Name: 噬菌体型组学:生理途径来表征新型病毒蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解噬菌体型组学方法，通过多表型分析板和代谢组学技术在大肠杆菌中表征未知功能的病毒基因，揭示噬菌体与宿主细菌的代谢相互作用机制。

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感谢 Benjamin Knowles、Yan Wei Lim、Andreas Haas 以及病毒暗物质联盟（Viral Dark Matter consortium）成员对本手稿提供的帮助和建设性意见。本研究由美国国家科学基金会（National Science Foundation，项目编号：DEB-1046413）资助，是“维度计划：揭示病毒暗物质”（Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter）项目的一部分。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了用于假定噬菌体基因功能表征的表型组学方法。这些技术包括一种可监测宿主合成代谢的改良检测方法——多表型检测平板（Multi-phenotype Assay Plates, MAPs），以及能够测量对分解代谢影响的成熟代谢组学方法。我们还提供了额外的工具，用于管理这些技术所产生的大规模数据集，从而实现高通量的数据处理与分析24。最后，通过比较已注释的噬菌体衣壳蛋白、噬菌体硫氧还蛋白、两个假定的代谢相关噬菌体基因以及平均实验响应，我们提出了多种策略，用于解读这两类数据集和基因类别，重点在于识别表型趋势和异常值。
如前所述，这两种方法在定量上仅能测量宿主代谢的一半。为了阐释所研究的任何新蛋白质的相对功能，需要结合两种方法的数据来提供功能证据。尽管这并非我们当前论文的重点，但每种表型组学方法产生的数据都会进行组合分析，重点采用随机森林和主成分分析等聚类技术。此外，组合分析得出的假设必须随后通过传统的遗传学方法加以验证。
最后，所介绍的方法在很大程度上受到细菌生理学的影响，因此遵循相同的标准。在实施任一方法时，必须考虑确保实验对象为独立的克隆群体；防止污染；仅测试单一变量；并同时运行适当的对照。若未考虑这些因素，将导致结果不明确，与其他任何生理学检测的结果类似。
多表型检测平板（MAPs）
与现有技术相比，MAPs 的开发提供了一种高通量且可灵活调整的检测方法（图5A 和 表1、2）。该检测方法使用所有微生物学实验室中常见的耗材、设备和基本技术。通过整合用于后续数据处理与分析的计算流程 PMAnalyzer24，可确保快速解读数据。此外，该方法的实验和分析部分均可根据定制需求轻松调整或优化。例如，如果大部分数据未能通过第4节中所述的过滤标准，可手动检查生长曲线以识别问题所在。若问题源于过于严格的过滤参数，可对脚本进行相应调整；若问题与实验过程相关（例如，冷凝时间过长、细菌细胞转移不当等），则可方便地重复增加实验重复次数。
如 Cuevas 等24 所述，PMAnalyzer 是一个用 bash 编写的单一程序，作为封装脚本运行，可将解析和分析脚本作为统一、自动化的流程执行。所有脚本均可从 Git 仓库免费获取25，通过计算三份重复数据中每个时间点的中位数值，进而对逻辑曲线进行参数化，以获得滞后期、最大生长速率、渐近值以及一个新提出的参数——生长水平（Growth Level）。在本研究中，我们选择中位数而非平均值，以减少显著离群值的影响；然而，该脚本可轻松修改以计算重复数据的平均值。由于在重复数据中观察到的变异程度较低（标准误差，SE）（图 2A），我们在 PMAnalyzer 中继续采用中位数来拟合逻辑曲线。此外，本研究中定义的生长阈值（GL ≥ 0.4）是通过比较生长水平与最大生长速率在数据分布上的分离情况而确定的（图 1A,B）。根据所使用的仪器和模型系统的不同，该阈值可能有所变化，需重新定义此截断值。
我们检测方法的一个主要优势在于能够利用一个表征微生物总体生长情况的单一参数来比较表型，我们将该参数定义为生长水平（Growth Level, GL）。GL 采用调和平均数计算，因此可减轻数据中较大离群值的影响。通过反复试验，最终确定使用经位移逻辑拟合值的调和平均数来综合反映生长状况。其他曾尝试用于区分生长情况的方法包括：达到特定曲线参数所需的时间（如半最大生长速率 µ）最大，µ最大，以及环境容纳量），决定系数（R2），以及R的组合2 乘以特定的曲线参数。在评估生长情况时，使用经平移的逻辑拟合值的调和平均数来计算GL，可提供最广泛的分析范围，因此成为首选方法。需要注意的一点是，当使用单一参数或拟合模型时，动态生长曲线模式的特征可能丢失。例如，逻辑曲线和GL的各个独立曲线参数无法反映双相生长。在单一碳源环境中，这种对生长的影响意味着病毒蛋白可能介导了底物的转化或底物利用方式的转变。若不考虑多个生长参数，还可能忽略其他潜在效应，包括：延长的滞后期，提示病毒机制或产物带来的负担增加；指数期快速加速，提示病毒蛋白与宿主能量生成通路相偶联；或生物量形成水平更高，暗示病毒在宿主营养摄取和合成代谢中起到支持作用（数据未显示）。因此，绘制新生长曲线（图2A、B) 提供了随时间变化的趋势信息，而GL则考虑了逻辑模型中的主要变量，提供一个单一的定量数值来表示克隆的整体成功程度。
