Name: 三氯化铁诱发血栓形成小鼠模型上的颈动脉和肠系膜血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习使用三氯化铁在小鼠颈动脉和肠系膜血管上诱导血栓形成的方法。通过活体显微镜实时监测血栓动态形成，并利用多普勒血流仪测量血流变化，为抗血栓药物研发提供可靠的体内研究模型。

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作者谨此感谢 Joy Yao 和 Karen Alt 博士提供的技术支持，&#160;以及来自NHMRC和NHF的资助。

所有涉及动物的实验均经阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物伦理委员会批准（E/1534/2015/B）。所有外科操作均在完全麻醉下进行，动物在任何阶段均未经历疼痛。所描述的所有实验均为非复苏性实验。
1. 准备
<ol>
	<li>将滤纸切成细条（1 mm × 2 mm）。</li>
	<li>用去离子水新鲜配制4%（w/v）和6%（w/v）的三氯化铁溶液。配制0.3%的罗丹明6G PBS溶液，经0.22 µm滤膜过滤。</li>
	<li>从注射器包装的白色塑料部分剪下一小块（5 mm × 1 cm）。</li>
</ol>
2. 活体显微镜观察肠系膜小动脉血栓形成
<ol>
	<li>称取一只10-12周龄的雄性C57Bl/6野生型小鼠，并通过腹腔注射给予相应剂量的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。通过脚趾、尾巴和/或皮肤夹捏反应，角膜和眼睑反射，以及胡须运动的缺失来监测麻醉深度。&#160;必要时，可注射第二剂氯胺酮（50 mg/kg）以维持动物的麻醉状态。在麻醉期间，于动物眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于放置于37 °C加热垫上的小型培养皿中。 
	注意：尽管腹腔注射可能会引起动物疼痛，但这种不适的持续时间极短（少于3秒）。通过使用经验丰富的操作人员和合适的针头尺寸（25 G），可将注射相关的疼痛与不适降至最低。所有实验操作结束后，采用过量的氯胺酮和赛拉嗪麻醉，随后行颈椎脱位法处死所有动物。</li>
	<li>在皮肤上做一条长约3 cm的腹部正中切口，并小心切开腹膜。</li>
	<li>将小鼠置于培养皿的一侧，轻柔地将肠管外置，并用两根棉签小心展开肠系膜，使合适的血管暴露于培养皿表面。用柔软的擦拭纸适当擦干。 
	注意：为限制肠系膜血管的移动，可使用罂粟碱抑制肠道蠕动。</li>
	<li>将小鼠尾部浸入温水中以扩张血管，并注射 30 µl&#160;通过29 G注射器将罗丹明6G（0.3%）注入小鼠尾静脉，以标记白细胞和血小板。</li>
	<li>将培养皿置于倒置显微镜下，使用明场通道对选定的微动脉进行聚焦。</li>
	<li>用一条浸有6%（w/v）氯化铁溶液的滤纸条，借助两把镊子将其贴附于微动脉上；其中一把镊子用于夹持滤纸条，另一把轻轻将其压在目标区域。自滤纸条放置后立即观察前10秒内的血栓形成情况。 
	注意：损伤周围微血管的情况较为常见，因此精确放置滤纸并施加轻柔压力至关重要，以尽量减少此类问题。</li>
	<li>通过滤纸使用荧光显微镜（TRITC通道：最大激发波长557 nm，最大发射波长576 nm）观察血栓形成。循环中的白细胞和血小板摄取了罗丹明6G，其在血栓中的聚集现象因此易于识别。</li>
	<li>暴露于氯化铁1分钟后取下滤纸，继续监测血栓的形成。用PBS冲洗血管。</li>
	<li>观察并记录用罗丹明6G标记血小板和白细胞后所呈现的血栓动态形成过程。采集图像并测量血栓的大小。本文所示图像采用倒置活体显微镜通过4X物镜在TRITC荧光通道下获得。</li>
	<li>按照所有操作步骤后，使用过量的氯胺酮和赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
</ol>
3. 通过血流速度测量评估颈动脉血栓形成
<ol>
	<li>称取一只10至12周龄的雄性C57Bl/6小鼠体重，并通过腹腔注射给予相应剂量的氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠用胶带固定于手术显微镜下，四肢固定于调节至37 °C的加热垫上。</li>
	<li>用一张擦拭纸制作一个小枕头，用胶带固定在小鼠头部下方，使其头部略微抬高。使用带镊子的线圈钩住小鼠鼻部并向下牵拉（钩住上门齿），以暴露颈总动脉区域，便于操作。</li>
	<li>在下颌正下方的皮肤上做一个小切口，深度5毫米，沿正中线向下至胸骨。</li>
	<li>解剖筋膜，分离出左侧或右侧颈总动脉分叉上方的一段血管片段。</li>
	<li>用镊子小心地插入动脉与神经之间，将其分离。避免干扰紧邻动脉走行的神经，不要过度触碰颈动脉，以免损伤血管。分离出至少5 mm长的一段动脉。</li>
	<li>用擦拭纸将动脉部位彻底擦干，以避免任何液体干扰 FeCl₃3.</li>
	<li>将小块白色塑料片置于分离出的颈总动脉下方，使 FeCl₃3 不会浸润周围组织。为此，使用第二把镊子将组织片移至第一把镊子处，然后缓慢将塑料纸插入动脉下方。</li>
	<li>将一张滤纸用4%（w/v）或6%（w/v）的氯化铁溶液浸湿，然后将其环绕放置在动脉周围。</li>
	<li>孵育3分钟后，移除滤纸，用PBS冲洗，并用擦拭纸擦干该区域。</li>
	<li>将多普勒血流探头放置于损伤区域的血管周围，开始记录血流变化。在成年小鼠健康的颈总动脉中，血流速度通常约为1 ml/min。注意！探头接触氯化铁会对其造成损伤，因此应避免任何接触。本文所示数据采用Transonic System Inc. 流量计TS420，配备Nano Doppler血流探头0.5 PBS的血管周围模块获得。 
	注意：氯化铁的浓度会影响血栓形成的动力学，导致不同的闭塞时间。因此，6%（w/v）氯化铁处理比4%（w/v）氯化铁处理产生更快的闭塞。</li>
	<li>完成所有操作后，使用过量的氯胺酮和赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱位，并仔细清洁多普勒探头。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

