测量DNA损伤与修复小鼠脾细胞慢性后在体内暴露于β和γ辐射剂量很低

一种方案，通过测量磷酸化组蛋白 H2AX（DNA 双链断裂的标志物）来评估小鼠脾脏淋巴细胞中慢性体内低剂量照射可能诱导的 DNA 损伤水平和 DNA 修复能力的变化，使用流式细胞术

以下实验的总体目标是测量小鼠脾细胞中慢性体内暴露于低剂量 β 或 γ 辐射诱导的 DNA 损伤和修复。这是通过首先将小鼠暴露于内部 β 或外部 γ 射线照射以触发 DNA 损伤和修复的潜在变化来实现的。作为第二步，分离 PLE 细胞并用高挑战剂量的 γ 辐射照射，诱导可检测的 DNA 损伤，以监测 DNA 修复。

随着时间的推移，脾细胞随后被针对 γ H 2 A x 的荧光免疫标记，以允许量化 DNA 损伤。最终，低至 10 摄氏度的急性伽马辐射剂量产生的 DNA 损伤可以通过流式细胞术测量。这种方法可以帮助回答无线电保护领域的关键问题，例如在职业、医疗或公共环境中通常遇到的低剂量辐射是否真的会增加癌症等有害健康影响的可能性。

与现有方法（例如使用免疫荧光显微镜计数 γ H 两个 A X 病灶）相比，我们的技术的主要优点是我们的技术需要的分析时间要少得多，使其适用于大规模动物研究，并且它减少了 γ H 两个 A X 定量中的作员相关偏差。该技术的含义延伸到医学的个性化和癌症的放射治疗，并且可以使用外周血淋巴细胞来确定个体患者的放射敏感性，以调整患者的放射治疗剂量方案。虽然这种方法提供了对辐射毒性的见解，但它也可以应用于其他研究，例如调查环境化学污染物的毒性，或小鼠体内 DNA 损伤形成和修复的基本机制。

对于内部 β 照射，通过 AD libitum 使用氚水进行外部 γ 照射，将动物治疗一个月。将整个小鼠笼子放置在距伽马辐射源的适当距离处，以匹配氚暴露的剂量率。开始并保持曝光一个月。

使用热释光剂量计测量暴露结束时的总吸收剂量。在脾脏收集当天，将细胞过滤器放入每只动物的一个小空培养皿中，并向每个培养皿中加入 5 毫升 RPMI 培养基。接下来，将安乐死的小鼠置于仰卧位，并在动物完全浸泡后用 70% 乙醇喷洒毛发。

用镊子抓住尿道口前方的皮肤，从这个切口在会阴区域做一个小切口。沿腹侧中线切开到胸腔，注意只切开皮肤，不要切开下面的肌肉壁。从中线解剖皮肤。

然后用镊子抓住腹壁。沿肌肉的正中通道切开，以打开腹腔。找到脾脏并用无菌镊子轻轻夹住它。

然后轻轻拉动组织，同时擦掉结缔组织。去除大约 10 分之一的脾脏用于下游分析。然后在收获所有脾脏后，将其余组织转移到其中一个细胞过滤器中长达两个小时。

使用无菌弯曲的镊子将单个细胞过滤器中的每个组织切碎。当脾脏充分匀浆后，取下过滤器并将过滤后的细胞悬液转移到 15 毫升试管中。用另外 5 毫升培养基冲洗每个过滤器，将洗涤液与其余细胞悬液一起拉出，并将细胞离心两次 Resus，在第一次旋转后将沉淀悬浮在 10 毫升新鲜 RPMI 中。

在第二次旋转之后。将沉淀重新悬浮在 5 毫升 RPMI 中，并将 4 毫升所得细胞悬液转移到 25 毫升组织培养瓶中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳、80% 湿度下孵育。将剩余的细胞悬液转移到新的 1.5 毫升试管中，并在 4 摄氏度下离心细胞。

使用真空泵小心吸出上清液，将沉淀轻轻重悬于一毫升 TBS 缓冲液中，并在再次抽真空吐出螺旋物后再次旋转细胞。Reese 将颗粒悬浮在 300 微升 TBS 中。然后在低速涡旋的同时，以 700 微升零下 20 摄氏度的速度向每根试管中加入 100% 乙醇。

