Name: 在体外和体内模型来研究细菌粘附于血管壁下流动条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习使用体外流动腔和体内肠系膜灌注模型研究金黄色葡萄球菌在剪切应力下粘附血管内皮的机制。该方法结合荧光标记与实时成像技术，为心血管感染研究提供重要工具。

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本工作由佛兰德斯科学基金（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek, FWO）Vlaanderen G0466.10、11I0113N、“Eddy Merckx 研究基金”以及比利时鲁汶大学医院儿科心脏病学“Sporta 研究基金”（J.C.）资助；分子与血管生物学中心获得了鲁汶大学（KU Leuven）项目资助（PF/10/014）、鲁汶大学“重点科研行动”（GOA 2009/13）以及勃林格殷格翰公司研究基金的支持。

动物实验已获得鲁汶大学伦理委员会的批准。
1. 细菌的制备&#160;体外 灌注与 在体 内 实验
<ol>
	<li>我们使用了 S. aureus 本研究中所述所有实验均使用 Newman 菌株。 S. aureus Newman 菌株保存于含 10% 甘油的脑心浸液（BHI）培养基中，置于 -80 °C 保存。</li>
	<li>使用无菌接种环刮取冻存的细菌，接种于5 ml胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，37 °C过夜培养（OD600 &#62;3).</li>
	<li>通过离心（2,600 g，室温，5 分钟）洗涤细菌，并将菌体沉淀重悬于 5 ml PBS（磷酸盐缓冲液）中。</li>
	<li>配制 1 mg/ml 的 5(6)-羧基荧光素 N-羟基琥珀酰亚胺酯（羧基荧光素）乙醇溶液。用实验室级水将 1 mg/ml 的羧基荧光素溶液稀释至 150 µg/ml。例如， MilliQ 水）。用铝箔避光保护管材，并于 -20 °C 保存。</li>
	<li>离心细菌（2,600 × g，室温，5 min）。将菌体沉淀重悬于800 µl PBS中，然后加入200 µl（灌注实验终浓度为30 µg/ml）或400 µl（终浓度50 µg/ml） 体内 将150 µg/ml的羧基荧光素溶液进行实验。用铝箔将试管避光包裹，在室温下于摇床上孵育30分钟。</li>
	<li>标记后，用含6%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭。</li>
	<li>使用光密度法（OD）稀释细菌，一种OD600 0.65 体外 实验（对应约 3 x 108 菌落形成单位 (CFU)/ml S. aureus）和一个OD600 1.8 体内 实验（对应约 1 x 109 CFU/ml 对于 S. aureus) 加入PBS中。用铝箔包裹管子以避光，并置于冰上。</li>
</ol>
2. 体外 灌流实验
<ol>
	<li>玻璃盖玻片的包被
	<ol>
		<li>将血管性血友病因子（VWF）（Haemate P，储存浓度 2,400 µg/ml）用实验室级水（去离子蒸馏水）稀释至终浓度为 50 µg/ml。</li>
		<li>将胶原蛋白用等渗葡萄糖溶液（SKF 溶液，pH 2.7–2.9，按生产商提供）稀释至终浓度为 160 µg/ml。</li>
		<li>将200 µl包被液滴加到Parafilm上，然后将玻璃盖玻片（24 × 50 mm）置于液滴上，使液滴在盖玻片表面均匀铺展，从而实现VWF或胶原的包被。</li>
		<li>在室温下将盖玻片置于湿盒中孵育4小时。用钝头针小心地从帕拉膜上取下盖玻片。将盖玻片安装至流室的底部组件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>塑料载片的内皮细胞包被
	<ol>
		<li>用1 ml含1%明胶的PBS溶液包被塑料载片（1孔PCA细胞培养腔室，Sarstedt，德国），37°C孵育30分钟。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种于明胶包被的塑料载片上，培养至70–80%汇合度。将塑料载片安装至流室的底部组件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌流实验 
	注意：该方案的示意图概览 体外 灌注模型被表示为 图1.
