Name: 使用非整合附加型质粒从冷冻血沉棕黄层诱导多能干细胞的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 了解如何使用非整合附加型质粒从冷冻血沉棕黄层诱导多能干细胞产生。该方法利用电穿孔转染人外周血单个核细胞，实现无病毒、低成本的细胞重编程。

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本研究由博尔扎诺自治省卫生部、教育援助、大学与研究部以及南蒂罗尔储蓄银行基金会资助。

外周血单个核细胞（PBMNCs）来自健康供体的外周血样本，采集前已获得供体签署的知情同意书，并经南蒂罗尔省伦理委员会批准。实验操作均遵循《赫尔辛基宣言》所阐述的原则进行。所有数据均以匿名方式收集和分析。
1. 外周血单个核细胞（PBMNCs）的分离
<ol>
	<li>通过全血离心后从血沉棕黄层中获取外周血单个核细胞（PBMNCs），无需密度梯度分离。
	<ol>
		<li>采集8 mL静脉外周血至含柠檬酸钠缓冲液的塑料管中，并在室温&#160;(25 °C)下保存。采血后12小时内完成处理。</li>
		<li>将试管置于水平转子离心机中，于4 °C以2,000 × g离心15分钟，并关闭离心机刹车。</li>
		<li>收集呈浑浊状的血沉棕黄层（位于上层血浆相与含有大部分红细胞的下层相之间），其中富含PBMNC组分（500 µL），转移至冻存管中。</li>
		<li>将500 µL血沉棕黄层与500 µL含90%胎牛血清（FBS）和20%二甲基亚砜（DMSO）的2倍冻存液混合，使终体积为1 mL，DMSO终浓度为10%。</li>
		<li>将冻存管置于程序降温盒中，在–80 °C条件下冷冻。长期储存时应置于液氮中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经密度梯度分离后获得的外周血单个核细胞（PBMNCs）
	<ol>
		<li>采集12 mL静脉外周血至含柠檬酸钠缓冲液的塑料管中，并在室温下保存。采血后12小时内完成处理。</li>
		<li>用无菌PBS将血液稀释至终体积35 mL。</li>
		<li>在50 mL锥形管中，小心缓慢地将35 mL&#160;稀释后的血液叠加于15 mL聚蔗糖溶液（用于密度梯度分离，密度为1.077）之上（体积比为3:1）。</li>
		<li>将试管置于水平转子离心机中，于室温下以800 × g离心30分钟，并关闭离心机刹车。</li>
		<li>吸除上层黄色血浆相并弃去。小心地将含有PBMNCs的不透明白色中间层转移至新的50 mL锥形管中。</li>
		<li>用无菌PBS补总体积至30 mL，于室温下以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用30 mL&#160;PBS重悬细胞沉淀。根据台盼蓝排斥法25计数活细胞数量。</li>
		<li>将PBMNCs于室温下以300 × g离心10分钟，吸除上清液并弃去。</li>
		<li>用适量含90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至5 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>每管分装1 mL&#160;（约含5 × 106 个细胞/mL），置于程序降温盒中于–80 °C冷冻。长期储存时应置于液氮中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 外周血单个核细胞的解冻与接种（第0天）
<ol>
	<li>通过全血离心后获得的血沉棕黄层提取PBMNCs，无需密度梯度分离。
	<ol>
		<li>若使用冻存的血沉棕黄层开始本实验方案，将1管细胞置于37 °C水浴中解冻，并用无菌PBS稀释至终体积为2 ml。</li>
		<li>将稀释后的血沉棕黄层转移至50 ml锥形管中，加入10 ml&#160;红细胞裂解缓冲液，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>配制500 ml红细胞裂解缓冲液：向500 ml超纯水中加入0.5 g碳酸氢钾、4.145 g氯化铵和100 µl 0.5 M EDTA溶液，调节pH至7.2–7.4。</li>
		<li>用无菌PBS将总体积补至50 ml，于室温下以300 x g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用50 ml无菌PBS重悬沉淀，再以300 x g离心10分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于1 ml PBMNC培养基中，该培养基组分如下22：IMDM与Ham’s F-12培养基（1:1），1%胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS-X），1%化学成分确定脂质浓缩液（CDL），1%青霉素/链霉素，0.005% L-抗坏血酸，0.5%牛血清白蛋白（BSA），1-硫代甘油（终浓度200 µM），干细胞因子SCF（100 ng/ml），白细胞介素-3 IL-3（10 ng/ml），促红细胞生成素EPO（2 U/ml），胰岛素样生长因子IGF-1（40 ng/ml），地塞米松（1 µM）和全转铁蛋白（100 µg/ml）。</li>
		<li>将细胞接种至12孔板的一个孔中，板表面为标准组织培养处理表面，无需包被，接种密度为2 x 106 个细胞/ml。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养48小时，直至更换培养基步骤（见第3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经密度梯度分离后获得的PBMNCs
	<ol>
		<li>若使用经密度梯度分离后冻存的PBMNCs开始本实验方案，将1管细胞置于37 °C水浴中解冻，转移至5 ml PBMNC培养基中，于室温下以300 x g离心10分钟。</li>
		<li>用1 ml PBMNC培养基重悬细胞，接种至12孔板的一个孔中，接种密度为2 x 106 个细胞/ml。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养48小时，直至更换培养基步骤（见第3节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 外周血单个核细胞的培养与扩增（第2-13天）
<ol>
	<li>使用带有1 ml吸头的移液器，在15 ml锥形管中收集悬浮培养的PBMNCs，于室温下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞重悬于1 ml新鲜的PBMNC培养基中。</li>
	<li>将细胞转移至12孔板中的一个孔内，该孔具有标准组织培养处理表面，无需包被，并在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育。</li>