在考虑MAP中结构基因与代谢基因所贡献的不同响应时，发现所研究的不同底物类别为蛋白质功能提供了最有力的证据。例如，代谢蛋白通常与获取限制性营养物质相关，而这些营养物质与宿主中心代谢无特异性关联16,32。初步的MAP实验显示，携带推测代谢功能噬菌体基因的克隆在利用中心代谢碳源生长时，滞后期显著延长（图2A）。相反，携带推测结构基因的克隆由于需要大量消耗宿主的能量和dNTP池，在中心代谢及氨基酸代谢碳源上的生长表现为假阳性反应。这可能是由于不溶性蛋白的积累导致宿主细胞丝状化和/或包涵体形成，显微观察结果支持这一推断（图2A及未展示数据）。尽管仍需进一步分析以验证这些初步结果，但MAP能够获取与特定噬菌体基因类别假设功能相对应的表型响应。
除了阐明未知病毒蛋白外，微生物培养平台（MAPs）还为研究单个细菌或细菌群落的功能与代谢多样性提供了新的资源。MAP 组件设计为易于调整，以支持多种细菌的生长，包括海洋细菌、营养缺陷型细菌以及厌氧微生物。为了实现这一目标，在 MAPs 中培养不同属的细菌之前，需要向已定义的基础培养基和预培养基中添加或调整特定的化学成分。使用 MAPs 时需要注意的是，必须保持培养基成分的明确性，禁止使用胰蛋白胨、酵母提取物和蛋白胨等成分。
代谢组学
代谢组学领域依赖于代谢物数据库，这些数据库包含通过质谱鉴定出的独立代谢物。此处选用的核心平台拥有规模最大的代谢组学数据库之一。有趣的是，我们实验中检测到的代谢物中超过一半无法被鉴定（约65%），其余部分则从未在我们的宿主Escherichia coli中被记录过（例如：吲哚-3-乙酸33、水杨酸34和二氢松香酸35）。这一现象可能归因于数据库对植物代谢物的强烈偏向，或与当前研究的特定蛋白质有关。无论原因如何，结果是可用于数据呈现与分析的已知代谢物数量有限。未来，结合多种代谢组学方法并利用不同的数据库，将有助于实现更全面的代谢物覆盖。
目前，在比较和分析我们发现的新型病毒蛋白时，会同时使用已知和未知的代谢物。基于这一方法，我们推测，携带功能相似蛋白的克隆株其整体代谢组学谱图也会表现出更高的相似性。初步的代谢组学分析显示，尽管结构基因与代谢基因之间没有明显的分离趋势，但那些在过表达时对宿主产生相似效应的基因确实存在相关性（图6）。例如，被注释为衣壳蛋白（Capsid）的基因与本研究中重点标注的假定代谢基因EDT2440和EDT2441聚类紧密。利用公开可用的跨膜拓扑结构和信号肽预测程序进行分析发现，这两个假定的代谢基因均含有一个跨膜结构域。有趣的是，在系统发育树左侧第一个聚类组的9个克隆中，有5个通过相同的拓扑结构预测程序显示出存在跨膜结构域。然而仍需进一步研究，但很可能这些克隆在过表达过程中所呈现的代谢物与细胞应激反应相关，这种应激可能源于膜结构或结构蛋白带来的负担。该证据表明，尽管代谢组学数据中存在一定水平的噪声，该方法仍能够识别出反映基因总体效应的信号，无论是在同一基因类别内部还是跨类别之间。为了确定该方法是否能够提取出基因功能的特异性信息，我们将代谢物归类到特定的代谢通路中。其假设是：如果某个克隆影响了某一通路中特异性的代谢物，则该过表达基因很可能参与该通路。在建立我们的代谢组学质量控制流程之前，初步数据显示，富集或耗竭的代谢物通常被标记为“未知”，因此难以判断其关联的代谢通路（数据未显示）。然而，经过预处理的代谢组学数据表明，大多数代谢物谱图相似，仅少数已知和未知代谢物的丰度在不同克隆间存在差异，例如腐胺（putrescine）和尿嘧啶（uracil）（图6）。为了更精确地解析蛋白功能，目前正致力于将新发现的噬菌体基因与已知功能的噬菌体基因进行实验性比对，从而填补基于代谢物的功能表征中存在的“空白”。通过该技术，已知病毒基因的功能可作为未知基因功能推断的参考依据。然而，代谢组学分析的局限性在于数据库的规模及其相关性。为克服这些限制，亟需建立与本研究相关的代谢组学数据库，例如针对E. coli ASKA克隆文库中单个ORF过表达条件下特异的代谢物及其丰度的数据库36。2013年，劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员编制了首个针对模式细菌全突变体文库的综合性代谢物数据库，为这类数据库的必要性提供了证据37。该研究揭示了特定代谢物利用所必需的基因，明确了表型与基因型之间的清晰联系。
在将代谢组学作为研究工具时，明确核心设施所采用的处理流程至关重要。大多数实验流程都会产生一个常见的人为因素，即实验仪器在不同日期使用时带来的日常变异。迄今为止，所有气相色谱-质谱（GC-MS）分析均采用在每次分析运行中加入内标物的方法；然而，若在每一天的实验过程中额外加入项目特异性的内标样品，则可进一步消除额外的变异。这些因素必须在实验早期就予以考虑，以避免归一化过程中的问题和偏差。另一种解决方案是在同一核心设施中使用同一台仪器，并将所有样品作为单一批次进行处理，这一选项在任何核心设施中均可实现。
本文介绍并重新探索的各种工具为筛选和表征功能未知的噬菌体基因提供了新颖的方法。这些实验技术简单且具有良好的适应性，结合计算流程的高效使用，确保了这些方法可广泛应用于多种科研领域。我们的目标是，本文所呈现的表型组学方法将有助于进一步研究新型噬菌体蛋白，以及同样存在功能未知的其他系统。