	<ol>
		<li>执行 体外 在层流剪切应力为 2.5 dyne/cm 的微平行板流动腔中进行的细菌黏附研究2 和 20 dyne/cm2 以模拟不同的生理流动条件。</li>
		<li>流动室（自行设计）由金属框架和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的灌注室组成。通过连接高精度输注泵（PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA），可产生0.0001 µl/min至220.82 ml/min范围内的流速。</li>
		<li>将管路连接至流室上部，并向管路中注入培养基。轻轻将流室上部置于下部之上，组装流室。注意避免产生气泡。通过流室注入1 ml培养基，以确认流室无泄漏，并去除多余的包被溶液。避免产生气泡。</li>
		<li>将小鼠置于显微镜载物台上的温控加热垫上，温度维持在37 °C。由于该操作为终末性实验步骤，无需严格进行无菌操作。在颈静脉附近做切口，轻轻分离右侧颈肌组织，并将颈静脉从周围组织中游离出来。
		</li>
		<li>设置输液泵和荧光显微镜。输液泵的参数设置取决于注射器直径和所需的流速（见第2.4节）。此后操作均需在暗室中进行。</li>
		<li>VWF 包被：
		<ol>
			<li>用荧光标记的细菌填充注射器，并将其连接至入口管。避免产生气泡。启动输注泵，持续10分钟。输注时间取决于剪切速率以及所使用的包被材料、细菌和培养基，应能代表黏附的稳态情况。</li>
			<li>10分钟后，将装有PBS的注射器连接至入口管路，启动输注泵，以冲洗未结合的细菌。</li>
			<li>在洗涤步骤后，于不同位置至少采集15张图像或视频。细菌体积较小，可能难以聚焦。在开始之前 体外 流动实验中，可通过在盖玻片上滴加荧光标记的细菌，并将盖玻片置于流动室中来获取合适的焦平面。随后，寻找合适的焦平面并保存设置。 
			注意：在过程中 体外 流式实验中，在洗涤步骤期间（开始后约 ± 5 分钟）采集图像，可确保仅捕获黏附细菌的信号。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胶原蛋白包被：
		<ol>
			<li>在开始灌注前，向荧光标记的细菌中加入 60 µg/ml 的 VWF。用荧光标记的细菌或添加了 60 µg/ml VWF 的荧光标记细菌填充注射器，并连接至入口管。避免产生气泡。重复步骤 2.3.5.2 至 2.3.5.3</li>
		</ol>
		</li>
		<li>内皮细胞：
		<ol>
			<li>通过灌注0.1 mM的Ca溶液激活内皮细胞2+-离子载体A23187（储存液为10 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO））以0.1 mM浓度加入DMEM中，在与细菌灌注相同的剪切速率下灌注10分钟。重复步骤2.3.5.2至2.3.5.3。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下方法计算剪切速率和剪切应力。 
	剪切速率 = 6Q/wh2 
	其中：Q：流速，单位为 ml/min；w：宽度，单位为 cm；h：高度，单位为 cm 
	剪切应力（τ）= 剪切速率 × 黏度（µ） 
	其中，µ：培养基：0.01 达因·秒/厘米2 ，全血：0.04 达因×秒/厘米2 
	&#160;</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>使用倒置荧光显微镜配合黑白相机获取活体图像，并通过成像软件进行处理。曝光时间为1.5秒。在流动腔涂覆表面随机选取多个区域（至少15个）拍摄图像，保存为适当的文件格式。</li>
		<li>使用 ImageJ 进行图像分析。减去背景以去除图像中的平滑连续背景（Process – Subtract Background），并设定阈值以确定上下阈值范围，将灰度图像分割为感兴趣的特征区域。测量限定于阈值范围内的面积。</li>
		<li>以荧光面积表示的细菌黏附性比较 例如， 使用统计分析软件进行数据分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双尾Student’s t检验对组间进行比较。所有数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。将p < 0.05视为具有统计学意义。 p-值 &#60;0.05 显著水平（* p &#60;0.05; ** p &#60;0.01; *** p &#60;0.001).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体内 肠系膜灌注模型
<ol>
	<li>小鼠的制备/手术
	<ol>
		<li>实验前一晚禁食小鼠，以限制其肠道蠕动。</li>
		<li>给6-8周龄小鼠（C57Bl/6）在术前20-30分钟皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重（BW））以提供术前镇痛&#160;手术前</li>
		<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（125 mg/kg 体重）和赛拉嗪（12.5 mg/kg 体重）进行麻醉，通过足底反射检查麻醉效果，并涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
		<li>将小鼠置于显微镜载物台上的温控加热垫上，温度保持在 37 °C。由于该操作为终末性实验步骤，无需严格进行无菌操作。在颈静脉附近做切口，轻轻分离右侧颈肌组织，并将颈静脉从周围组织中游离出来。 &#160;</li>
		<li>在右侧颈静脉插入一根2 French的静脉导管，用于输注荧光标记的细菌或其他溶液。通过腹部正中切口打开腹腔，使用棉签展开肠系膜，以观察肠系膜小动脉和小静脉的血流循环。</li>
