噬菌体型组学:生理途径来表征新型病毒蛋白

以下实验的总体目标是筛选和表征功能未知的噬菌体基因。首先，推定的噬菌体。称为 ORF 的病毒开放阅读框在大肠杆菌中表达。

噬菌体的克隆。将表达 Orff 的大肠杆菌接种到多表型测定板或图谱中，其中包含生长、培养基和各种底物。然后通过光谱法监测细菌随时间的生长，作为第二种分析方法，表达大肠杆菌的噬菌体基因在连续培养或连续批量培养中生长。

然后收集所得生长代谢物并送去通过气相色谱、飞行时间质谱法进行代谢组学分析。所得数据提供了与单个假定噬菌体开放阅读框的表达相关的表型谱。该方法最初是为了阐明未知小瓶蛋白的功能而开发的。

它还可以应用于研究基因型和表型之间联系的研究，以及检查细菌噬菌体和宿主之间跨生物群落的相互作用。通过用大肠杆菌克隆识别号和映射示意图类型标记无菌 96 孔微量滴定板来开始此过程，该示意图类型表示在测定中正在测试的底物。无菌地将无菌水转移到储液器中。

然后使用多通道移液器将 60 μL 水转移到微量滴定板的每个孔中。接下来，在无菌条件下将 3 个 X 基础培养基转移到储液器中。然后使用多通道移液器将 50 μL 转移到微量滴定板的每个孔中。

使用相同的技术，移液 50 微升图示中使用的每种基础培养基。接下来，将 30 μL 的每种底物转移到适当的物质中。然后，使用多通道移液器将 10 μL 细菌细胞转移到每个孔中。

在将移液器重新引入培养液原液之前，请务必更换吸头。用粘板膜覆盖每个板。用力按压板孔顶部和边缘的薄膜，以形成均匀和紧密的密封。

使用无菌剃须刀片，去除微量滴定板边缘的任何多余薄膜。将准备好的图放入 multipl 分光光度计的输入套管中。打开读板器软件并创建一个方案，每 30 分钟测量一次吸光度，总共 32 小时。

在两次读数之间摇晃 60 秒，将设备中的温度设置为 37 摄氏度。一旦图谱平衡到设定温度，32 小时后开始方案，从读板器的输出套管中取出图谱。使用 e coone 标识号、日期和地图逻辑示意图类型标记每个数据文件。

按照随附文件中的描述分析数据，以评估生长和生物学相关的生长。来自代谢物分析的参数 细胞可以通过连续或连续传代批次 Turing 培养。保持稳定状态。

在这里，我们将演示一种持续的文化。如随附文件所述，对 75 毫升连续培养反应器和 2 升奶瓶的组件进行消毒灭菌后，将所有高压灭菌器材料放入生物安全柜中，并在培养基冷却时打开紫外线灯。培养基冷却后，加入 0.1% L 阿拉伯糖，每毫升 100 μg。

将氨苄青霉素加入 75 毫升 0.5 XLB 肉汤中，然后将其转移到连续反应器中。解开连续培养反应器盖并将其拧到反应器上。避免接触采样管，解开奶瓶盖并将其拧到奶瓶上。

避免接触采样管，保持连接到 epsilon 端口的 18 英寸管路无菌。解开 18 英寸管路和蠕动泵管路。适配器 将 18 英寸管的一端安装到蠕动泵管的一端 适配器将蠕动泵管适配器的另一端安装到 18 英寸管上。

连接进料瓶盖的端口 ε 将零点 22 微米过滤装置连接到连续培养反应器的端口、β 和 delta 上。将零点 22 微米过滤器单元连接到端口 alpha 的适配器上。最后，将 18 英寸管子连接到生物安全罩中。

用 100 μL 大肠杆菌过夜培养物接种连续培养器，如随附文件所述。拧紧反应器和补料瓶盖，然后将系统移至 37 摄氏度的培养箱中。配备磁力搅拌板和微型蠕动泵，将蠕动泵管道适配器安装到蠕动泵中。

进料瓶的管道进入泵并引向反应器。将泵设置为快速，然后启动它。切换到正向检查，以确保介质开始流经管路。

将反应器放在磁力搅拌板上并开始混合。让连续培养反应器平衡 24 小时，然后在第二天取样。要对连续培养物进行采样，请将 5 毫升诱饵锁注射器拧到端口 γ 上，然后取出 4.5 毫升培养物。

使用 500 微升培养物测量 600 纳米的光密度。然后使用剩余的等分试样以 OD 600 为 0.35 和 1.7 毫升微量离心管制备四个 1 毫升培养物，以制备用于气相色谱、飞行时间质谱或 GC 至 F ms 的样品。将细胞以 16， 900 倍 G 离心 2 分钟以沉淀。

离心倾析后，上清液然后用 500 微升 PBS 洗涤。执行此洗涤。第二次，将上清液倒出至最终时间，然后将含有沉淀细胞的微量离心管浸入液氮中。

在鼓泡停止之前，将样品储存在零下 80 摄氏度的冰箱中。收集完所有样本后，每 12 小时重复采样一次，持续 4 天。将干冰上的每个克隆 3 个样品运送到代谢组学核心设施，用于样品处理分析并将 GC 标准化为 f ms，以获得病毒开放阅读框。

海水是从珊瑚边界层以下的南线群岛的星巴克岛和卡罗琳 AOL 收集的。使用图谱评估了 47 个克隆在 72 种碳特定条件下的细菌生长情况。然后使用所得数据将克隆分类为预期生长、功能获得、功能丧失和无生长表型。

检验携带功能相似蛋白质的克隆具有代谢组学特征的假设。通过 GC TOF ms 测定在连续培养中生长的 84 个克隆的中位代谢物丰度。然后使用所得数据根据克隆的相对代谢物丰度（用颜色表示）对克隆进行分层聚类。

最丰富的代谢物以红色显示，而丰度最低的代谢物以深蓝色显示。初步代谢组学分析显示，虽然结构和代谢基因没有明显地彼此分离，但那些对宿主表现出相似影响的基因确实相关。例如，注释的衣壳基因与本研究中强调的推定代谢基因紧密聚集 EDT 24 40 和 EDT 24 41 使用公开可用的跨膜拓扑和信号肽预测程序进行的研究显示，有证据表明两个推定的代谢基因都含有单个跨膜结构域。

有趣的是，第一个簇组中的 9 个克隆中有 5 个使用相同的拓扑结构预测了跨膜结构域。综上所述，这些数据表明该方法能够提供有关克隆代谢物谱、具有相关功能的潜在克隆和克隆代谢物异常值的信息。在尝试此程序时，重要的是要记住所介绍的方法在很大程度上受到细菌生理学的影响。

需要考虑确保克隆独立组在实验中防止污染，并使用适当的对照测试单个变量。