据估计，感染细菌的病毒（又称噬菌体或噬菌体病毒）在全球范围内以超过1031个病毒样颗粒（VLPs）的形式存在，其数量超过环境中所有其他生物体的总和1,2。首个针对海洋环境相关病毒群落的宏基因组学研究聚焦于病毒组分中多样性的量化分析3。此外，Breitbart 及其同事发现，超过65%的病毒群落序列与公共数据库中任何已知序列均无同源性。后续的宏基因组研究也发现了类似证据：来自美国加利福尼亚州圣迭戈海域沉积物的宏基因组中含有75%未知病毒序列4；来自索尔顿海高盐湖泊的宏基因组中含有98%未知病毒序列5；而与珊瑚相关的宏基因组中则含有95–98%未知病毒序列6。这些大量未注释的信息积累使得噬菌体的遗传物质被称为“生物学宇宙中的暗物质”7。
噬菌体的基因组表征依赖于通过与现有的核酸和蛋白质数据库进行比对，识别序列相似性。由于噬菌体编码的遗传信息大部分未知，基于同源性的方法效果有限。在其基因组中，噬菌体通常编码三类主要基因：转录与复制基因、代谢基因以及结构基因。转录与复制基因（I/II类基因8）包括聚合酶、引物酶、内切/外切核酸酶和激酶。这些基因因其在噬菌体感染过程中对转录和复制遗传物质的重要作用而高度保守。噬菌体聚合酶由于在全球范围内具有高度保守性，可通过传统的序列同源性方法 readily 被识别9，并已被证明可作为有效的系统发育标记10。相比之下，噬菌体的代谢基因和结构基因（II/III类基因8）差异性日益增大，常被注释为假想基因。
噬菌体的代谢基因会影响宿主的代谢能力，但不一定为病毒复制所必需。这些基因通常被称为辅助代谢基因11（AMGs），似乎能够调节宿主的代谢过程，从而促进感染的顺利进行并提高病毒颗粒成熟的成功率。AMGs 已被发现与限制性营养物质的利用和吸收，或能量生成途径相关。一些实例包括在多种蓝藻噬菌体基因组中发现的光合作用系统基因12-16、与磷酸盐代谢相关并受其调控的基因17,18，以及利用戊糖磷酸途径合成噬菌体脱氧核苷三磷酸（dNTP）的基因18,19。相比之下，结构基因是在感染过程中中晚期表达的基因，其种类在不同的噬菌体-宿主系统中存在差异。结构蛋白的合成依赖于病毒 dNTP 的供应以及转录、翻译和组装所需的能量储备8。衣壳和尾部纤维结构蛋白被认为是所有病毒蛋白编码基因中最为多样的，且对成功产生病毒颗粒至关重要。其高度多样性通常归因于它们在塑造病毒与宿主共进化过程中所发挥的积极作用20。无论属于哪一类基因，高度分歧的蛋白质在使用传统的同源性分析和序列比对技术时都容易被忽视。为弥补严格序列比较所存在的局限性，研究人员已开发出能够利用序列特征来推断基因功能关联的生物信息学工具，例如人工神经网络21。人工神经网络（ANNs）可用于预测结构基因和代谢基因，但仍需通过下游实验验证以直接确定基因功能。
本文的目的是提供能够监测宿主细菌在表达通过人工神经网络（ANN）功能预测的新型噬菌体基因过程中分解代谢和合成代谢的表型组学实验方案。表型组学是与细胞表型相关的生物学领域，在系统生物学中已得到广泛应用，有助于研究功能未知或具有多效性的蛋白质。表型组学工具可用于关联表型信息与基因型信息。我们假设，对于假定的噬菌体基因，其功能可通过观察在噬菌体基因表达期间对宿主产生的生理效应来确定。为验证该假设，选择了两种定量方法：多表型检测平板（MAPs）用于监测宿主对底物的利用及其后续生物量的形成，而代谢组学则用于测定在特定环境条件下生长期间宿主代谢物的多样性及相对丰度。在大肠杆菌（Escherichia coli）中过表达假定的结构蛋白和代谢蛋白，并对两项实验的代表性结果进行比较。本文介绍了多种可视化技术及高通量数据处理流程，以促进实验的重复。最后，结合已注释的衣壳蛋白、噬菌体代谢蛋白硫氧还蛋白以及两个假定的辅助代谢基因（AMGs）所预期产生的生理效应，讨论了所展示方法的可重复性与准确性。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 无菌滤膜（Sterivex 滤器）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SVGP01050</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Millex 滤器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SLGV033RS</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m SteriCap 滤器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SCGPS02RE</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m Omnipore 膜滤器</td><td>Millipore</td><td>JHWP02500</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>96 孔微孔板</td><td>VWR</td><td>82050-764</td><td>标准 F 型底 96 孔微孔板</td></tr><tr><td>2 ml 96 孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板粘性封板膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369667</td><td></td></tr><tr><td>2 L Nalgene 方形瓶</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-70</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Nalgene 方形瓶</td><td>Cole Parmer</td><td>T-06040-50</td><td></td></tr><tr><td>1/4 英寸面板安装锁紧螺母，黑色尼龙材质</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔螺纹式面板安装接头转 200 系列卡套，1/16 