Name: 方法对敌人造成闭合性颅脑创伤性脑损伤果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 了解利用果蝇建立闭合性颅脑创伤性脑损伤模型的实验方法。该方法通过HIIT装置控制弹簧偏转角度实现精准致伤，适用于行为学、形态学和分子生物学检测，为研究创伤性脑损伤的细胞与分子机制提供高效平台。

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本研究由美国国立卫生研究院资助项目 R01 AG033620（BG）以及罗伯特·德雷珀技术创新基金（DAW）资助。

1. HIT 设备的构建&#160;
<ol>
	<li>使用两个夹子和四颗螺丝将弹簧固定在木板上（图1A）。夹子应相对于木板的宽度居中放置，并彼此紧贴，外侧夹子与木板边缘对齐。在安装夹子之前，需使用钳子将其弯曲，使其紧密贴合弹簧。 
	注意：构建HIT装置所需材料的说明见表1。&#160;弹簧被夹住的一端应距离木板边缘1/8英寸（3.2 mm），自由端应超出木板3/4英寸（19 mm）。调整弹簧位置，使其与木板的长度方向平行。</li>
	<li>将维可牢（Velcro）毛面粘胶带在弹簧的自由端缠绕一圈。维可牢的外边缘应与弹簧末端对齐。维可牢非常重要，因为它可通过形成紧密的压合连接来固定小瓶。此外，维可牢还允许快速连接和取下小瓶，从而可在短时间内处理多个小瓶。</li>
	<li>将冰桶盖倒置，居中紧贴在木板上。调整冰桶盖的凸起部分，使其长边与木板的宽度方向平行。注意，冰桶盖的凸起部分比木板高1/2英寸（13&#160;mm&#160;），因此当小瓶连接到弹簧上时，弹簧不会完全平贴在木板上。</li>
	<li>将整个装置推至墙壁等固定物体前，使冰桶盖被楔入木板与固定物体之间，确保装置不会移动。</li>
	<li>将纸质量角器用胶带固定在纸板果蝇小瓶托盘的底部，并将托盘竖立在木板长度方向的一侧，使得当弹簧向后拉至完全垂直位置时，量角器的90°刻度与弹簧对齐。</li>
</ol>
2. HIT 设备的操作
<ol>
	<li>放置1至60个CO2-将麻醉后的果蝇放入一个空的试管中，并用一个贴合紧密的棉塞塞住试管口。</li>
	<li>将棉塞推入小瓶，使果蝇被限制在小瓶底部1英寸（2.5 cm）范围内&#160;从底部开始。在离心管上标记1处的刻度线会有所帮助&#160;英寸（2.5 厘米）&#160;标记。请注意，将果蝇限制在离心管中较大或较小的区域可能会影响表型的严重程度。</li>
	<li>等待5分钟，让果蝇从CO₂麻醉中恢复活动能力2请注意，目前尚不清楚5 min是否足以完全消除CO的影响2.</li>
	<li>将弹簧末端插入小瓶，直至魔术贴内侧边缘与小瓶顶部齐平（图1B）。当弹簧平放时，1英寸（2.5厘米）&#160;小瓶的底部应与冰桶盖的凸起区域重叠。小瓶可多次重复使用。</li>
	<li>坐姿时，用左手拇指和食指捏住小瓶的魔术贴区域。用右手将板子紧压在实验台面上。或者，也可使用C型夹将板子固定在实验台面上。</li>
	<li>将弹簧完全拉直至所需角度。释放弹簧。待弹簧完全静止。</li>
	<li>从弹簧中取出小瓶，让果蝇恢复 ≥5 分钟。对果蝇进行再次撞击，或将果蝇转移至含有果蝇食物的小瓶中。 
	注意：可采用多种检测方法评估 HIT 装置击打后产生的表型效应。例如，可通过分析损伤后不同时间点果蝇的存活率来确定对寿命的影响，通过头部组织学分析来确定对脑形态的影响，通过 mRNA 水平的定量分析来确定对基因表达的影响10.</li>
	<li>通过使用未受到击打但接受相同处理的对照果蝇来确定该操作中非击打因素所造成的影响。由于试管撞击冰桶盖会产生巨大噪音，操作时应佩戴听力保护装置。</li>
</ol>