		<li>将小鼠置于透明板右侧，并用胶带固定套管。使用暖包以防止低体温。为防止组织脱水，在肠道上滴加 500 µl 0.9 % NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光显微镜观察细菌对肠系膜循环的黏附
	<ol>
		<li>在暗室中操作。使用棉签固定血管，并在倒置显微镜下进行观察。</li>
		<li>局部施加 5 µl 10 mM 的 Ca 溶液2+-离子载体A23187溶于DMSO中。10秒后，通过颈静脉导管注入100 µl标记的细菌（见步骤1）。采集延时图像。&#160;实验结束后，根据机构批准的指南对小鼠实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>使用倒置荧光显微镜获取活体图像，通过黑白相机采集，并使用任意成像软件进行处理。根据所用设备，应用自动曝光时间和对比度优化功能。</li>
		<li>使用工具栏中的“采集”工具（多维采集—时间），以每秒1,000帧的速度采集40个周期的时间序列图像。将图像保存为合适的图像文件格式。</li>
		<li>使用 ImageJ 分析软件处理图像，测量每张图像中荧光信号的面积。设定阈值以确定上下限阈值，将灰度图像分割为感兴趣的特征。识别感兴趣区域（血管），并测量限定于阈值范围和感兴趣区域内的面积。使用任意统计或绘图软件，以荧光面积表示细菌黏附情况进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Cardiovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li>
<li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%3A+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor%E2%80%93binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li>
<li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li>
<li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin%2C+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%2FFEBS%22%5BJournal%5D)">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid%2Fendothelial+cell+interaction+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li>
<li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+von+Willebrand+factor-binding+protein+%28vWbp%29+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li>
<li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li>
<li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li>
<li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

剪切应力是细菌早期黏附于血管壁以及随后形成血管内或心内膜赘生物和转移性感染的关键因素4,5。我们建立了互补的体外（in vitro）和体内（in vivo）模型，用于在生理剪切应力条件下研究血管内感染的发病机制。这些模型使我们能够鉴定出金黄色葡萄球菌（S. aureus）中主要的血管性血友病因子结合蛋白（vWbp），该蛋白可在流动条件下与暴露血管性血友病因子（VWF）的受损血管壁相互作用4。
血管内感染，尤其是感染性心内膜炎，令人关注不仅是因为其可导致脓毒症引起的器官衰竭和死亡，还因为其可引发局部和远处（“转移性”）并发症。细菌要引起感染性心内膜炎和转移性感染，必须能够黏附于血管壁，从而抵抗流动血液产生的剪切应力。目前对细菌毒力因子的大多数研究均在静态条件下进行。然而，这些已建立的相互作用可能无法承受剪切力，而在流动条件下开展的研究则可能揭示细菌与宿主相互作用中此前未被识别的新因子。
利用微型平行流室，我们及其他研究人员已证实了VWF在血管黏附中的重要性。在剪切应力作用下，VWF会逐步从其静息状态的球形结构解折叠，暴露出A1结构域，该结构域通过血小板的GPIb受体与血小板相互作用6。流室已被广泛用于研究血小板功能7。
值得注意的是，S. aureus 在流动条件下的黏附也依赖于血管性血友病因子（VWF），尤其是剪切力作用下暴露的 A1 结构域。我们发现 vWbp 介导了 VWF 的结合。vWbp 是一种凝固酶，可通过激活宿主的凝血酶原参与 S. aureus 的致病过程。由细菌凝固酶与凝血酶原形成的复合物——葡萄球菌凝血酶，可将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白8,9。我们的研究表明，vWbp 不仅能够激活凝血酶原，还能触发细菌-纤维蛋白-血小板聚集体的形成，从而在流动条件下增强细菌对血管壁的黏附4,10,11。
这 体外 流动腔模型可用于研究细菌黏附至细胞或基质组分过程中涉及的多种因素。通过使用突变菌株或表达特定表面蛋白的非致病性细菌，可研究细菌毒力因子的作用。此外，也可在流动腔的培养基中加入药理学抑制剂或阻断性抗体。宿主因素的作用，例如细胞外基质的不同组分，可通过使用不同涂层的盖玻片进行研究。盖玻片还可覆盖内皮细胞，并通过添加特定刺激物调节其活化状态。除血管壁外，还可将宿主血细胞和血浆蛋白加入流动培养基中，以研究其贡献。因此，可在标准化的层流条件下，研究从简单到复杂的多种不同情况，以揭示细菌黏附于血管壁的相互作用机制。 体内.