	<li>每两天重复上述步骤，当细胞达到适当汇合度（约80%）时，按1:2比例传代。</li>
</ol>
4. 使用附加体质粒转染外周血单个核细胞（第14天）
注意：使用商品化的质粒纯化试剂盒，按照制造商说明书进行四种商业化的无整合附加体质粒的分离，这些质粒携带多能性基因；并通过琼脂糖凝胶分析评估纯化后质粒的质量。
<ol>
	<li>将PBMNCs收集到15 ml锥形管中，并计数活细胞数量（基于台盼蓝排斥法）25。</li>
	<li>以300 × g在室温下离心2 × 106个细胞，持续10分钟。</li>
	<li>将2 × 106个细胞重悬于转染混合液中，混合液包含100 µl重悬缓冲液T和每种质粒DNA各1 µg（一种质粒携带OCT3/4和针对p53的shRNA，一种质粒携带SOX2和KLF4，一种质粒携带L-MYC和LIN28，另一种质粒携带EGFP以检测转染效率）。</li>
	<li>用100 µl吸头吸取含有细胞的转染混合液，并根据制造商说明，将装有样本的移液器垂直插入电穿孔仪移液器站中盛有3 ml电穿孔缓冲液E2的试管内。</li>
	<li>使用以下程序高效进行电穿孔：1,650 V，10毫秒，3次脉冲。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞（2 × 106个）重悬于2 ml预温的PBMNC培养基中，加入0.25 mM丁酸钠（NaB），并在电穿孔程序后计数活细胞数量（基于台盼蓝排斥法）25。</li>
	<li>将细胞转移至未经包被的6孔板中的一个孔内，轻轻摇动培养板，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。</li>
	<li>电穿孔后的第二天，在荧光显微镜下随机选取8–10个视野，计数GFP阳性细胞数量，以评估转染效率。</li>
	<li>转染后的细胞在接种至MEFs前（见第6节），维持培养3天，期间不进行传代。</li>
	<li>每两天更换2 ml新鲜的PBMNC培养基，并补充0.25 mM NaB。</li>
</ol>
5. 准备用于共培养的饲养细胞培养皿（第 16 天）
<ol>
	<li>在传代电穿孔的PBMNCs到MEF饲养细胞前一天，于37 °C条件下，用1 ml基底膜基质包被6孔板的各孔，持续15分钟，并以2 × 105 个细胞/孔的密度将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种于含10% FBS的DMEM培养基（MEF培养基）2 ml中。</li>
</ol>
6. 将转染的PBMNC接种到MEF上（第17-19天）
<ol>
	<li>使用1 ml枪头的移液器将PBMNCs收集到15 ml锥形管中的悬浮培养液中，并在室温下以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于2 ml新鲜PBMNC培养基中，另加入0.25 mM NaB。</li>
	<li>将细胞接种至MEF包被的6孔板中，在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。</li>
	<li>两天后，吸除培养基，更换为2 ml iPSC培养基，该培养基由 Knockout DMEM（KO-DMEM）、20% KO-替代血清（KOSR）、1 mM NEAAs、1% 青霉素/链霉素、20 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM β-巯基乙醇、10 ng/ml FGF（基础bFGF）和0.25 mM NaB组成。</li>
	<li>每天更换2 ml新鲜iPSC培养基，并每日观察细胞状态。 
	注意：大约在第22–25天，应可见首批iPSC克隆形成。</li>
</ol>
7. 诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆的挑选与扩增（第30-35天）
注意：转染后约30-35天，iPSC集落应已准备好进行挑取和重铺。重编程效率应估算为iPSC集落数量与电穿孔总细胞数的百分比，如先前报道26。
<ol>
	<li>传代iPSC集落的前一天，在12孔板中准备MEF饲养层（每孔1.25 × 105 个细胞）。</li>
	<li>吸除MEF培养基，加入1 mL含10 ng/mL bFGF和10 µM Y-27632的iPSC培养基。在解剖显微镜下的挑取罩内，用针逐个手动解剖集落，使其形成网格状，通过移液收集较小的细胞团块，并分别转移至已包被MEF的12孔板的各个孔中。</li>
	<li>将每个12孔板以1:2的比例传代扩增至6孔板，再将每个6孔板以1:4的比例进一步扩增。前2–3次传代需手动解剖并扩增iPSC（如步骤7.2中详述），之后采用酶消化法进行传代（从步骤7.4开始）。</li>
	<li>进行酶消化时，在解剖显微镜下的挑取罩内吸除已分化的部分，对iPSC集落进行清洁。</li>
	<li>加入1 mL IV型胶原酶（1 mg/mL），在37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>吸除酶溶液，用1 mL KO-DMEM洗涤细胞，将集落收集至15 mL锥形管中，在室温下以100 × g离心2分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将集落重悬于2 mL含10 ng/mL bFGF和10 µM Y-27632的iPSC培养基中，接种至包被有MEF的6孔板（按1:4比例）。</li>
</ol>
8. 诱导多能干细胞的表征（第5至15代之间）
<ol>
	<li>碱性磷酸酶染色
	<ol>
		<li>在含10 ng/ml bFGF的iPSC培养基中培养iPSC集落3-5天。</li>
		<li>开始进行碱性磷酸酶染色实验时，用PBS洗涤iPSC一次，然后加入1 ml 4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定20分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞三次，以去除残留的PFA。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用商业化的碱性磷酸酶染色试剂盒对固定后的细胞进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光
	<ol>
		<li>在含10 ng/ml bFGF的iPSC培养基中培养iPSC集落3-5天。</li>
		<li>开始进行免疫荧光检测时，用PBS洗涤iPSC一次，然后加入1 ml 4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定20分钟。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞三次，以去除残留的PFA。</li>