<ol><li>Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+over+four+decades+after+traumatic+brain+injury+rehabilitation%3A+A+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).</li>
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<li>Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models of traumatic brain injury.</a> Nature Rev Neurosci. 14, 128-142 (2013).</li>
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<li>Fang, Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+Drosophila+.models+of+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury.</a> Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J Vis Exp. (84), e51223(2014).</li>
<li>Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+consolidated+memory+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila.</a> Cell. 79, 35-47 (1994).</li>
<li>Andretic, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+sleep+recordings+in+Drosophila.%3A+moving+beyond+sleep+time%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time.</a> Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).</li>
</ol>

我们没有需要披露的利益冲突。

HIT装置方法与其他在果蝇中造成创伤性损伤的方法有所不同&#160;因为它导致的是闭合性头部损伤，而非穿透性创伤性脑损伤11此外，HIT装置方法在大量果蝇中诱导创伤性脑损伤（TBI）所需的时间、劳动和操作技巧较少，因此相较于其他方法更适用于大规模遗传筛选。最后，HIT装置造成的原发性损伤不仅局限于脑部，这一特点既是局限性也是优势。其局限性在于需要额外的研究来确定表型是源于脑部创伤还是其他身体部位的损伤；另一方面，多发性创伤（多个身体部位的创伤性损伤）常伴随TBI发生，并被认为可调节TBI表型，因此HIT装置方法可用于探究多发性创伤对TBI表型的贡献。果蝇TBI模型相较于啮齿类和非人灵长类TBI模型也具有优势10由于果蝇繁殖迅速（雌性每天产卵约100枚）且生命周期短（在25℃条件下从卵发育至成虫仅需10天），可对大量个体进行检测。 &#176;C），并保存在小型小瓶中，以廉价培养基（约20&#162;/月/100只果蝇）。此外，由于成年果蝇寿命相对较短（25℃下为50–100天），创伤性脑损伤（TBI）的结局可在其整个生命周期内便捷地进行评估。 &#176;C）。最后，经过一百多年对果蝇的深入研...

An author's name was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky

An author's name was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52905">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila</a>.

Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

创伤性脑损伤（TBI）是指由外部机械力导致的脑部损伤。最常见的TBI是由闭合性头部受力引起，例如钝力以及惯性加速和减速力，这些力量会导致脑组织撞击颅骨内壁。在美国，估计每年有5万人死于TBI，另有250万至650万人在遭受TBI后长期承受其后果，包括严重的身体、认知和行为障碍1,2。TBI的后果不仅源于脑部的原发性机械性损伤，还涉及随着时间推移发生的继发性细胞和分子水平的脑损伤，以及其他组织的损伤3-5。由于TBI是一种复杂的疾病过程，开发有效的诊断和治疗方法一直面临巨大挑战。原发性损伤的多样性、人体生理差异以及环境因素共同导致了继发性损伤和病理表现的高度异质性。影响这些变化的关键变量因素包括原发性损伤的严重程度、重复性原发性损伤之间的时间间隔，以及个体的年龄和基因型。深入理解每个变量因素如何影响TBI的后果，将有助于推动TBI诊断与治疗策略的发展6,7。
本文介绍一种在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤（TBI）的方法，可用于阐明各种因素对TBI后果的影响。该方法基于最初的观察：用力将果蝇培养管侧面撞击手掌时，野生型果蝇会暂时丧失活动能力，这很可能是TBI所致。因此，我们设计了高冲击创伤（HIT）装置，以重现手部撞击所产生的加速度和减速度力。高速摄像显示，HIT装置的一次撞击会导致果蝇头部和身体多次撞击培养管壁8。在一定程度上，这些撞击均可能导致果蝇脑组织在头囊内发生反弹和形变，类似于人类在跌倒或车祸中发生的脑损伤9。相应地，经HIT装置处理的果蝇表现出与脑损伤一致的表型，包括暂时性失能、随后出现共济失调、运动能力逐渐恢复、头部基因表达改变以及脑内进行性神经退行性变10。因此，HIT装置使得研究人员能够利用果蝇研究领域已建立的大量实验工具和技术来开展TBI研究。