相互作用在 体外 模型随后在动物模型中进行研究，以验证其在复杂生物体中的相关性。其他 体内 已报道了用于研究流动条件下动态相互作用的模型，例如仓鼠背侧皮肤褶 chamber12 以及提睾肌模型13相比之下，本文所述的肠系膜灌注模型具有多项优势，包括操作简便、可改变小鼠的宿主遗传背景以及可评估药理学干预效果。
综上所述，所描述的模型不仅可用于研究S. aureus的表面蛋白，还可用于在不同宿主背景下研究多种其他微生物的表面蛋白，从而更深入地理解血管感染的发病机制。

为了建立血管内感染，病原体需要具备黏附于血管壁内皮层及心脏内表面的机制，这些部位由内皮细胞所覆盖。尽管处于快速流动血液的剪切应力环境中，病原体仍需持续存在并建立感染。最常见的引起危及生命的血管内感染和感染性心内膜炎的病原体是Staphylococcus aureus（S. aureus）1。
多种细菌表面结合的黏附分子通过与细胞外基质成分相互作用，介导细菌对宿主组织的黏附。这些被称为MSCRAMMs（识别黏附基质分子的微生物表面成分）的分子可识别纤维连接蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白以及血管性血友病因子（VWF）等分子。MSCRAMMs是金黄色葡萄球菌（S. aureus）重要的毒力因子，参与了细菌在宿主体内的定植与侵袭过程2。目前对这些毒力因子的大多数研究均在静态条件下进行，因此可能无法真实反映人类感染情况，因为在体内细菌的初始黏附发生在流动的血液环境中。
在血流感染的情况下，细菌需要克服流动血液的剪切力，才能附着于血管壁。因此，在流动条件下研究细菌与血管内皮或内皮下层相互作用的模型具有特别重要的意义。
最近一项研究表明，在剪切应力条件下，S. aureus 对血管的黏附由血管性血友病因子（VWF）介导3。VWF 是一种响应剪切应力的蛋白质，在内皮细胞被激活后由其释放。循环中的 VWF 会结合至暴露的内皮下基质中的胶原纤维。我们课题组报道，S. aureus 的血管性血友病因子结合蛋白（vWbp）对于介导剪切应力下与 VWF 的黏附至关重要4。
本文中，我们介绍了一种 体外 可评估细菌对细胞外基质不同组分或内皮细胞黏附的流动腔模型。为验证来自 体外 数据，我们已开发出一种 体内 利用实时活体血管显微技术，可视化并量化小鼠肠系膜循环中细菌与血管壁的直接相互作用以及细菌-血小板血栓形成的模型。

<table><tbody><tr><td>脑心浸液培养基（BHI）</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>荧光标记&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分（BSA）</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td> Horm 胶原蛋白</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>胶原蛋白</td></tr><tr><td>1孔PCA细胞培养腔室</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>塑料载片</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>布托啡诺</td></tr><tr><td>Anesketin（盐酸氯胺酮 115 mg/ml（100 mg/ml ketaminum））</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>氯胺酮</td></tr><tr><td>XYL-M 2%（盐酸赛拉嗪 23.32 mg/ml（20 mg/ml xylazine））</td><td>VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>赛拉嗪</td></tr><tr><td>2 法国号静脉导管（绿色）</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠（NaCl）</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+离子载体溶液 A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 