		<li>将固定后的iPSC用1 ml通透/封闭液（含4%山羊血清、0.1% BSA、0.1% Triton X-100和0.05%叠氮化钠（NaN3））在室温下处理1小时。</li>
		<li>吸除封闭液，将固定细胞与一抗在含3% BSA和0.05% NaN3的溶液中于4 °C孵育过夜（参见材料表中列出的一抗种类及推荐稀释比例）。</li>
		<li>次日，用PBS洗涤iPSC三次，然后加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体和Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔抗体，按1:1,000比例稀释于含3% BSA和0.05% NaN3的溶液中，在37 °C孵育1小时。</li>
		<li>在避光条件下，用DAPI（1 µg/ml）在室温下染核10分钟，随后用PBS洗涤三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iPSC向拟胚体（EBs）分化
	<ol>
		<li>在含10 ng/ml bFGF的iPSC培养基中培养iPSC集落5-6天。</li>
		<li>在解剖显微镜下的挑取罩内，通过吸除法去除iPSC集落中的已分化部分。</li>
		<li>加入1 ml IV型胶原酶（1 mg/ml），在37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>吸除酶溶液，用1 ml KO-DMEM冲洗细胞，并将集落收集至15 ml锥形管中。在室温下以100 × g离心2分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将集落重悬于2 ml EB培养基中，该培养基成分为KO-DMEM、20%定义型胎牛血清（FBS）、1 mM NEAAs、1%青霉素/链霉素、20 mM L-谷氨酰胺和0.1 mM β-巯基乙醇。</li>
		<li>将iPSC集落接种于超低吸附6孔板中，以悬浮方式培养6天，以促进形成球形三维结构的拟胚体（EBs）。每两天更换2 ml新鲜EB培养基。</li>
		<li>第7天时，收集EBs并将其接种至0.1%明胶包被的6孔板中，每孔加入2 ml EB培养基，继续维持EBs分化培养20天。</li>
		<li>每两天更换2 ml新鲜EB培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因表达分析的qRT-PCR
	<ol>
		<li>在含10 ng/ml bFGF的iPSC培养基中培养iPSC集落5-6天。</li>
		<li>使用1 ml商业化试剂，按照制造商说明书从PBMNCs、iPSCs或EBs中提取总RNA。</li>
		<li>采用适当方法（如分光光度计）评估RNA浓度和纯度（高质量RNA的A260/A280和A260/A230比值&#62;1.8）27。</li>
		<li>根据制造商方案，使用商业化试剂盒检测RNA完整性（高质量RNA的RQI值&#62;9.5）28。</li>
		<li>使用商业化逆转录酶试剂盒，按照说明书对1 µg总RNA进行逆转录反应。</li>
		<li>配制qPCR反应体系：每反应包含5 ng cDNA模板、7.5 µl SYBR GREEN Supermix、2 µl 5 µM引物（正向1 µl，反向1 µl）和6 µl无RNase/DNase水29。</li>
		<li>进行qRT-PCR扩增程序：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒，60 °C退火与延伸45秒29。</li>
		<li>以GAPDH作为内参基因对其他基因的表达水平进行标准化处理28（参见表1中列出的引物序列）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转基因排除检测的qPCR
	<ol>
		<li>使用1 ml裂解缓冲液（含50 mM Tris、100 mM EDTA、100 mM NaCl、1%十二烷基硫酸钠（SDS）和20 µg/ml蛋白酶K）从PBMNCs或iPSCs中提取DNA。</li>
		<li>加入等体积（1 ml）100%异丙醇，颠倒混匀三次以促进DNA沉淀，在室温下以10,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用1 ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀，在室温下以10,000 × g离心5分钟。吸除并弃去上清液，将DNA沉淀重悬于无RNase/DNase水中。</li>
		<li>采用适当方法（如分光光度计）评估DNA浓度和纯度（高质量DNA的A260/A280和A260/A230比值&#62;1.8）27。</li>
		<li>配制qPCR反应体系：每反应包含5 ng DNA模板、7.5 µl SYBR GREEN Supermix、2 µl 5 µM引物（正向1 µl，反向1 µl）和6 µl无RNase/DNase水29。</li>
		<li>以FBX-15作为内参基因，对特定附加体质粒EBNA-1基因的扩增结果进行标准化分析29（参见表1中列出的引物序列）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核型分析
	<ol>
		<li>将iPSC集落接种于包被有基底膜基质的无饲养层培养板上，使用商业化的无饲养层iPSC维持培养基，按照制造商说明书培养5-6天。</li>
		<li>开始核型分析实验时，加入1 ml细胞解离溶液，在37 °C孵育5分钟，直至获得单细胞悬液。</li>
		<li>收集细胞，在室温下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>将iPSC重悬于2 ml专为产前诊断技术细胞培养设计的培养基中，接种单细胞iPSC至包被有基底膜基质的玻璃培养皿中，在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
		<li>2-4天后，直接向培养物中加入10 µl/ml秋水仙素，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续孵育3小时。</li>
		<li>吸除培养基，加入1 ml低渗溶液（0.6%柠檬酸钠和0.13%氯化钾），在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>用1 ml 5%乙酸溶液冲洗细胞，然后在控温控湿设备（28 °C，42%相对湿度）中用甲醇/乙酸（3:1）固定液固定iPSC。</li>
		<li>在避光条件下，用喹吖因溶液在室温下浸染固定细胞15-20分钟（以获得Q显带）30。</li>
		<li>在荧光显微镜下以100倍放大倍数采集细胞中期分裂相图像29。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

