通过在胚胎梅克尔软骨Zebrabow克隆细胞分析软骨插层和定向扩散的可视化
October 21st, 2015
颅面骨细胞组织长期以来一直推测但从未直接显现。多光谱细胞标记和体内活 成像可以在斑马鱼下颌动态细胞行为的可视化。在这里，我们详细的协议来操作Zebrabow转基因鱼，直接观察细胞嵌入和麦克尔软骨细胞的形态变化。
以下实验的总体目标是通过斑马弓克隆细胞分析可视化软骨细胞内部整理和延伸。这是通过生成 SOX 10 ERT 两个 Cree 斑马弓 M 线来实现颅面部软骨和胚胎的组织特异性重组以进行克隆分析来实现的。接下来，在 10 岁时用他莫昔芬脉冲胚胎，因此螨虫阶段持续三个小时，以诱导重组过程。
然后选择胚胎以表达 CRE 活性和强红色荧光或 RFP 表达，并安装胚胎用于 C 颅面软骨成像。结果显示了基于共聚焦成像的颅面部软骨细胞的多光谱细胞分析。与蓝色染色中的 S 或转基因品系（如 so 和 GFP 或 SOX 和 kde）的现有方法相比，该技术的主要优势在于，斑马弓使我们能够特异性观察和跟踪参与器官形成的克隆细胞群。
为了准备第一天的胚胎收集，在第二天下午 5 点到 6：00 之间，在光学显微镜下验证胚胎已达到 10 脂肪团阶段后，在第二天下午 5 点到 6：00 之间在分开的交配池中设置几对雄性和雌性 sox、10 ERT 两只克里斑马弓 M 转基因斑马鱼在带有 RFP 过滤器的荧光显微镜下。分离出鲜红色的胚胎，并将它们转移到含有新鲜 E 3 培养基的新培养皿中，以诱导 Cree 重组。将 10 微摩尔羟基他莫昔芬溶液加入培养皿中，并在 28.5 摄氏度下孵育胚胎 3 小时。
然后将他莫昔芬溶液倒入生物废物容器中，在胚胎孵育过夜至 28 至 29 后，用 E 3 洗涤胚胎数次，于是螨虫阶段，将胚胎转移到 E three PTU 溶液中，然后放回培养箱。为了可视化完全发育的 C 颅面结构，选择具有强烈红色信号和视网膜中黄色 Cree 表达的四个 DPF 的胚胎。在 Trica 中麻醉胚胎后，根据文本方案，将其转移到干净的共聚焦载玻片上含有一滴甲基纤维素的培养皿中。
滴一滴新鲜的甲基纤维素，并使用微型加载器尖端将胚胎安装在背侧，同时注意不要用 25 x 25 的盖玻片直接接触它。盖住胚胎，必要时使用盖玻片作胚胎。要对胚胎进行成像，请使用 20 x 干透镜物镜。
要聚焦在拍摄对象上，请按下显微镜上的 L 100 按钮，然后选择共聚焦设置按钮。单击 auto，然后为通道 1 选择 CFP，为通道 2 选择 GFP，为通道 3 选择 RFP 或 M cherry。然后关闭窗口。
在单击删除联锁按钮之前打开通道 2 和 3。然后点击 play 开始扫描。调整设置后，捕获所需的图像并以共聚焦软件格式和 TIF 格式保存，以便按通道进行图像处理。
要执行 CFP 成像，请关闭通道 2 和 3，并打开通道 1，而不更改对焦区域。在捕获图像之前重新调整扫描设置，按照刚才的描述保存图像，并按照 Pan 及其同事的描述执行图像处理，如下所示。通过整个 Mount Sian 蓝染色进行的传统软骨可视化对于观察发育中的 mekel 软骨非常有价值，通常用于可视化最终细胞组织，以进一步分析随着时间的推移发育中的软骨细胞谱系追踪。
使用 SOX 10 kda 转基因品系已用于使用斑马弓 m 转基因品系的实时成像研究活胚胎中的细胞迁移、收敛和延伸。为了进一步研究 C 颅面骨骼结构中软骨细胞的组织，揭示了介导 Meckel 软骨延伸和生长的软骨细胞相互排列和伸长的过程。该图显示了 UI 斑马弓 M Sox 10 ERT 的两个 Cree 转基因胚胎在 3D PF 和受精后 5 天之间的下颌。
下颌最好在腹侧拍摄，以便清楚地看到 meles 软骨中的细胞组织，如图所示。稳定维护和遗传的颜色便于谱系追踪和颅神经嵴细胞命运图谱。单个蓝色细胞似乎迁移并与其相邻细胞插值，然后沿前后轴伸长以形成形状均匀的软骨部位，从而在向前延伸时保持 meles 软骨的整体形状。
这项技术为猫发育领域的研究人员研究斑马鱼骨骼形成中的软骨铺平了一条道路。
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概述
本研究提出了一种使用Zebrabow转基因鱼进行斑马鱼颅面部软骨细胞间插入和延伸可视化的协议。该技术允许直接观察器官形成过程中的动态细胞行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞生物学
背景
- 颅面部骨骼组织已被假设但未直接可视化。
- 软骨细胞在软骨发育中起着关键作用。
- 现有的研究细胞行为的方法有局限性。
- Zebrabow技术允许对细胞群体进行克隆分析。
研究目的
- 可视化软骨细胞的间插和形态变化。
- 展示Zebrabow相对于传统方法的优势。
- 为该领域的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 生成SOX 10 ERT2 Cre Zebrabow M系用于组织特异性重组。
- 用他莫昔芬脉冲胚胎以诱导重组。
- 基于CRE活性和RFP表达选择胚胎。
- 共聚焦成像用于颅面部软骨细胞的多光谱分析。
主要结果
- 成功可视化软骨细胞的间插和延伸。
- 展示器官形成中涉及的克隆细胞群体。
- Zebrabow技术与现有方法的比较。
- 颅面部软骨中动态细胞行为的见解。
结论
- Zebrabow技术为研究颅面部发育提供了强大的工具。
- 该方法增强了对软骨细胞动态的理解。
- 未来应用可能扩展到发育生物学的其他领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte intercalation mechanisms that drive Meckel’s cartilage extension.