号规格 1 ml 注射器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>带针头的 26 号规格 1 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak&amp;nbsp;</td><td>300015</td><td>腹腔注射</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（24×50）</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>厚度 1 号</td></tr><tr><td>PHD 2000 Infusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>高精度 Harvard 输液泵</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>倒置荧光显微镜</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>分析软件</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5.0</td><td>Graphpad Software</td><td>分析软件</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&amp;nbsp;</td><td>黑白相机</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 与 体内 模型用于研究流动条件下细菌对血管壁的黏附

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

为了引起血管内感染和感染性心内膜炎，细菌必须能够在暴露于流动血液的剪切应力下的同时黏附于血管壁。
为确定参与微生物血管黏附的细菌与宿主相关因素，需要采用能够在生理剪切力条件下研究这些相互作用的适当模型。本文描述了一种 体外 一种流动腔模型，可用于研究细菌对细胞外基质不同组分或内皮细胞的黏附，以及一种活体显微镜模型，该模型旨在直接观察细菌对内脏循环的初始黏附过程 体内这些方法可用于鉴定在流动条件下细菌黏附所必需的细菌和宿主因子。我们展示了剪切应力的重要性以及血管性血友病因子在细菌黏附中的作用 金黄色葡萄球菌 使用这两种方法 体外 和 体内 模型

金黄色葡萄球菌 对血管性血友病因子、内皮下基质和内皮细胞的黏附是一种依赖于剪切应力的现象
强调剪切应力在相互作用中的作用 S. aureus 以及VWF，我们在不同剪切速率下对VWF包被的盖玻片进行了灌注实验（该实验的示意图概览如 体外 灌注模型在 图1黏附性 S. aureus VWF 的结合随剪切速率从 250 sec⁻¹ 逐渐增加而增强-1 至 2,000 秒-1 (图2），表明高剪切力不会抑制细菌与血管性血友病因子（VWF）的黏附，反而会增强这种黏附作用。
为了研究血管性血友病因子（VWF）在细菌黏附于内皮下基质主要成分胶原蛋白中的作用，我们在有或无VWF的条件下，将荧光标记的S. aureus灌注于胶原蛋白表面。在无VWF存在时，S. aureus对胶原蛋白的黏附随剪切速率的增加而减少；然而，当培养基中存在VWF时，S. aureus的黏附则随剪切速率的增加而增强（图3）。
该 体外 流动模型还允许我们在流动条件下检测细菌与内皮细胞的黏附。我们将荧光标记的细菌灌注至HUVECs中 S. aureus 在剪切速率从 500 到 2,000 sec⁻¹ 的范围内-1在指定情况下，使用Ca激活HUVECs2+-离子载体，以诱导VWF释放。内皮细胞活化及其 subsequent VWF 释放，增加了黏附 S. aureus (图4A），形成典型的“串状”荧光标记细菌簇，沿剪切力方向排列图4B），表明细菌结合在呈线性拉伸的VWF分子上。
肠系膜静脉中细菌的初始体内黏附由血管性血友病因子（VWF）介导
由于 S. aureus 能够黏附于VWF，我们使用了野生型小鼠（Vwf+/+）以及VWF缺陷型小鼠（Vwf−/−) 以研究细菌对活化血管壁的黏附作用 体内实时视频显微镜观察内脏静脉，使得 在体 荧光标记循环物的可视化 S. aureus （实验流程示意图 体内 灌注模型被表示为 图5).
