Name: 通过在胚胎梅克尔软骨Zebrabow克隆细胞分析软骨插层和定向扩散的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 了解利用Zebrabow转基因斑马鱼可视化软骨细胞插层和定向扩散的方法。该技术通过他莫昔芬诱导重组和共聚焦成像，实现颅面软骨克隆细胞群体的多光谱分析，为发育生物学研究提供直接观察细胞动态行为的强大工具。

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作者感谢 Alex Schier 慷慨分享 Zebrabow-M 转基因品系，Geoffrey Burns 提供 pDEST 载体，以及 Renee Ethier 对斑马鱼养殖设施及品系的出色管理。
资金支持：
我们感谢美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR RO3DE024490）和谢林医院儿童医院（E.C.L.）提供的慷慨资助，以及谢林医院儿童医院提供的博士后培训奖学金（L.R. 和 Y.K.）。

所有实验程序均经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号为 #2010N000106，符合国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）指南的要求。
1. 试剂与材料准备
<ol>
	<li>配制 1 L 的 50X E3 胚胎培养基（见表 1），并配制 1 L 的 1X E3 胚胎培养基（见表 2）。</li>
	<li>通过将 30 mg PTU（N-苯基硫脲）加入 1 L 的 1X E3 培养基中来制备含 N-苯基硫脲（PTU）的 E3 胚胎培养基。搅拌过夜以确保 PTU 完全溶解。室温保存。</li>
	<li>配制蛋白酶溶液：将 150 µl&#160;蛋白酶（0.5 mg/ml）用 15 ml&#160;1X E3 稀释。此量足以用于一个培养皿。现配现用。</li>
	<li>配制甲基纤维素溶液。
	<ol>
		<li>通过将 75 ml&#160;0.2% 三卡因溶液与 25 ml&#160;1X E3 混合，制备 E3-三卡因溶液。将 3 g 甲基纤维素在 75 ml&#160;E3-三卡因溶液中煮沸。</li>
		<li>用 E3-三卡因溶液定容至 100 ml&#160;。最终的甲基纤维素溶液呈黏稠、不透明、微黄色。储存条件：室温避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>他莫昔芬储备液与诱导溶液的配制
	<ol>
		<li>将 4-羟基他莫昔芬溶于 100% 乙醇中，配制 5 mM 的他莫昔芬储备液。储备液保存于 -80 °C。</li>
		<li>使用前将他莫昔芬用 1X E3 新鲜稀释至所需浓度，以获得诱导溶液。注意！使用前请查阅材料安全数据表（MSDS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据表 3配制 1 L 的 0.2% 三卡因溶液。</li>
	<li>准备共聚焦显微镜载玻片。将四片盖玻片（18 × 18）粘合在一起形成一个方块，然后将两个这样的方块放置在 24 × 60 的盖玻片上，间距 2 cm，以便将胚胎固定在中间位置。</li>
</ol>
2. 胚胎制备
<ol>
	<li>转基因品系。 
	注：Zebrabow-M 由 Alex Schier 实验室慷慨惠赠。</li>
	<li>sox10: ERT2-Cre 
	注：使用标准分子克隆方法及商业化获得的重组克隆技术，构建靶向载体 pDestTol2-sox10:ERT2-Cre。
	<ol>
		<li>在 LR 反应中，将包含 7.2 Kb sox10 启动子的 5’ 入门克隆（pENTR5’-sox10p）、Gateway 中间克隆（pME-ERT2-Cre）和 3’ 入门克隆（pENTR3’-polyA）与晶状体目的载体 pDestTol2-α-crystallin:YFP 进行重组。</li>