过去，获得携带特定基因突变的人类多能干细胞的唯一方法是招募接受胚胎植入前遗传学诊断的父母，并从他们废弃的囊胚中建立胚胎干细胞系31,32。通过重编程技术，研究人员现在可以从携带几乎任何基因型的患者中生成诱导多能干细胞（iPSCs）。从患者特异性的细胞系以及易于获取的细胞来源出发具有重要意义，因为这使得研究人员能够探究疾病的病理生理机制，并进一步发现新的治疗策略。
在本研究中，我们将一种质粒方法15与先前已用于从经密度梯度分离后冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMNCs）中产生诱导多能干细胞（iPSCs）的技术相结合22，成功地从冷冻保存的血沉棕黄层（buffy coat）来源的PBMNCs中生成了无病毒的iPSCs。使用血沉棕黄层替代经密度梯度分离的PBMNCs，可降低样本处理过程中的成本、操作时间和人工步骤。建立一种利用冷冻血沉棕黄层来源PBMNCs的低成本方案，对于参与者数量较多的研究以及多中心研究中的样本采集至关重要。更重要的是，利用冷冻血沉棕黄层制备iPSCs的能力，使得我们能够通过一种简便、经济且耗时较少的样...

2006年，山中伸弥（Shinya Yamanaka）研究团队1首次证明，通过异位表达四种重编程因子（Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-Myc），可将成年小鼠和人类的体细胞转化为多能状态，从而生成所谓的诱导性多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）2。患者特异性的iPSCs在形态、增殖能力以及分化为三胚层细胞类型（中胚层、内胚层和外胚层）的能力方面，与人类胚胎干细胞（hESCs）非常相似，同时避免了使用hESCs所涉及的伦理问题，并可绕过可能的免疫排斥反应3。因此，iPSCs被认为是基础研究、药物筛选、疾病建模、毒性评估以及再生医学等领域中最重要的患者特异性细胞来源之一4。
目前已有多种方法用于诱导多能干细胞（iPSC）的生成：病毒整合型载体（逆转录病毒5、慢病毒6）、非整合型病毒载体（腺病毒7）、仙台病毒8、BAC转座子9、附加体型载体10、蛋白质11以及RNA递送12。尽管病毒介导的方法可实现较高的重编程效率，但病毒载体可整合至宿主细胞基因组中，因此无法排除发生随机插入突变、基因表达的永久性改变，以及在分化过程中沉默的转基因被重新激活的可能性13。
为了使诱导多能干细胞（iPSCs）在再生医学中更安全，研究人员已致力于开发不将外源DNA整合到细胞基因组中的iPSC制备方法。尽管可切除的病毒载体和转座子系统已被开发出来，但切除后仍不可避免地残留在转导细胞中的短片段载体序列以及转座酶的表达是否可能引起细胞功能的改变，目前尚不明确13。尽管仙台病毒具有较高的重编程效率，但其成本较高，且该系统的开发公司所涉及的延伸许可问题可能限制其在转化研究中的应用。此外，直接导入蛋白质和RNA的方法需要多次递送重编程分子，带来固有的技术局限性，且整体重编程效率非常低14。值得注意的是，已有研究成功报道了基于附加体型质粒、无需病毒且非整合的低成本重编程方法，可用于皮肤成纤维细胞的重编程15。在本研究中，我们选择使用商品化的无整合附加体型质粒，该方法此前已有报道10,15。
迄今为止，皮肤成纤维细胞是最常用的供体细胞类型5然而，其他细胞来源也已成功重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），包括角质形成细胞16骨髓间充质干细胞17，脂肪基质细胞18，毛囊19以及牙髓细胞20分离这些细胞需要手术操作，且需要数周时间 体外 细胞扩增以建立原代细胞培养。
因此，起始细胞类型的选取至关重要，同时能够从易于获取且侵入性较小的组织（如血液）中产生诱导多能干细胞（iPSCs）也具有同等重要性。脐带血单个核细胞（CBMNCs）21,22 和外周血单个核细胞（PBMNCs）14,22-24 均是可用于诱导产生iPSCs的合适细胞来源。
尽管成人外周血单个核细胞重编程的效率比脐带血单个核细胞低20–50倍22，它们仍然是取样最方便的细胞类型。事实上，PBMNC取样具有微创优势，且这些细胞无需进行大规模扩增 体外 在重编程实验之前。迄今为止，不同的实验方案均报道，经密度梯度离心分离获得的外周血单个核细胞（PBMNCs）可在冻存后数天至数月内冻融，并在重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）前进行数天的扩增培养。22,23然而，据我们所知，目前尚无关于从冻存的血沉棕黄层（buffy coat）中重编程外周血单个核细胞（PBMNCs）的报道。重要的是，未经密度梯度离心分离而直接收集并冻存的血沉棕黄层，是大规模人群研究生物样本库中最常见的血液样本类型，因此可作为诱导多能干细胞（iPSC）制备的便捷材料来源，避免了额外的样本采集。
本文首次报道了基于先前描述的方案22，从人冻存的血沉棕黄层中生成无病毒诱导多能干细胞（iPSCs）。此外，作为非密度梯度纯化PBMNC结果的对照方案，还从经密度梯度分离后获得的冻存外周血单个核细胞（PBMNCs）中生成了iPSCs。