英寸</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-30</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔螺纹式面板安装接头转 200 系列卡套，1/8 英寸</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45500-34</td><td></td></tr><tr><td>带锁环的雄性鲁尔接头转 500 系列卡套，适用于内径 1/16 英寸的管路</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-45505-31</td><td></td></tr><tr><td>带锁环的雄性鲁尔接头与雌性鲁尔耦合器</td><td>Cole Parmer</td><td>T-45508-80</td><td></td></tr><tr><td>卡套式贯通接头，外径 1/4 英寸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure 管路，内径 1/16 英寸 × 外径 1/8 英寸</td><td>SaniPure</td><td>AR400002</td><td></td></tr><tr><td>Sanipure 管路，外径 1/4 英寸 × 内径 1/8 英寸</td><td>SaniPure</td><td>AR400007</td><td></td></tr><tr><td>可调流速微型泵（蠕动泵）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Velp Scientifica</td><td>F203A0160</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-512-141</td><td>Millipore* 滤膜专用镊子</td></tr><tr><td>多孔板分光光度计读板仪</td><td>Molecular Devices Analyst GT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜真空过滤装置（滤器 manifold）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>XX10 025 02</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">软件：</td></tr><tr><td>Python 版本 2.7.5</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.python.org/&quot; target=&quot;_blank">http://www.python.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PyLab 模块</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://wiki.scipy.org/PyLab&quot; target=&quot;_blank">http://wiki.scipy.org/PyLab&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>R 版本 3.0.1</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.r-project.org/&quot; target=&quot;_blank">http://www.r-project.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>reshape2 程序包</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://had.co.nz/reshape&quot; target=&quot;_blank">http://had.co.nz/reshape&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ggplot2 程序包</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://ggplot2.org/&quot; target=&quot;_blank">http://ggplot2.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Gene Composer</td><td>PSI 技术门户</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.genecomposer.net&quot; target=&quot;_blank">http://www.genecomposer.net&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">服务：</td></tr><tr><td>西海岸代谢组学中心</td><td>加州大学戴维斯分校</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://metabolomics.ucdavis.edu/&quot; target=&quot;_blank">http://metabolomics.ucdavis.edu&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>DNA 2.0</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.dna20.com&quot; target=&quot;_blank">https://www.dna20.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