在使用Ca2+-离子载体对内皮细胞进行药理学激活后，我们观察到细菌单体及细菌聚集体迅速在野生型小鼠血管壁局部聚集（补充视频1和2）。与野生型小鼠相比，Vwf缺陷型小鼠的活化血管壁上几乎未观察到细菌黏附（补充视频3）（图6）。VWF的缺失会降低金黄色葡萄球菌（S. aureus）在活化血管壁上的黏附能力。
<img alt="用于细胞分选的微流控装置示意图；显微镜图像显示通道中的结果。" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 体外流体模型的示意图。该体外流体模型是一种多功能模型，可用于研究多种依赖剪切力的机制，例如细菌对内皮下基质的黏附以及血栓形成。微平行流室放置在带有不同蛋白涂层或内皮细胞的盖玻片（塑料或玻璃）上。可分析不同细菌（橙色和灰色点）的黏附情况，并评估血浆蛋白、血小板和全血存在时的影响。可结合使用血小板荧光标记物（蓝色椭圆）、纤维蛋白原（蓝色条状物）以及不同抑制剂（黑色椭圆），以区分细菌因素与宿主因素。图中展示了金黄色葡萄球菌（S. aureus）在有（底部）或无（顶部）血管性血友病因子（VWF）存在时，对胶原蛋白涂层的细菌黏附代表性图像（比例尺为 100 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Bacterial adhesion bar graph; adhesion vs. shear rate (250-2000 s^-1); fluorescence units." src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 黏附性 S. aureus VWF 的结合随剪切速率的增加而增强。 微平行流室灌注涂覆的VWF50 µg/ml）与荧光标记的 S. aureus 纽曼在250至2,000秒⁻¹的剪切速率下-1 秒-1) 在培养基中（n &gt;5). 所有结果均以均值 ± 标准误表示。*p &lt;0.05, **p &lt;0.01.
<img alt="Bacterial adhesion graph; fluorescence vs. shear rates; impact of VWF in bar chart." src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 黏附性 S. aureus 对内皮下层的黏附依赖于剪切力和血管性血友病因子（VWF）。 微平行流室灌注涂覆胶原蛋白160 µg/ml）与荧光标记的 S. aureus 纽曼在250至2,000 sec⁻¹的剪切速率下-1 在培养基中（n &gt;5). VWF（60 µg/ml) 在指定的培养基中存在。所有结果均表示为均值 ± 标准误。**p &lt;0.01.
<img alt="Bacterial adhesion bar graph and microscope image comparing HUVEC activation states in flow assay." src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 黏附性 S. aureus 对活化内皮细胞的黏附具有剪切力依赖性。 内皮细胞上的微平行流室灌注。A人脐静脉内皮细胞通过Ca激活2+-离子载体A23187（0.1 mM），随后用荧光标记的溶液灌注10分钟 S. aureus 纽曼在500至2,000 sec⁻¹的剪切速率下-1 在培养基中（n &gt;5). 所有结果均以均值 ± 标准误表示。*p &lt;0.05. (B) 激活的HUVECs上微平行流室灌注图像 S. aureus 在剪切速率为 1,000 sec⁻¹ 的条件下-2. S. aureus 形成长度约200微米的串状结构，提示与VWF多聚体黏附（比例尺为 100 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Pharmacokinetics, drug injection process diagram, vascular distribution, microscopy analysis result." src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 一种示意图概述 体内 肠系膜灌注模型。 通过右颈静脉插入导管（黄色线条），用于注射荧光标记的细菌（橙色点）、额外麻醉剂或其他成分，如药物抑制剂和抗体。打开腹腔，展开肠系膜，以便在荧光显微镜下观察血管（静脉和动脉）。经钙离子载体等药物激活内皮后2+-离子载体，可诱导VWF释放，随后可通过颈静脉导管注射细菌。实时血管内视频显微镜技术可实现 体内 循环荧光标记细菌的可视化及其导致的细菌-血小板血栓形成 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Bacterial adhesion bar graph; comparing Vwf+/+ and Vwf-/-; fluorescence units analysis." src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 初始黏附的 S. aureus 活化的内皮细胞 体内 由血管性血友病因子（VWF）介导。 体内 C57Bl/6小鼠门静脉肠系膜灌注模型Vwf+/+ 和 C57Bl/6-Vwf-/- 小鼠。荧光标记的 S. aureus 与局部激活的血管壁的结合显著降低 Vwf-/- 小鼠。所有结果均以均值 ± 标准误表示。***p &lt;0.001，n &gt;7.