三氯化铁诱导的血栓形成模型是一种优秀的研究工具。本研究表明，该方法实施极为简便，且当与活体显微镜或激光多普勒血流仪联用时，可实现对血栓形成的良好实时监测。通过调节 FeCl3 的作用时间与浓度，还可选择性地生成非闭塞性或闭塞性血栓。
然而，该方法也存在一些局限性。在颈动脉中，主要缺点是尽管可以有效调节闭塞时间，但模型的可重复性仍然较弱，难以精确控制血栓的大小和生长速率10。多个研究团队已致力于该模型的标准化工作28,29。Owens et al. 提出，通过实践并减少各种变异因素，例如小鼠的年龄、小鼠的遗传背景、所使用的麻醉方式、三氯化铁暴露技术以及三氯化铁溶液的浓度，可以获得可靠且可重复的闭塞时间28。多普勒探头本身也存在一定局限性，存在一定程度的背景信号，可能影响闭塞的判定。此外，不稳定的血栓形成也可能改变血流状态。
在肠系膜血管上，可重复性可能受到血管尺寸变异的影响，其变异程度大于颈动脉，且脂肪的存在可能会降低损伤程...

研究血栓形成机制及评估抗血栓药物疗效需要建立完善的实验动物模型。大型动物模型最早被用于此类研究，因其血管较大，较啮齿类动物更接近人类。1然而，高昂的成本、所需更大的设施以及遗传操作上的困难是其应用的主要缺点，因此大型动物目前仅限于在啮齿类动物的初步实验获得明确结果后，用于后期的临床前研究。2。由于转基因和基因敲除品系广泛可得，且其体型较小，可最大限度减少抗血栓药物所需的用量 体内 测试时，小鼠主要用于血栓形成研究。因此，已开发出多种小鼠血栓性疾病模型3.
许多已建立的血栓形成模型会破坏血管壁的内膜层，进而使血流暴露于内皮下细胞外基质，诱导血栓形成4血栓可能由胶原暴露引发血小板活化，和/或组织因子暴露激活凝血级联反应所致。5. 随后采用多种技术实现初始血管损伤。Pierangeli 等 使用显微外科工具在股静脉上建立了一种机械性损伤模型6. Kikushi 等 描述了一种模型，该模型包括给予一种光敏化合物（玫瑰红）以使其在内皮细胞的脂质双层中聚集，随后用绿光（540 nm）特异性激发目标血管壁7. 也可通过短时高强度脉冲激光照射来诱导损伤8另一种最初在大鼠颈动脉上建立的技术是氯化铁（FeCl₃）的局部应用。3)9在此情况下，血管去内皮作用是由 FeCl 产生的自由基引起的。3 导致脂质过氧化和内皮细胞破坏10损伤会诱导多种黏附分子的表达，从而触发血小板黏附与聚集，以及白细胞的募集。已有研究表明，白细胞尤其是中性粒细胞，在激活血液凝固级联反应并导致血栓形成的过程中发挥着关键作用。11该方法非常适合重现凝血级联反应；研究人员必须注意，在此小鼠模型中，血栓通常在健康的血管中被诱导形成，而人类的血栓主要发生在病变的血管中 例如动脉粥样硬化血管
由于该模型在小动物中实施非常简便且效果显著，现已成为小动物血栓形成研究中最常用的模型 体内 研究。此外，该技术还可用于在多种血管中诱导血栓形成。靶向血管可以是大直径的动脉或静脉（如颈动脉、股动脉、下腔静脉）或小直径的血管（如肠系膜、提睾肌血管）12–14最近，该方法也被用于大脑中动脉近端，以建立脑卒中模型15可通过血小板和白细胞荧光标记后利用活体显微镜直接观察血栓形成，或通过温度探针或多普勒探针测量血流减少来监测12,16,17随后可研究多个参数，如闭塞时间、血栓形成时间或血栓大小。由于所研究血管之间的生理差异，所获得的血栓存在显著差异。因此，研究者通常根据拟测量的参数和/或拟研究的疾病状态来选择目标血管。通常，颈动脉模型更适用于与心肌梗死或脑卒中相关的动脉粥样硬化性血栓形成研究，而下腔静脉模型则更适用于深静脉血栓形成的研究。不同血管的可操作性也决定了血栓生长的测量方法。例如，肠系膜血管易于操作，因此该模型非常适合活体显微观察及血栓形成动态过程的研究。颈动脉较难操作但管径较大，便于血流测量，是研究闭塞性血栓形成的理想模型。