噬菌体表型组学：通过生理学方法表征新型病毒蛋白

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

目前对噬菌体-宿主相互作用的研究依赖于从（宏）基因组数据中推断信息。有趣的是，所有噬菌体序列中约有60%至95%与当前已注释的蛋白质无同源性。因此，大量噬菌体基因被注释为假想蛋白。这一现状严重影响了结构基因和辅助代谢基因的注释准确性。本文介绍了旨在捕捉特定宿主在表达某个未知噬菌体基因时所产生生理反应的表型组学方法。多表型检测板（MAPs）用于监测宿主底物利用的多样性及其后续的生物量形成，而代谢组学则通过监测代谢物的丰度与多样性来提供副产物分析。这两种工具同时使用，以获得与单个假定噬菌体开放阅读框（ORF）表达相关的表型特征。本文比较了两种方法的代表性结果，突出了携带假定结构基因或代谢基因的噬菌体宿主在表型特征上的差异。此外，还展示了支持实验分析的可视化技术以及高通量计算分析流程。

本文介绍了用于假定噬菌体基因功能表征的表型组学方法。技术包括一种可监测宿主合成代谢的改良检测方法——多表型检测平板（MAPs），以及能够测量对分解代谢影响的既定代谢组学方法。

当前对噬菌体-宿主相互作用的研究依赖于从（宏）基因组中推断出的知识。有趣的是，所有噬菌体中60 - 95%的...