将试管倒置几次以进一步混合。然后将样品在零下 20 摄氏度下储存长达 12 个月。诱导 DNA 双链断裂以挑战修复机制。

用两种戈瑞的伽马辐射以等于或小于每分钟 200 微粒的剂量率进行辐照器无菌培养。激发后，立即将培养物放回 CO2 培养箱中。一小时后，将辐照培养物转移到生物安全柜中，并使用移液器轻轻重悬细胞。

将 1 毫升所得细胞悬液转移到冰上的 1.5 毫升试管中，然后旋转细胞。使用真空泵小心吸出旋后物，然后轻轻复苏，将颗粒悬浮在 1 毫升 TBS 中。然后在第二次 TBS 洗涤后，将细胞固定在乙醇中，就像刚刚演示的那样，在零下 20 摄氏度的温度下储存以进行细胞的免疫荧光分析。

首先，将 0.5 毫升冰冷的 TBS 添加到适当的样品管中。接下来涡旋等分试样 Eloqua，将固定的零下 20 摄氏度储存 SPL 细胞 5 秒。然后将 0.5 毫升细胞转移到适当的试管中并轻轻旋转，将沉淀重新悬浮在一毫升含有 1% FBS 的冰冷 TBS 和离心细胞中。

同样，然后将样品与每管 1 mL TST 缓冲液在冰上孵育 20 分钟。离心细胞后，再次将沉淀重悬于 200 μL 一抗 γ H 双斧抗体中。然后在孵育结束时，将试管以 45 至 60 度角在 300 倍 G 和室温下以 300 至 60 度角放置在旋转振荡器上 1.5 小时。

在一毫升含 2% FBS 的冰冷 TBS 中洗涤样品两次。然后在摇动平台上将沉淀重新悬浮在 200 μL 新鲜制备的二抗中。一小时后，在一毫升含 1% FBS 的称为 TBS 的冰中洗涤细胞，然后在一毫升称为 TBS 的冰中洗涤。

最后，将沉淀重悬于 0.5 毫升含有碘化丙啶的 TBS 中 在这些图表中，显示了具有代表性的流式细胞术结果：首先根据细胞的电子体积侧对细胞进行门控。Scatter 碘丙啶染色证实，对照和辐射激发样品均表现出正常的细胞周期分布。虽然 γ H 两个 ax 信号的测量表明，与未处理的对照相比，两个灰色照射细胞内的 DNA 双链断裂增加了两倍以上，但在离体暴露于低剂量或高剂量的 γ 辐射后一小时，小鼠细胞中的相对 γ H 两个 AX 水平如预期的那样显示。

两个格雷攻击后检测到双链断裂的强烈 3 倍诱导。暴露于 0.1 灰度后观察到略有但具有统计学意义的增加，表明该方法具有足够的灵敏度。通过显微镜观察到的标记病灶状荧光模式表明该信号来自 CH 染色质内的单个 DNA 双链断裂，验证了染色的特异性。

这里显示了从暴露于氚化水一个月的小鼠中收获的 PLE 细胞所表现出的 DNA 双链断裂水平。尽管治疗导致基础 γ H 2 A X 水平增加 10%，但变化无统计学意义。此外，测量的 γ H 两轴的形成和损失没有差异。

在代表 DNA 动力学的攻击后，在氚化水处理的小鼠和对照的细胞之间观察到双链制动修复。在尝试此程序时，请务必记住遵守当地辐射防护协会制定的规则和规定，并使用经过认证的实验室或设施，在那里可以使用内部和外部辐射源进行大规模小鼠项目。一旦掌握了这些技术，如果作得当，每 10 只小鼠只需要大约一天半的时间即可完成。

观看本视频后，您应该对如何使用流式细胞术分析 γ H 两个 A X 表达来测量暴露于低剂量氚或 γ 辐射在体内诱导的 DNA 双联链断裂和修复有很好的了解。除了该程序之外，还可以执行其他方法，如血液淋巴细胞中的 M FISH、骨髓碎核测定和用于测量应激反应基因表达的 R-T-Q-P-C-R，以评估与暴露于低剂量辐射相关的健康风险。