氯化铁诱导的血栓形成模型在理解该病理机制方面取得了巨大进展。该模型已被广泛应用于多项聚焦于血管性血友病因子在血栓形成中作用的研究中18,19结合基因修饰技术，该方法已助力识别出许多参与血栓性疾病的相关基因。Lamrani 等例如，已有研究证明，JAK2 的基因敲入V617F 基因与不稳定凝块的加速形成相关20. Zhang 等 已研究了血小板P2Y12受体的生理学意义，并证明仅在血小板中特异性过表达该受体的转基因小鼠，在三氯化铁损伤的肠系膜动脉中表现出更快且更稳定的血栓形成321该方法还研究了组织型纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）在纤维蛋白降解过程中的关键作用。22此外，该模型还提供了一种简单且准确的方法，用于检测多种新型药物的纤溶能力。 体内例如，Wang 等 已采用该模型对一种靶向活化血小板的新型重组纤溶酶原激活剂进行临床前验证23该方法还可用于验证从蜱虫、吸血蝙蝠和蚊子的唾液或蛇毒中分离得到的治疗性蛋白质，并能特异性地识别其靶标。24-27这些实例展示了三氯化铁模型的多功能性。本文中，我们重点介绍两种方法，并研究三氯化铁在两种不同类型血管——肠系膜血管和颈动脉上诱导的血栓形成。

<table><tbody><tr><td>沃特曼色谱纸</td><td>GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>氯化铁（III）40%（w/v）</td><td>VWR</td><td>24212.298</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明6G</td><td>Sigma</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>数字黑白相机&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td></td></tr><tr><td>多普勒血流仪</td><td>Transonic</td><td>TS420</td><td></td></tr><tr><td>纳米多普勒血流探头</td><td>Transonic</td><td>0.5 PBS</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Hospira&amp;nbsp;</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rampun）</td><td>Bayer</td><td>75313&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器（29 G）</td><td>BD Ultra-Fine</td><td>326103</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>BSN medical</td><td>211827A</td><td></td></tr><tr><td>Dynek dysilk缝合线</td><td>Dynek Pty Ltd</td><td>CS30100</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco life technologies</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Kirchner</td><td>T60</td><td></td></tr></tbody></table>

颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

严重的血栓形成及其缺血性后果，如心肌梗死、肺栓塞和中风，是全球主要的健康问题。三氯化铁损伤法现已成为一种成熟的技术，可快速、准确地在暴露的小或大直径静脉或动脉中诱导血栓形成。该模型在血栓形成病理生理学研究、新型抗血栓药物的发现与验证，以及这些新药作用机制的理解中发挥了关键作用。本文介绍了该技术在小鼠肠系膜血管和颈动脉上的应用。该方法描述了如何用荧光染料标记循环中的白细胞和血小板，并通过活体显微镜观察暴露的肠系膜组织，检测这些细胞在受损血管壁处的聚集，从而形成血栓的过程。在颈动脉实验中，通过多普勒探头监测血流，测量血栓形成所导致的血管闭塞情况。