以下实验的总体目标是筛选并鉴定功能未知的噬菌体基因。首先，将假定的噬菌体病毒开放阅读框（ORFs）在大肠杆菌（e coli）中表达。将表达噬菌体Orff的克隆大肠杆菌接种至多表型分析板（MAPs）中，这些分析板含有生长培养基及多种底物。随后通过分光光度法随时间监测细菌生长。作为第二种分析方法，表达噬菌体基因的大肠杆菌在连续培养或连续传代分批培养中进行培养。随后收集产生的生长代谢物，并通过气相色谱-飞行时间质谱法进行代谢组学分析。所得数据提供了与单个假定噬菌体开放阅读框表达相关的表型谱。该方法最初被开发用于阐明未知病毒蛋白的功能。它还可应用于研究基因型与表型之间的关联，以及跨不同生物群系研究噬菌体与宿主细菌之间的相互作用。开始此操作时，先用大肠杆菌克隆编号和图谱示意图类型标记无菌的96孔微孔板，其中图谱示意图类型指明了在该检测中所测试的底物。将无菌水无菌转移至液体储液槽中。然后使用多通道移液器将60微升水转移至微孔板的每个孔中。接下来，无菌条件下将三倍X基础培养基转移至液体储液槽中。然后使用多通道移液器将50微升培养基转移至微孔板的每个孔中。采用相同技术，用移液器分别吸取50微升地图示意图中使用的每种基础培养基。接着，将每种底物各30微升转移至相应的孔中。然后使用多通道移液器，将10微升细菌细胞转移至各孔中。在将移液器重新插入培养原液之前，务必更换吸头。用粘性板膜覆盖每块培养板。用力按压板膜，使其紧贴培养板的孔以及边缘，形成均匀且严密的密封。使用无菌剃刀片，从微孔板边缘去除多余的薄膜。将制备好的微孔板放入多功能分光光度计的进样槽中。打开酶标仪软件，创建一个程序，每30分钟测量一次吸光度，总计32小时。在每次读数之间震荡60秒，将仪器温度设置为37摄氏度。待map平衡至设定温度后，32小时后开始执行方案，从酶标仪的输出套筒中取出map。使用大肠杆菌的编号、日期和map示意图类型为每个数据文件命名。按照随附文档中所述方法分析数据，以评估生长情况及具有生物学意义的生长参数。根据代谢物分析结果，细胞可通过连续传代或连续批次传代方式进行培养，以维持稳态。在此，我们将演示连续培养。按照随附文档中的说明，对一个75毫升的连续培养反应器组件以及一个两升的进料瓶进行灭菌。灭菌完成后，将所有经高压灭菌的材料放入生物安全柜中，并在培养基冷却期间打开紫外灯。待培养基冷却后，加入0.1% L-阿拉伯糖和100微克/毫升的抗生素。将氨苄青霉素加入75毫升0.5 XLB肉汤中，并将其转移至连续反应器中。打开连续培养反应器盖子，将其旋紧到反应器上。避免触碰取样管，打开进料瓶盖子，将其旋紧到进料瓶上。避免触碰采样管，保持连接至 epsilon 端口的 18 英寸管路无菌。打开 18 英寸管路和蠕动泵管路的包装。将 18 英寸管路的一端连接至蠕动泵管路接头的一端，再将蠕动泵管路接头的另一端连接至 18 英寸管路。将进料瓶瓶盖上的α端口连接至连续培养反应器的ε端口，将0.22微米滤器单元安装到β端口和δ端口上。将一个0.22微米滤器单元安装到α端口的接头上，然后在生物安全柜中将18英寸导管连接至该接头。将100微升按随附文件所述方法制备的大肠杆菌过夜培养物接种至连续培养反应器中。拧紧反应器和补料瓶的瓶盖，然后将系统转移至37°C的培养箱中。使用磁力搅拌器和微型蠕动泵，将蠕动泵管路接头插入蠕动泵中。从进料瓶引出的管路接入泵中，并从泵引出至反应器。将泵设置为快速，然后启动。切换至正向检查，以确保培养基开始流经管路。将反应器置于磁力搅拌器上并开始搅拌。连续培养反应器需平衡24小时后，再于次日取样。取样连续培养物时，将一个5毫升的锁紧式注射器拧到γ端口，抽出4.5毫升培养液。取 500 微升培养物，测量 600 纳米处的光密度。然后利用剩余的等分试样制备四份 1 毫升的培养物，使 OD 600 达到 0.35，并在 1.7 毫升离心管中准备用于气相色谱-飞行时间质谱分析（GC-TOF MS）的样品。以 16,900 × g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。离心后弃去上清，随后用500微升PBS重悬沉淀并洗涤。重复此洗涤步骤一次，再次弃去上清，最后将含有细胞沉淀的微量离心管浸入液氮中。在气泡停止产生之前，将样品保存在负80摄氏度的冰箱中。在所有样品收集完毕后，每12小时重复取样一次，持续四天。每个克隆分别寄送三个样品，使用干冰运输至代谢组学核心设施，进行样品处理、分析以及GC与f ms的归一化，以获得病毒开放阅读框。从南线群岛的斯塔巴克岛和卡罗琳 AOL 珊瑚边界层以下采集海水样品。利用图谱评估了47个克隆株在72种碳源特异性条件下的细菌生长情况。随后利用所得数据将这些克隆株分类为预期生长、获得功能、丧失功能以及无生长表型。为了验证携带功能相似蛋白质的克隆株具有相似代谢组学谱的假设，通过气相色谱飞行时间质谱法（GC TOF ms）测定了在连续培养条件下生长的84个克隆株的中位代谢物丰度。随后利用所得数据，根据各克隆株相对代谢物丰度进行层次聚类，代谢物丰度以颜色表示。丰度最高的代谢物以红色表示，而丰度最低的代谢物以深蓝色表示。初步的代谢组学分析显示，尽管结构基因与代谢基因之间没有明显分离，但对宿主产生相似影响的基因之间存在相关性。例如，注释的衣壳基因与本研究中突出显示的推测代谢基因紧密聚类（EDT 24 40 和 EDT 24 41）。利用公开可用的跨膜拓扑结构和信号肽预测程序进行的分析表明，这两个推测的代谢基因均含有一个跨膜结构域。有趣的是，第一簇群中的九个克隆有五个使用相同拓扑结构预测出跨膜结构域。综合这些数据表明，该方法能够提供关于克隆代谢物谱、具有相关功能的潜在克隆以及克隆代谢物异常值的信息。在尝试该实验流程时，需注意所采用的方法在很大程度上受到细菌生理特性的影响。需要考虑确保使用无污染的独立克隆组进行实验，并利用适当的对照来检测单一变量。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