<table><tbody><tr><td>柠檬酸钠缓冲 Venosafe 塑料管</td><td>Terumo</td><td>VF-054SBCS07</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>0.5 M 溶液</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5442-02</td><td>用于密度梯度离心的聚蔗糖溶液</td></tr><tr><td>Iscove 改良杜尔贝科培养基 (IMDM)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>无酚红</td></tr><tr><td>Ham's F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺 (ITS-X)</td><td>Gibco</td><td>51500-056&amp;nbsp;</td><td>1X（储备液：100X）</td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td>1X（储备液：100X）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>1-巯基甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>终浓度为 200 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>重组人干细胞因子 (SCF)</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml（储备液：100 &amp;micro;g/ml）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-3 (IL-3)</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>10 ng/ml（储备液：10 &amp;micro;g/ml）</td></tr><tr><td>重组人胰岛素样生长因子 (IGF-1)</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td>40 ng/ml（储备液：40 &amp;micro;g/ml）</td></tr><tr><td>重组人促红细胞生成素 (EPO)</td><td>R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>287-TC-500</td><td>2 U/ml（储备液：50 U/ml）</td></tr><tr><td>地塞米松&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td>1 &amp;mu;M（储备液：1 mM）</td></tr><tr><td>人全转铁蛋白</td><td>R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>2914-HT</td><td>100 &amp;mu;g/ml（储备液：20 mg/ml）</td></tr><tr><td>Amniomax II</td><td>Gibco</td><td>11269016</td><td>用于细胞遗传学分析的培养基</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td>用于iPSC无饲养层培养的培养基</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Gibco</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>0.1 mM（储备液：50 mM）</td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td>0.25 mM（储备液：0.5 M）</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子，145个氨基酸&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>4114-TC</td><td>10 ng/ml（储备液：10 &amp;micro;g/ml）</td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503&amp;nbsp;</td><td>10 &amp;micro;M（储备液：10 mM）</td></tr><tr><td>胎牛定义牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH 30070.03</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% 明胶溶液</td><td>Merck-Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质（生长因子减少型）</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV 型</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>1 mg/ml（储备液：10 mg/ml）</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>L11-007</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（CF1）</td><td>Global Stem</td><td>GSC-6201G</td><td>每6孔板接种 1×10&lt;sup&gt;6 &lt;/sup&gt;个细胞</td></tr><tr><td>质粒 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>27077</td><td>1 &amp;micro;g（储备液：1 &amp;micro;g/&amp;micro;l）</td></tr><tr><td>质粒 pCXLE-hSK</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>27078</td><td>1 &amp;micro;g（储备液：1 &amp;micro;g/&amp;micro;l）</td></tr><tr><td>质粒 pCXLE-hUL</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>27080</td><td>1 &amp;micro;g（储备液：1 &amp;micro;g/&amp;micro;l）</td></tr><tr><td>质粒 pCXLE-EGFP</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>27082</td><td>1 &amp;micro;g（储备液：1 &amp;micro;g/&amp;micro;l）</td></tr><tr><td>碱性磷酸酶染色试剂盒</td><td>Stemgent</td><td>00-0009</td><td></td></tr><tr><td>抗阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4) 抗体</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4304</td><td>1/250</td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 抗体</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4360</td><td>1/250</td></tr><tr><td>抗 TRA-1-81 抗体</td><td>Merck-Millipore</td><td>MAB4381</td><td>1/250</td></tr><tr><td>抗 Oct-3/4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9081</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗 Nanog 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-33759</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗肌钙蛋白 I 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15368</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗&amp;alpha;-肌动蛋白（肌节型）抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7732</td><td>1/250</td></tr><tr><td>神经元 III 类 &amp;szlig;-微管蛋白 (TUJ1) 抗体</td><td>Covance Research Products Inc&amp;nbsp;</td><td>MMS-435P-100</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗酪氨酸羟化酶 (TH) 抗体</td><td>Calbiochem</td><td>657012</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗兔</td><td>Molecular Probes</td><td>A-21429</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>超低吸附细胞培养6孔板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Ambion</td><td>15596-018&amp;nbsp;</td><td>RNA提取试剂</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>11754050</td><td>逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>iTaq 通用 SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5124</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5195</td><td></td></tr><tr><td>Experion 自动电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7000</td><td>用于检测RNA完整性的仪器</td></tr><tr><td>Experion RNA 高灵敏度分析试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>7007105</td><td>用于检测RNA完整性的试剂盒</td></tr><tr><td>解剖显微镜（SteREO Discovery V12）</td><td>Zeiss</td><td>495007</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 100 &amp;micro;l 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10025</td><td>电穿孔用试剂盒</td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>用于电穿孔的仪器</td></tr><tr><td>NanoDrop 紫外/可见光分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>用于DNA/RNA定量的仪器</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>质粒纯化试剂盒</td></tr></tbody></table>