<table><tbody><tr><td>镀锌压缩弹簧</td><td>The Hillman&amp;nbsp; Group</td><td>540189</td><td>9 7/8 英寸（长度，2.2 厘米），15/16 英寸（外径，2.4 厘米），0.12 英寸（线径，0.3 厘米）</td></tr><tr><td>木板</td><td></td><td></td><td>9 英寸（长度，22.9 厘米），6.5 英寸（宽度，16.5 厘米），0.75 英寸（高度，1.9 厘米）</td></tr><tr><td>夹具</td><td>Sigma Electrical Manufacturing Corporation</td><td>49822</td><td>3.10 英寸（长度，7.9 厘米），0.68 英寸（宽度，1.7 厘米），1.11 英寸（高度，2.8 厘米），EMT 双孔连接件，点击类型选择 1 英寸（2.5 厘米）钢制EMT导管</td></tr><tr><td>自粘魔术贴环状半片</td><td></td><td></td><td>3 英寸（长度，7.6 厘米），（3/4 英寸宽度，1.9 厘米）</td></tr><tr><td>聚氨酯冰桶套</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-45</td><td>9 1/8 英寸（长度，23.2 厘米），9 1/8 英寸（宽度，23.2 厘米），1 1/4 英寸（高度，3.2 厘米）</td></tr><tr><td>塑料果蝇小瓶</td><td>Applied Scientific</td><td>AS-510</td><td>3 11/16 英寸（高度，9.4 厘米），1 1/16 英寸（内径，2.7 厘米），1 1/8 英寸（外径，2.9 厘米）</td></tr><tr><td>大号棉球</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>纸质量角器</td><td></td><td></td><td>10 英寸（直径，25.4 厘米）</td></tr></tbody></table>

一种在drosophila中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的方法

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

每年，创伤性脑损伤（TBI）影响数百万人，导致身体、认知和行为功能障碍，并可致死。利用果蝇（Drosophila）开展的研究在理解神经系统过程方面取得了重要突破。因此，为了揭示人类TBI病理的细胞与分子基础，我们开发了高冲击创伤（HIT）装置，用于在果蝇中诱导闭合性头部TBI。经HIT装置处理的果蝇表现出与人类TBI一致的表型，例如短暂性功能丧失和进行性神经退行性变。HIT装置采用基于弹簧的机制，将果蝇弹射至离心管管壁，从而对果蝇脑组织造成机械性损伤。该装置成本低廉、易于制作，操作简便快速，且可产生可重复的结果。因此，HIT装置可与现有的果蝇实验工具和技术相结合，用于探讨TBI的基本科学问题，进而推动TBI诊断方法与治疗手段的开发。特别是，HIT装置可用于开展大规模遗传筛选，以解析TBI病理的遗传基础。

我们希望了解果蝇在遭受原发性损伤后为何会很快死亡。为了量化死亡情况，我们测定了24小时死亡指数（MI24），即在原发性损伤后24小时内死亡的果蝇所占的百分比。将经HIT装置击打后的果蝇置于含有果蝇食物的试管中，在25 °C下培养，并在24小时后统计死亡果蝇的数量。我们采用该方法鉴定影响MI24的因素，发现MI24不受每管果蝇数量（测试范围为10至60只）、重复击打之间的时间间隔（测试范围为1至60分钟）或果蝇性别的影响10。相反，我们发现原发性损伤发生时的果蝇年龄和基因型会影响MI24。老年果蝇的MI24高于年轻果蝇，不同基因型的果蝇其MI24也存在显著差异。
在 图2，我们检测了原发性损伤的严重程度是否影响心肌梗死（MI）24通过将弹簧偏转至不同角度来调节原发性损伤的严重程度。对于每个角度，使用0-7天或20-27天龄的小瓶 w1118 ...

