涤、过滤并分选细胞。目标是计数双阳性细胞。首先将分选后的P BMCs用RPMI 1640完全培养基稀释至每微升含一个细胞，并加入C PG 2006和EBV。然后在生物安全柜中，将110微升含有EBV和C PG 2006的细胞稀释液接种至已预先铺有经照射处理的WI 38细胞的96孔圆底培养板的两个孔中。每孔感染50个细胞的条件已优化，可提高获得单克隆抗体的概率。然而，我们建议通过 PCR 确认此结果。孵育一周后，在显微镜下观察细胞以检查 B 细胞生长情况。两周后，缓慢更换培养基，从每个孔中吸取 90 µL 培养液，并转移至新的培养板中。通过ELISA检测IgG的产生。然后向每个孔中重新加入100微升新鲜的完全培养基，其中包含IL-2。继续监测克隆在第三周和第四周生长期间的生长情况。每周重复更换培养基。有关克隆扩增方法，请参见文字版实验方案。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测培养基更换上清液中的IgG产生情况。首先，准备ELIZA板，向每个孔中加入50 µL用包被缓冲液按1:200稀释的山羊抗人FC抗体。孵育并洗涤平板后，每孔加入100 µL封闭缓冲液进行封闭，并再次孵育平板。封闭孵育结束后，将孔中的液体倾倒在纸巾上弃去。完成板的制备后，用四倍体积的RPMI稀释上清液。对于标准对照，将人IgG溶液在RPMI中进行系列稀释，浓度从每毫升1000纳克稀释至每毫升15.6纳克。同时设置一个空白对照。向每个孔中加入50 µL上清液或标准品，将ELISA板在37°C下孵育1小时，孵育方式相同；可额外设置ELISA板以分析上清液的进一步稀释液，用于检测抗体亲和力。孵育结束后洗涤平板。然后向每个孔中加入含辣根过氧化物酶标记的Fab2的50微升孵育缓冲液。再孵育一小时并再次洗涤后，向每个孔中加入100微升含TMB的底物溶液。随后孵育平板最多10分钟，直至出现的蓝色稳定不变。然后终止反应并测定吸光度。任何克隆上清液的测定吸光度值若超过空白对照三个标准差，则判为阳性。对于人IgG抗体，可通过进一步的检测方法确定其抗原特异性。首先，按照文本方案从阳性克隆中合成互补DNA。然后针对IgG重链、κ和λ轻链设置PCR反应。在结果中，于400至550个碱基对处找到重链，在300至400个碱基对处找到轻链。如果未出现目标条带，可取一微升扩增产物作为模板进行下一轮PCR扩增。新产物应处于适当范围内。然后对最佳产物进行克隆。首先，对它们进行测序，其电泳图谱应清晰，并对应于单一的免疫球蛋白序列。按照文本方案操作。将纯化的PCR产物克隆至1微克的质粒DNA中。务必在16摄氏度下连接过夜。使用 T4 DNA 连接酶，在添加补充剂的 DMEM 培养基中制备 HX 细胞，并将其在 75 平方厘米的培养瓶中培养至 75% 融合度。对于每一轮重链和轻链转染，准备一个混合液，其中包含 1.75 毫升无血清的 DMEM，加入 4.5 微克重链载体、3 微克轻链载体以及 50 微升聚乙烯亚胺溶液。将此混合液轻轻加入 HX 细胞培养板中，并轻柔摇晃培养板使溶液均匀分布。将培养板孵育过夜，随后开始每天收集培养基，并更换为无血清培养基。该培养基中含有抗体，可在对CD22和IgG阳性pBMCs进行分选并染色后连续收集四天。将产生IgG抗体的双阳性细胞区域单独收集用于扩增。约1%的PBMC属于该双阳性群体。经过EBV永生化及CPG 2006刺激五周后，分离得到永生化克隆。WI 30 饲养细胞呈更长的成纤维细胞样形态，而 B 细胞克隆则表现为生长在圆底多孔板中央的小型圆形细胞簇。使用 ELIZA 检测扩增克隆的上清液中 IgG。阳性克隆通过 ELI 值评估，即高于空白值三个标准差的数值。至少三个来自阳性克隆的上清液在ELI检测中呈阳性。在克隆免疫球蛋白重链和λ轻链配对的可变区与恒定区后，对阳性克隆的抗体进行了测序，从而能够表征重链和轻链的特征。按照此流程进行。还可以进行其他方法，如测序，以回答更多问题，例如抗体使用、基因使用、遗传多样性等。该技术的发展为自身免疫领域的研究人员探索重症肌无力等自身免疫性疾病的发病机制、病理过程及相关治疗策略铺平了道路。该技术的意义还延伸至疾病的诊断与治疗，因为致病性抗体的发现有助于开发新的治疗方法，例如缺乏炎症活性的竞争性抗体。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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