噬菌体型组学：生理途径来表征新型病毒蛋白

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。...

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

新一代无细胞转录-翻译平台已被设计用于构建生化系统 体外 通过基因回路的执行。在本文中，我们描述了如何利用全基因组合成方法，从其基因组合成噬菌体，如MS2、ΦΧ174和T7 E. coli...

合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统

本实验方案的目的是特异性标记并选择性分离感染细胞中的病毒DNA，以用于表征与病毒基因组相关的蛋白质。...

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

本文所述方案可用于构建、表征和筛选（针对特定目标）来源于任意DNA样本的“"结构域组"文库。该流程通过整合多种技术实现：噬菌体展示技术、折叠报告系统、高通量测序以及用于数据分析的网络工具。...

相互作用组测序：通过噬菌体展示与下一代测序进行结构域组文库构建、验证与筛选的实验方案

本方案能够揭示前噬菌体对其宿主的影响。通过采用最有利于溶原状态的条件同步细菌培养物，以限制其自发诱导。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可明确区分仅在前噬菌体状态下表达的基因、不受噬菌体调控的基因以及在裂解复制周期中表达的基因。...

通过转录组学研究温和噬菌体对其溶原宿主的影响

本文描述了一种基于光密度的微孔板方法，用于量化噬菌体存在下细菌的长期生长情况，适用于放线菌及其他生长缓慢的细菌。该方法包含减少蒸发和盖子冷凝的改进措施，以及用于计算病毒感染指标的R代码，包括曲线下面积、最大生长量和相对毒力。...

一种改良的基于光密度的微孔板检测法用于表征放线菌噬菌体感染

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。...

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

本文介绍了从海洋和淡水生态系统的真光层采样的方法，以分离蓝藻噬菌体（及其宿主），以及采样后富集单一基因型并表征病毒-宿主相互作用动态的过程。...

环境采样光合微生物及其病毒：从野外到实验室

Virochip 是一种泛病毒微阵列，旨在基于保守序列同源性，同时检测所有已知病毒以及新病毒。本文演示如何运行 Virochip...

使用泛病毒微阵列检测技术（Virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

了解噬菌体型组学方法，通过多表型分析板和代谢组学技术在大肠杆菌中表征未知功能的病毒基因，揭示噬菌体与宿主细菌的代谢相互作用机制。

噬菌体表型组学：通过生理学方法表征新型病毒蛋白

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