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

通过强制表达四种通常由人类胚胎干细胞（hESCs）表达的转录因子（Oct-4、Sox-2、Klf-4 和 c-Myc），可将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。由于iPSCs与hESCs具有相似性，已成为潜在的患者特异性再生医学的重要工具，同时避免了与hESCs相关的伦理问题。为了获得适用于临床应用的细胞，需要生成无外源基因整合的iPSCs，以避免外源基因重新激活、基因表达异常以及分化方向错误。此外，为获得足够数量用于治疗目的的iPSCs，还需一种高效且低成本的重编程方法。鉴于上述需求，高效的非整合型附加体质粒方法是获得iPSCs的首选策略。目前用于重编程的最常用细胞类型是成纤维细胞，其分离需要组织活检，对患者而言属于一种侵入性外科操作。因此，人类外周血是生成iPSCs最易获取且侵入性最小的组织来源。
本研究报道了一种经济高效且无病毒的方法，该方法使用非整合型附加体质粒，从全血经离心后获得的冷冻血沉棕黄层中提取的人外周血单个核细胞（PBMNCs）诱导生成诱导多能干细胞（iPSCs），且无需进行密度梯度分离。

本研究报道了一种简单且高效的非病毒iPSCs生成方案，通过重编程经全血离心后从冷冻血沉棕黄层中分离的外周血单个核细胞（PBMNCs），并与经密度梯度离心分离获得的PBMNCs的重编程效果进行比较。 图1A 展示了详细实验方案的示意图。解冻后，分离的外周血单个核细胞（PBMNCs）呈典型的圆形，于特定血液培养基中扩增培养14天（图1B）随后用附加体质粒进行转染。转染后10-15天，开始出现小而圆、边界清晰、呈亮泽状且具有胚胎干细胞样形态的克隆集落（图1C转染后约20-30天，iPSC集落变得高度致密，边缘清晰，体积增大，已准备进行挑取和扩增（图1D）。经过初次传代步骤（2-3次传代）后，iPSC集落能够维持其未分化状态，并呈现典型的人胚胎干细胞形态。在初期传代过程中，与酶解离法相比，手动挑选是更高效的扩增方式，可选择出完全未分化、致密且紧密排列的集落。图2A）。iPSC集落的更高倍数放大图像显示了集落内的单个细胞，细胞核与细胞质的比例较高，更易于观察图2B...