<img alt="细胞结构的显微镜图像；电子显微照片显示了详细的膜结构组织。" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="视频图1"> 视频1：S. aureus在Vwf+/+小鼠中实时黏附于活化的血管壁。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<img alt="静力学平衡，ΣFx=0 示意图，展示力学系统分析中的力平衡。" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="视频图2"> 视频 2：S. aureus 在 Vwf+/+ 小鼠中实时聚集形成及栓塞过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">请点击此处观看该视频。</a>
<img alt="Microscope image of cellular structure; dark field microscopy used for enhanced contrast visualization." src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Video Figure 3"> 视频 3：实时黏附 S. aureus 至活化的血管壁 Vwf-/- 小鼠 在体 肠系膜灌注模型与 Vwf+/+ 和 Vwf-/- 小鼠。五只 µl 钙2+-离子载体（10 mM）被施加至可视化血管床区域。加入羧基荧光素标记的悬浮液 S. aureus 通过颈静脉导管注射。在倒置显微镜下观察肠系膜循环。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">请点击此处观看视频。</a>

为了研究细菌在剪切应力条件下与血管的相互作用，需使用流动腔室和一种 体内 描述了肠系膜活体显微镜模型，可用于解析细菌和宿主因素在血管黏附中的作用。

为了引发血管内感染和感染性心内膜炎，细菌必须能够在暴露于血流剪切力的情况下黏附于血管壁。

以下实验的总体目标是研究在剪切应力条件下细菌与内皮层及内皮下层之间的相互作用。实验通过荧光标记细菌，并利用视频显微镜实时观察细菌行为，作为第二步实现该目标。采用体外流动腔系统，用于研究流动细菌与细胞或基质成分黏附过程中所涉及的多种因素。接下来，在体外模型中鉴定出的相互作用将在体内肠系膜灌注模型中进行研究，以验证其在复杂生物体中的相关性。结果表明，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）能够在剪切应力条件下黏附于活化的内皮细胞及内皮下层。该技术相较于现有方法的主要优势在于，它同时结合了体外和体内模型，二者互补，可用于研究在剪切应力条件下血管内感染的发病机制。这些方法有助于回答感染性疾病和血管生物学领域的一些关键问题，例如，在生理剪切应力条件下，感染性心内膜炎和转移性感染是如何建立的。以下将演示一项操作流程，由本实验室专注于动物实验的技术员 Be Malin 负责展示。首先，准备用于标记细菌的荧光染料。取150微升储备的羧基荧光溶液加入850微升实验室级水中，混匀。将溶液避光保存于-20摄氏度，直至使用。接下来，离心收集5毫升S reus培养物的菌体沉淀。将细菌在胰蛋白胨大豆肉汤中过夜培养后，用 PBS 洗涤一次，然后重悬。将新形成的沉淀重悬于 800 微升 PBS 中，再向重悬的细胞中加入 200 微升染料溶液，用于体外灌注实验；或加入 400 微升染料溶液。对于体内实验，用铝箔包裹试管，以防止染料发生光漂白，并在室温下于摇床上孵育 30 分钟。接下来，向混合物中加入6%的牛血清白蛋白PBS溶液，以阻断非特异性结合。使用光学细胞计数法检测细胞浓度，并根据应用需求将细菌用PBS稀释至不同浓度。稀释后，将离心管避光并置于冰上。将冯·旺德尔因子用实验室级水稀释至终浓度为50微克/毫升。同时将胶原蛋白用等渗葡萄糖溶液稀释至终浓度为160微克/毫升。然后分别取200微升每种包被液滴加到多聚甲醛条带上。将盖玻片置于液滴上方，使其表面包被蛋白质。将盖玻片置于湿盒中，在室温下孵育4小时。然后用钝针小心地从多聚甲醛中取出盖玻片，并将其安装到用于内皮细胞实验的流动小室的底部；另取塑料盖片，加入1 mL含1%明胶的PBS溶液进行包被，在37°C下孵育30分钟。