通过荧光活体显微镜观察肠系膜，可显示被FeCl3损伤的血管壁上聚集了罗丹明6G标记的血小板和白细胞。在一个200 µm的肠系膜血管中监测到部分血栓的逐步形成过程（图1）。暴露于FeCl3后约1分钟，血栓开始缓慢出现并可被清晰识别（图1，t = 60 秒）。在移除FeCl3浸润的滤纸40秒后，血栓形成迅速进展，最终在整个被观察的血管节段壁上均可见血栓（图1，t = 100 秒）。
<img alt="血栓形成过程、显微延时图像、血管、凝血发展。" src="/files/ftp_upload/52838/52838fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：通过肠系膜血管活体荧光显微镜观察血栓生长。 图像分别在放置浸有6% ...

本文描述了在小鼠中通过FeCl3诱导血栓形成的模型。该方法通过肠系膜血管的活体显微镜观察以及颈动脉血流测量来监测血栓的生长。

严重的血栓形成及其缺血性后果，例如心肌梗死、肺栓塞和中风，是全球主要的健康问题。三价铁……

本实验的总体目标是监测小鼠暴露血管中诱导形成的血栓。首先暴露目标血管，随后将一小片浸有氯化铁的滤纸放置于血管上，以在肠系膜血管处诱导血栓形成。通过颈动脉内试管显微镜监测形成血栓的细胞聚集情况。利用多普勒血流仪测量血栓引起的血流变化。使用氯化物在红细胞的 CED 动脉中诱导血栓形成的方法，最早由 Coz 教授及其同事于 1990 年建立。此后，该方法已被应用于小鼠，并用于研究多种不同的血管。目前，该方法已成为我们研究领域中最常用的血栓形成模型，帮助解答了诸如易损因素的血管壁作用以及P2Y12血小板受体在血栓形成中的应用等关键问题。在开始操作前，将滤纸切成一乘二毫米的条状，并从注射器包装纸上剪下一小块三乘五毫米的白色塑料片。接下来，在确认动物对夹捏无反应后，将兽医用软膏涂抹于每只动物的眼睛。然后，为诱导肠系膜动脉血栓形成，将小鼠置于盛放在37°C加热垫上的小型培养皿中，通过一个3厘米的切口打开腹腔，随后仔细切开腹膜。将小鼠侧置于培养皿中，并轻柔地将肠管外置。然后使用两根棉签，小心地展开肠系膜，使合适的血管显露于培养皿表面，并用精细擦拭纸小心擦干组织。接着，用温水浸泡使尾部血管扩张，随后静脉注射 30 微升新配制的 Domine 六 G，以标记循环中的白细胞和血小板。然后将培养皿置于倒置显微镜下，使用明场通道松解选定的动脉。现在，用新配制的6%氯化铁溶液浸湿一条滤纸条，用一对镊子夹起滤纸，小心地仅将其压在目标动脉上。通过滤纸利用活体倒置荧光显微镜观察血栓的形成。在沉积开始后的前10秒内，循环中的Domine Six G标记的白细胞和血小板的聚集将有助于轻松识别血栓。暴露一分钟后，移除滤纸。随后在监测血栓形成的同时，用PBS冲洗血管，并记录标记的血细胞所显示的血栓动态形成过程。也可采集血栓的静态图像，以辅助测量随时间推移的血管闭塞情况。为评估颈动脉血栓形成，将麻醉小鼠的四肢用胶带固定在手术显微镜下预热至37摄氏度的加热垫上。然后在动物头部下方垫一个由擦拭纸折叠而成的小枕头，并用带镊子的线圈钩住上齿向后牵拉鼻尖。暴露颈动脉区域后，从下颌正下方开始沿中线向下至胸骨做一微小皮肤切口。然后解剖筋膜，分离出颈总动脉左侧或右侧分叉上方的一段血管片段。接着，小心地将镊子插入动脉与神经之间，将其分离，注意不要损伤神经。然后用一把镊子夹住小块白色塑料片，另一把镊子缓慢地将其滑入已分离的血管段下方，以防止氯化铁浸润周围组织。用擦拭纸小心擦干动脉。将滤纸条浸入 4% 或 6% 的氯化铁溶液中，然后将滤纸条包裹在动脉周围。三分钟后，移除滤纸，用 PBS 冲洗血管，并用擦拭纸将组织擦干。然后将多普勒血流探头放置在损伤区域的血管周围，记录血流的变化。在此处，通过体内荧光显微镜监测了200微米肠系膜血管中部分血栓的逐步形成过程。在本实验中，血栓在氯化铁暴露后的第一分钟内即变得清晰可辨。滤纸移除40秒后，血栓迅速进展，最终在整个血管节段的管壁上观察到完全的血栓形成。正如这些数据所示，在未受损的颈动脉中，大约每分钟1.1毫升的稳定血流是典型的。暴露于4%氯化铁三分钟后。在此实验中，使用6%三氯化铁诱导，获得闭塞性血栓，闭塞时间为13分钟30秒。闭塞时间缩短了整整4分钟。活体显微观察通过可视化血栓降解过程，为在体内简便而准确地检测多种新型药物的溶栓能力提供了有效方法。对颈动脉血流的监测已成为研究抗血栓药物疗效的有用工具，并可用于评估药物是否能够预防或延缓血管闭塞。