诱导性多能干细胞（iPSCs）是临床应用和基础研究中患者特异性组织的重要来源。本文详细介绍了一种利用非整合型附加体质粒将来自冻存富集白细胞层的人外周血单个核细胞（PBMNCs）重编程为无病毒iPSCs的实验方案。

体细胞可通过强制表达四种转录因子（Oct-4, Sox-2, ...）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）

本实验的总体目标是利用经济高效且无病毒的方案，从冻存的富集白膜层中分离人外周血单个核细胞，并将其重编程为诱导性多能干细胞。该过程首先通过全血离心（无需密度梯度分离）从富集白膜层中分离外周血单个核细胞（PB MNCs），随后在特定的血液培养基中进行扩增；第二步是通过电穿孔法将附加体型质粒转染至富集白膜层来源的外周血单个核细胞中。将转染后的外周血单个核细胞接种到新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。最后一步是手动挑选出培养物中诱导产生的多能干细胞，并将其转移至新的饲养层细胞培养板中进行扩增。最终，可通过免疫荧光染色和基因表达分析，证实外周血单个核细胞被高效重编程为具有典型人类形态的诱导多能干细胞。该技术相较于现有方法的主要优势在于，利用冷冻的OTs来源的无病毒IPC进行退化，可降低样本处理过程中操作人员的成本、工作时间及手工操作步骤。该技术的另一优势在于，可将大规模生物样本库中收集的人群研究来源的冷冻OTs作为IPS生产的原料。首先，采集8 mL静脉外周血至含柠檬酸钠缓冲液的塑料管中。将血液在 25 摄氏度下保存，并在 12 小时内进行处理。第一步处理是将血液在 4 摄氏度下以 2000 ×g 离心 15 分钟。使用水平转子，并在分离过程中不要启用离心机的刹车。收集呈浑浊状的白细胞层。该层位于上层血浆相与下层相之间。白细胞层为富含外周血单个核细胞（P-B-M-N-C）的组分，从每份8毫升样本中转移约500微升至冻存管中。现在，用等体积的2倍冻存液重悬复苏后的血沉棕黄层，然后将冻存管置于程序降温盒中，在-80摄氏度条件下冷冻保存，最长可保存一周。如需长期保存，细胞可转移至液氮中。从冻存的血沉棕黄层中取出1毫升冻存的外周血单个核细胞（PB MNCs），在37摄氏度水浴中快速解冻，随后用PBS稀释至2毫升。接下来，将稀释后的样品转移至50毫升离心管中，并加入10毫升红细胞裂解缓冲液。将该混合物在室温下孵育约10分钟。孵育10分钟后，用无菌PBS将总体积补至50毫升。然后在室温下以300 G离心10分钟使细胞沉淀。离心后，弃去上清液，并用50毫升PBS洗涤沉淀。再次离心细胞，然后将其重悬于1毫升PBM和C培养基中。取一份重悬的细胞样品，使用计数板测量细胞密度，然后将其调整至每毫升200万个细胞。随后建立悬浮培养体系。将细胞接种至标准12孔板的一个孔中，培养48小时。每隔一天更换一次培养基，用移液器吸取细胞并转移至15毫升锥形管中。在室温下以300 ×g离心10分钟。然后弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升新鲜的P-B-M-N-C培养基中。在PB MNC培养的最初几天，通常会出现红细胞污染。在将细胞传代至新的培养皿之前，当细胞融合度达到约80%时，需在倒置显微镜下观察细胞状态，并在传代过程中进行分瓶培养。在开始外周血单个核细胞（PB MNC）培养两周后，细胞应已准备好进行转染。准备四种质粒：一种携带T三四和针对P 53的S-H-R-N-A，一种携带SOX二和KLF四，一种携带lmic和lin 28，以及一种携带EGFP的质粒。首先，将PB MNCs收集至15毫升锥形管中，并使用台盼蓝计数活细胞数量。然后准备200万个活细胞，离心后将细胞重悬于转染混合液中，转染混合液包含100 µL重悬缓冲液T和四种质粒各1 µg。接着向转染容器中加入3 mL电转缓冲液。E2步骤：将转染混合液吸入100 µL枪头中，并垂直排入已准备好的电穿孔管中。电穿孔后，用三个脉冲处理细胞，然后将细胞重悬于2毫升预热的PBM/C培养基中，培养基中含0.25毫摩尔/升丁酸钠。随后按之前方法计数活细胞数量，并将细胞悬液转移至未包被的6孔板中的一个孔内。将该培养板置于温和振荡条件下孵育24小时。从转染当天开始，将转染后的细胞连续培养三天，期间不进行传代。在建立共培养体系的前一天，更换培养基，加入两毫升新鲜配制的含0.25毫摩尔丁酸钠的P-B-M-N-C培养基。首先制备MES第一层包被，在六孔板的每个孔中加入一毫升基底膜基质，于37摄氏度孵育15分钟。随后吸除基底膜基质，次日在每孔中加入含有10%胎牛血清的两毫升DMEM培养基，并接种200,000个MEF细胞。同时，用一毫升枪头收集PB MNCs。将它们转移至一个15毫升的锥形管中并离心。弃去上清液，将沉淀重悬于2毫升新鲜培养基中。然后将细胞接种到经甲醇包被的孔板中，并在两天后孵育培养板。更换为含有 0.25 毫摩尔丁酸钠的 2 毫升 IPSC 培养基，并每隔一天继续更换一次 IPSC 培养基。大约在 22 至 25 天后，应可见第一批 IPSC 克隆，到 30 至 35 天时克隆将更加明显。在将 IPSC 克隆板接种到含有饲养层细胞的 12 孔板的前一天，克隆应已准备好进行挑选和传代。将细胞以每孔125,000个的密度接种于孔板中，过夜培养。次日，将甲基细胞中的培养基更换为1毫升添加了补充物的iPSC培养基。随后在解剖显微镜下，使用针头逐个挑选形成小团块的较大克隆。使用移液器将它们单独转移，将一个菌落转移至甲基化包被板的每个孔中，并将该板培养以进行传代。诱导多能干细胞（iPSC）菌落最初采用相同的挑取技术，但在经过两到三次传代后，改用基于酶的处理方法。分离的外周血单个核细胞（PB MNCs）呈典型的圆形，在特定血液培养基中扩增培养14天，随后在转染后10至15天进行转染。转染约20至30天后，开始出现具有清晰边界、呈小而圆、明亮且类似胚胎干细胞形态的菌落。具有清晰边缘的高度紧凑的iPSC集落出现，并逐渐增大，直至足够大，可用于最初的几次传代操作。iPSC集落保持未分化状态，并呈现出典型的人胚胎干细胞形态。更高倍镜下可见集落内的单个细胞以及较高的核质比。选取的IPSE克隆再连续传代约10至15次。分析了来自多个独立培养物的约20个中期相细胞，以评估遗传稳定性。所有样本在体外扩增5至10次后均显示正常的核型。对这些克隆进行了干性和多能性的表征。这些克隆的碱性磷酸酶染色呈阳性。定量逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）证实，与起始的外周血单个核细胞（PB MNCs）相比，这些克隆表达内源性多能基因的水平显著更高。尽管内源性cmic和KLA四的表达水平或多或少保持不变，但在诱导性多能细胞（IPCs）中无法检测到外源性附加体型转基因的表达，这表明内源性多能性基因已成功激活。最后，免疫荧光分析显示，IPCs表达多种多能性标志物，如OC三四、SSEA四、TRA一八零一、SOX二和TRA一六零。观看本视频后，您应能充分理解如何以经济有效的方式，从人外周血分离的细胞出发，利用非整合型附加体质粒生成诱导性多能细胞（IPCs）。