然后将人脐静脉内皮细胞接种于明胶包被的塑料载片上，培养至70%至80%融合度。将蛋白包被的盖玻片或内皮细胞包被的塑料载片安装至流室的底部。随后将进样和出样管路连接至流室上部，并将出样管路连接至废液容器。轻轻将流室的上部放在下部之上，组装流室，注意避免产生气泡。通过流室注入1毫升培养基，以确保流室无泄漏，并去除多余的包被溶液。接下来，在暗室中操作，设置输注泵以适配1毫升注射器，并使其流速为75微升每分钟。用1毫升带有荧光标记的细菌填充1毫升注射器，并将其放入输注泵中。将注射器的出口端连接至流式腔室的入口端。注意避免产生气泡，以每分钟75微升的速度启动输注泵，持续10分钟。10分钟后，取下第一个注射器，并将含有PBS或DMEM的1毫升注射器连接到进样管。启动输注泵，冲洗10分钟，以洗去所有未结合的细菌。冲洗完毕后，保持输注泵开启状态，在流动池涂层表面的不同随机位置至少采集15张黑白图像，每张图像的曝光时间为1.5秒。使用Image J等图像分析软件，减去背景以去除图像中平滑连续的背景，并设定阈值以确定上下阈值范围，从而将灰度图像分割为感兴趣的特征区域。随后，测量限定于新设定阈值范围内的面积，并记录每个样本的该数值，即荧光面积。实验前一晚对八周龄小鼠进行禁食，以减少肠道蠕动。实验当天，首先按每千克体重0.1毫克的剂量注射布托啡诺作为镇痛剂。随后，将小鼠麻醉，并在眼睛上涂抹眼膏。将小鼠置于体视显微镜下的温控加热垫上，并检测小鼠无足底反射。沿颈静脉平行方向做一厘米切口。剥离右侧颈部肌肉，随后将颈静脉从周围组织中分离出来。将一根2法式静脉导管插入右侧颈静脉，并用缝线固定。然后沿腹部正中线做切口以打开腹膜腔。将小鼠置于透明板上，使其右侧朝下，并用胶带固定导管。使用棉签轻轻拉出肠管并展开肠系膜，以观察肠系膜小动脉和小静脉的循环。在小鼠身上放置暖包以防止低体温，并每隔30分钟向肠管滴加500 µL 0.9% NaCl溶液，以防止组织脱水。使用棉签固定血管，并在倒置显微镜下进行观察。随后，在局部施加 5 µL 溶于 DMSO 的 10 mM 钙离子载体 A23187 溶液。这将激活血管内皮细胞释放血管性血友病因子（Von Willebrand factor）。10秒后，通过颈静脉导管注入100 µL荧光标记的细菌。此时开始采集延时图像，使用工具栏中的采集工具，以每秒1000帧、共40个循环的参数获取延时图像。图像采集完成后，根据机构指南实施小鼠安乐死。将图像保存为适当的图像文件格式，然后使用 ImageJ 分析软件对图像进行处理。如前所述，为强调剪切应力对细菌黏附的作用，在包被了血管性血友病因子（Von Willebrand factor）的盖玻片上以不同的剪切速率进行金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）灌注实验。随着剪切速率的增加，细菌黏附也随之增强，表明高剪切力并不会抑制，反而会增强细菌与蛋白之间的黏附。在缺乏血管性血友病因子的情况下，金黄色葡萄球菌对胶原蛋白的黏附随剪切速率的增加而减少。然而，当培养基中存在血管性血友病因子（Von Vand factor）时，随着剪切速率的增加，细菌的黏附也随之增强；经钙离子载体激活以释放血管性血友病因子的内皮细胞，其细菌黏附量显著高于未激活的细胞。此外，细菌形成了典型的串珠样结构，即荧光标记的细菌簇沿剪切力方向排列，提示细菌结合于线性拉伸的VWF分子上。为了在体内验证血管性血友病因子（Von Vbr factor）的作用，研究人员激活肠系膜循环中的内皮细胞以释放血管性血友病因子，随后将荧光标记的细菌引入血液循环。细菌在激活的血管壁局部黏附并形成聚集体。观看本视频后，您应能更好地理解如何通过荧光标记细菌，并在体外流动腔系统和活体肠系膜灌注模型中进行可视化，来研究细菌与血管壁在剪切应力作用下的相互作用。该技术为心血管感染领域的研究人员探索病原体与血管壁在感染性心内膜炎及转移性感染中的相互作用提供了重要途径。

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科研

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Immunology and Infection

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