本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）中诱导闭合性头部创伤性脑损伤（TBI）的方法。该方法可利用果蝇丰富的实验工具和技术，为研究TBI病理过程中所涉及的细胞与分子机制提供途径。

一种在Drosophila中诱导闭合性头部创伤性脑损伤的方法

创伤性脑损伤（TBI）每年影响数百万人，导致身体、认知和行为功能障碍，并可致死亡。研究……

本实验的总体目标是对果蝇造成闭合性头部创伤性脑损伤。首先将果蝇放入离试管底部一英寸处的区域。第二步是将小瓶固定到HIIT装置上。接着，将弹簧偏转至特定角度，然后释放小瓶并使其完全静止。最终，可采用多种行为学、形态学和分子生物学检测方法来表征由此造成的创伤性脑损伤后果。与现有方法（例如啮齿类动物落锤法）相比，该方法的主要优势在于可在短时间内研究大量动物。该方法有助于回答创伤性脑损伤领域中的关键问题，例如为何创伤性脑损伤的后果在不同个体间存在差异。首先，准备随附文本方案中表一列出的原材料。使用钳子弯曲夹具，使其紧密贴合在弹簧上。然后将夹具相对于板的宽度居中放置，并使它们彼此紧靠，外侧夹具与板的边缘对齐。调整弹簧位置，使其与板的长度方向平行，然后用四颗螺钉将夹具固定在弹簧上并固定到板上。接着，用一条维可牢（Velcro）粘扣带缠绕弹簧的自由端一圈，维可牢的外边缘应与弹簧末端对齐。将冰桶盖倒置，居中并紧贴木板放置。将冰桶盖的凸起部分调整方向，使长边与板的宽度方向平行。将整个装置沿固定物体（如墙壁）滑动，使冰桶盖楔入板与物体之间而固定不动。然后将纸制量角器用胶带固定在纸板果蝇小瓶托盘的底部，并将其竖直立于板的长度方向一侧，使90度刻度与弹簧对齐。当将其拉回到完全垂直的位置时，将1至60只经二氧化碳麻醉的果蝇放入一个空的试剂瓶中，并用一个紧密贴合的棉塞封住瓶口。然后在瓶底上方一英寸处画一条线，轻敲瓶壁使果蝇从瓶壁滑落到底部，再向下推压棉塞，使其底部与所画的标记线对齐。静置5分钟，使果蝇从二氧化碳麻醉中恢复活动能力。接着，将弹簧的末端插入小瓶中，直至尼龙搭扣的内侧边缘与小瓶顶部齐平。通过弹簧平放时形成的紧密压缩配合，可将小瓶固定在弹簧上。此时，应确保小瓶有1英寸的部分与冰桶盖的凸起区域重叠。请佩戴听力保护装置，因为小瓶撞击冰桶盖时会产生巨大噪音。接下来，用左手拇指和食指捏住小瓶的魔术贴区域，同时用右手将底板紧压在实验台面上。然后，将弹簧完全笔直地向后拉至所需角度，再释放弹簧。等待弹簧完全停止运动，然后将小瓶从弹簧上取下。将小瓶放置在实验台面上，让果蝇恢复至少五分钟。在此期间，果蝇将逐渐恢复正常的活动状态。接下来，将果蝇转移至含有果蝇食物的试剂瓶中以备后续分析，或对果蝇进行另一次撞击；这些试剂瓶可多次重复使用。本实验的目的是确定损伤严重程度对24小时死亡率指数的影响。创伤的严重程度由释放前弹簧从0度到90度的偏转角度来确定。实验在两种不同年龄的果蝇上进行，分别为0至7日龄果蝇和20至27日龄果蝇。结果表明，更严重的损伤会导致更高的死亡率指数。当弹簧偏转角度为50度或更高时，老年果蝇的死亡率指数高于年轻果蝇。观看本视频后，您应能充分理解如何利用果蝇构建创伤性脑损伤模型。

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