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三氯化铁诱发血栓形成小鼠模型上的颈动脉和肠系膜血管

我们报道了一种改良的三氯化铁（FeCl3）诱导的颈动脉、肠系膜动脉以及静脉血栓形成模型，该模型可通过活体显微镜高效地监测闭塞性血栓形成的时间。...

氯化铁诱导的小鼠血栓形成模型

本文介绍了对一种已得到充分表征且常用的小动物氯化铁（FeCl3）诱导颈动脉损伤模型进行必要的改进，以适用于大型动物血管损伤模型。该改进后的模型可用于临床前试验，评估预防性和溶栓性药物及机械干预措施的效果。...

氯化铁诱导的犬颈动脉血栓形成：一种血管损伤的大动物模型

本方案描述了如何利用三氯化铁（FeCl3）介导的损伤诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样本，用于电子显微镜分析。...

三氯化铁诱导的动脉血栓形成及用于三维电子显微镜分析的样本采集

本研究介绍了一种利用氯化铁诱导大鼠上矢状窦血栓形成的可重复、微创动物模型的建立方案，该方法结合丝线结扎技术，并采用激光散斑血流成像和高分辨率超声进行评估。...

改良氯化铁诱导上矢状窦血栓形成模型的建立

本文描述了一种部分颈动脉结扎手术，该手术可在小鼠颈总动脉中引起血流紊乱，并在两周内导致动脉粥样硬化形成，四周围内出现斑块内新生血管。我们还介绍了一种从颈动脉内膜分离RNA的新方法，可获得高纯度的内皮细胞RNA。...

小鼠颈动脉部分结扎诱导血流紊乱性动脉粥样硬化模型及颈动脉内皮细胞RNA简易提取方法

小鼠下腔静脉完全阻断型血栓形成模型可产生可量化的静脉壁组织和血栓。该模型已证实可用于评估静脉壁与阻塞性血栓之间的相互作用，以及急性向慢性炎症转变的过程。...

小鼠下腔静脉血栓完全淤滞模型

我们在视频中演示了一种使用血管内单丝线栓在成年小鼠中建立大脑中动脉闭塞的方法。同时展示了如何通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死范围。...

小鼠大脑中动脉闭塞模型

本文描述了一种小鼠颈动脉支架植入模型。与其他类似方法相比，该手术操作极为快速、简便且易于实施，能够方便地研究血管壁对不同药物洗脱支架的反应以及再狭窄的分子机制。...

用于研究再狭窄的颈动脉支架植入小鼠模型

我们描述了一种在成年小鼠中建立可靠的脑静脉高压模型的方法。该模型已在大鼠中得到广泛描述和验证。这一小鼠模型的建立使得能够使用基因修饰动物，从而拓展了该模型的应用范围。...

成年小鼠静脉高压模型：颈总动脉至外颈静脉吻合术

本方法旨在通过颈动脉持续输送药物溶液，以评估新药在小鼠模型中的药代动力学。...

小鼠中紫杉烷类药物药代动力学与药效学分析的颈动脉灌注

学习使用三氯化铁在小鼠颈动脉和肠系膜血管上诱导血栓形成的方法。通过活体显微镜实时监测血栓动态形成，并利用多普勒血流仪测量血流变化，为抗血栓药物研发提供可靠的体内研究模型。

颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

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