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发育生物学

使用非整合附加型质粒从冷冻血沉棕黄层诱导多能干细胞的产生

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本方案描述了如何在无饲养层条件下，利用含重编程因子的基质胶和仙台病毒载体，从人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

利用仙台病毒在无饲养层条件下由人外周血T细胞生成诱导性多能干细胞

我们提出了一种将外周血单个核细胞（PBMCs）重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的实验方案。通过将转导后的血细胞接种至经基质包被的培养板中，并进行离心，可成功从悬浮细胞中诱导生成iPSCs。该技术为PBMCs和CBMCs等细胞提供了一种简单且高效的重编程方法。...

使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本方案详细介绍了针对患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导多能干细胞（iPSC）建系过程中难以按照制造商说明书进行重编程时的故障排除步骤。该方案主要适用于冻存的血沉棕黄层样本，但也可用于纯化的PBMC细胞的重编程。...

从冻存的血沉棕黄层样本重编程诱导多能干细胞系

本文介绍一种利用无饲养层细胞的慢病毒系统，从患者来源的成纤维样滑膜细胞生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用类风湿关节炎患者关节中分离的成纤维样滑膜细胞生成诱导性多能干细胞

了解如何使用非整合附加型质粒从冷冻血沉棕黄层诱导多能干细胞产生。该方法利用电穿孔转染人外周血单个核细胞，实现无病毒、低成本的细胞重编程。

利用非整合型附加体质粒从冻存的血沉棕黄层中生成诱导性多能干细胞

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