在体外和体内模型来研究细菌粘附于血管壁下流动条件

为了研究细菌在剪切应力下与血管的相互作用，描述了流动室和体内肠系膜活体显微镜模型，可以解剖导致血管粘附的细菌和宿主因素。

以下实验的总体目标是研究细菌在纯粹压力下与内皮和内皮下之间的相互作用。这是通过荧光标记细菌以实现的，第二步是使用视频显微镜实时可视化它们。体外流动室用于研究与流动细菌与细胞或基质成分粘附所涉及的不同参与者。

接下来，在体内肠系膜灌注模型中研究体外模型中鉴定的相互作用，以测试它们在复杂生物体中的相关性，结果表明，在剪切应力下，葡萄球菌能够粘附在活化的内皮细胞和内皮下皮上。与现有方法相比，该技术的主要优点是它包括体外和体内模型，这对于研究在纯粹压力下血管内感染的发病机制是互补的。这些方法可以帮助回答传染病和血管生物学领域的关键问题，例如感染性心内膜炎和转移性感染如何在生理纯粹的压力下建立，通过马林看起来是我们实验室专门从事动物工作的技术人员的程序首先准备用于追踪细菌的荧光染料。

从 150 μL 羧基荧光原液中加入 850 μL 实验室级水中并混合。将溶液避光储存在零下 20 摄氏度，直到需要为止。下一个沉淀，一种 5 毫升的 S reus 培养物。

细菌在胰蛋白酶大豆肉汤中生长过夜，用 PBS 洗涤一次，然后重悬。800 微升 PBS 中的新沉淀将 200 微升染料溶液添加到重悬细胞中用于体外灌注实验，或 400 微升染料溶液。对于体内实验，用铝箔覆盖试管以防止染料发生光漂白，并在摇床上室温孵育 30 分钟。

接下来，将 6% 牛血清白蛋白溶液的 PBS 溶液添加到混合物中，以阻断非特异性结合。使用光学细胞术检查细胞浓度，并根据其应用将细菌稀释成不同浓度的 PBS。稀释后，保护试管避光并将它们放在冰上。

在实验室级水中稀释 von Vand 因子至终浓度为 50 μg/mL。还要在等渗葡萄糖溶液中将胶原蛋白稀释至终浓度为每毫升 160 微克。然后将 200 微升每种涂层滴到一条多联体上。

将盖玻片放在液滴的顶部，使其涂上蛋白质。将盖玻片在加湿容器中在室温下孵育 4 小时。然后用钝针小心地从多联体上提起盖玻片，并将盖玻片安装在用于内皮细胞实验的流通室底部，用一毫升 1% 明胶溶液的 PBS 溶液涂覆塑料玻片，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

然后将人脐静脉内皮细胞接种在涂有明胶的塑料片上，并将它们生长到 70% 至 80% 的 co fluency。将蛋白质包被的盖玻片或内皮细胞包被的塑料玻片安装在流动室的底部。然后将入口和出口管连接到流通室的上部，并将出口管连接到废液容器。

轻轻地将流通室的上部放在底部，然后组装流通室。同时避免气泡的形成。通过腔室注入 1 毫升培养基，以确保腔室没有泄漏并去除多余的涂层溶液。

接下来，为 1 毫升注射器设置输液泵，使其以每分钟 75 微升的速度流动。在暗室中工作，在一毫升注射器中装满 1 毫升荧光标记的细菌，然后将其放入输液泵中。将注射器的出口连接到流通室的入口。

注意避免气泡，以每分钟 75 微升的速度启动输液泵 10 分钟。10 分钟后，取出第一个注射器，并将含有 PBS 或 DMEM 的 1 毫升注射器连接到进样管。开始输液，泵送并冲洗 10 分钟，以洗去任何未结合的细菌。

冲洗后，保持输液泵打开状态，并在随机位置使用 1.5 秒的曝光时间拍摄至少 15 张黑白图像，分布在流动室的涂层表面上。使用像 Image J.Subtraction the background 这样的图像分析程序从图像中删除平滑的连续背景，并定义阈值以设置阈值下限和上限值，从而将灰度图像分割成感兴趣的特征。然后测量限制为新创建阈值的面积，并保存该值，称为每个样品的荧光面积。

实验前一天晚上对 8 周龄的小鼠进行快速测试，以减少排便。实验当天首先每公斤体重注射 0.1 毫克丁丙诺啡作为镇痛药。接下来，麻醉鼠标并在眼睛上涂抹软膏。

将鼠标放在解剖镜下方的温控加热垫上，并测试鼠标是否没有花瓣反射。做一个平行于颈静脉的 1 厘米切口。切除右侧颈肌，然后将颈静脉与周围组织隔离。

将一根 2 French 静脉导管插入右颈静脉并使用缝线将其固定到位。然后做一个腹部中线切口以打开腹膜腔。将鼠标右侧放在透明板上，并用胶带固定套管。

用棉签轻轻拉出肠道并铺开肠系膜。可视化肠系膜小动脉和眼球循环。将热袋放在小鼠上以防止体温过低，并每 500 分钟将 0.9% NACL 滴入 30 微升，以防止组织脱水。

使用棉签固定血管并在倒置显微镜下观察它们。接下来，局部应用 5 微升 10 毫摩尔的碘钙 4 溶解在 DMSO 中的溶液。这将激活血管中内皮细胞的 Von Villa Brandt 因子的释放。

10 秒后，通过颈静脉导管注射 100 微升荧光标记的细菌。此时，开始拍摄延时图像，使用工具栏中的采集工具以每秒 1000 张图像的 40 个周期采集延时图像。图像采集完成后，根据机构指南对小鼠实施安乐死。

以适当的图像文件格式保存图像，然后使用图像 J 分析软件处理图像，如前所述，以强调绝对应力对细菌粘附的作用，金黄色葡萄球菌灌注以不同的剪切速率在 Von Vbr 因子涂层盖玻片上进行。随着剪切速率的增加，细菌粘附也会增加，这表明高剪切力不会抑制，而是加强细菌与蛋白质的粘附。在没有 Von Vand 因子的情况下，金黄色葡萄球菌因子与胶原蛋白的粘附随着剪切速率的增加而降低。

然而，当培养基中存在 Von Vand 因子时，细菌的粘附随着剪切速率的增加而增加，用钙 iono 4 激活以释放 Vand 因子的内皮细胞比未活化的细胞表现出显着更多的细菌粘附。此外，细菌形成了典型的荧光标记细菌簇的字符串状图案，这些细菌簇在纯粹的力量方向上对齐，表明细菌沿着线性拉伸的 VWF 分子结合以测试 Von Vbr 因子在肠系膜循环的体内内皮细胞被激活以释放 von Vbr 因子， 然后将荧光标记的细菌细胞引入血液中。细菌局部粘附在活化的血管壁上并形成聚集体。

观看此视频后，您应该更好地了解如何通过荧光标记细菌并在体外流动室和体内活体内肠系膜充血模型中可视化它们来研究与细菌和血管壁在剪切应力上的相互作用。这项技术为心血管感染领域的研究人员探索感染性心内膜炎和转移性感染中病原体与血管壁之间的相互作用铺平了道路。