- Scientific Value: Supports functional validation of clonal contributions to craniofacial skeletal patterning.
- Scientific Value: Provides direct observation of cellular behaviors underlying hypoplastic mandible phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates multispectral clonal readouts for quantitative assessment of chondrocyte dynamics.
- Operational Value: Establishes a reproducible lineage-tracing platform for live imaging of cartilage morphogenesis.
- Operational Value: Enables standardized clonal analysis across developmental timepoints for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links clonal chondrocyte behavior to mandibular outgrowth, informing disease-relevant system relevance.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular basis of mandibular hypoplasia.
- Translational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of craniofacial growth pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chondrocyte-driven tissue extension mechanisms in craniofacial development.
- Screening: Delivers quantitative, multispectral clonal outputs enabling reproducible assessment of chondrocyte organization.
- Analytics: Provides clonal lineage tracing and morphological metrics that allow comparison of cellular behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects clonal chondrocyte dynamics to mandibular morphogenesis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clonal imaging platform applicable to multiple organogenesis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of chondrocyte intercalation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via inherited fluorescent clonal labeling.
- Strategic Value: Reduced biological risk in craniofacial therapeutic development via mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets affecting mandibular growth and patterning.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling and clonal lineage tracing.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure for multispectral imaging.
- Necessitates standardized tamoxifen induction protocols for consistent recombination.
- Involves adaptation considerations for applying clonal analysis to other skeletal or tissue systems.
- Limited by the need for precise embryonic staging and fluorescent selection for clonal induction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