		<li>纯化构建体 pDestTol2-sox10:ERT2-Cre。在单细胞期，将纯化的构建体（100 ng/µl）与 Tol2 转座酶 mRNA（50 ng/µl）共注射至野生型胚胎（F0）中。</li>
		<li>通过 F1 代胚胎中强烈的黄色荧光筛选具有生殖系传递能力的 F0 成年 founder 鱼。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sox10: ERT2-Cre;Zebrabow-M
	<ol>
		<li>将 Zebrabow-M 品系（2.1.1）与 sox10:ERT2-Cre 转基因品系进行杂交。</li>
		<li>挑选表现出强烈且广泛性 RFP 表达以及 YFP 晶状体标记的胚胎，并将其培育至成年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胚胎收集
<ol>
	<li>在第1天下午5点至6点之间，设置多对sox10:ERT2-Cre;Zebrabow-M转基因斑马鱼进行交配。</li>
	<li>次日早晨移除隔离板，并于中午左右收集受精卵。</li>
	<li>将受精卵转移至培养皿中，并加入15 ml&#160;蛋白酶溶液以去除卵膜。</li>
	<li>孵育胚胎1至5分钟&#160;，直至约60%的胚胎完成去膜。通过倾倒去除蛋白酶溶液以终止反应，并用新鲜E3培养基清洗胚胎3–4次。</li>
	<li>将去膜后的胚胎在室温下于E3培养基中过夜孵育，使其发育至10体节阶段。每窝孵育50–60枚胚胎，以避免发育速度差异。</li>
</ol>
4. 治疗
<ol>
	<li>在明场显微镜下检查胚胎的发育阶段，确保其处于10个体节阶段。</li>
	<li>使用配备红色荧光蛋白（RFP）滤光片的荧光显微镜，挑选出红色荧光强烈的胚胎。</li>
	<li>向培养皿中加入10 µM羟基他莫昔芬溶液，诱导Cre重组酶活性，并将分离的胚胎在28.5 °C条件下孵育3小时。</li>
	<li>倾去他莫昔芬溶液，并用E3溶液多次清洗胚胎。 
	警告！他莫昔芬溶液必须弃置于专用的生物废弃物容器中。</li>
	<li>将胚胎在28.5 °C条件下过夜孵育。</li>
	<li>当胚胎发育至约28–29个体节阶段（受精后约24小时），此后将胚胎在E3-PTU溶液中于28.5 °C继续孵育。 
	注：此处使用PTU是为了抑制胚胎发育过程中黑色素细胞的形成。该处理对于避免自体荧光黑色素细胞对荧光信号造成干扰是必要的。</li>
	<li>将胚胎在28.5 °C条件下孵育</li>
</ol>
5. 胚胎筛选
<ol>
	<li>为了观察完全发育的颅面结构，选择受精后4天的胚胎，根据红色信号强度和视网膜中Cre表达标记阳性（黄色）进行筛选。</li>
	<li>用E3/0.015%三卡因溶液麻醉胚胎。轻轻触碰胚胎时，若未观察到主动运动或鳍部活动，则表明麻醉成功。</li>
</ol>
6. 在甲基纤维素中固定胚胎
<ol>
	<li>将选定的用于成像的胚胎转移至含有甲基纤维素液滴的培养皿中，并用甲基纤维素轻轻包埋胚胎。</li>
	<li>在洁净的共聚焦载玻片上滴加一滴新鲜甲基纤维素，使用微加载吸头将胚胎置于液滴中。将胚胎背侧朝上放置，注意避免直接接触胚胎。</li>
	<li>用25 × 25盖玻片覆盖已固定的胚胎，如有必要，可通过移动盖玻片来调整胚胎位置。</li>
	<li>胚胎现已准备好进行成像。</li>
</ol>
7. 荧光显微镜分析
<ol>
	<li>使用20倍干镜物镜（数值孔径0.75；针孔大小2.0 µm）对胚胎进行聚焦。</li>
	<li>按下显微镜上的L100按钮，并在软件中选择通道。</li>
	<li>选择共聚焦设置按钮，点击“自动”，然后在关闭窗口前选择以下通道：Ch1：CFP，Ch2：GFP，Ch3：RFP或mCherry。</li>
	<li>在点击“解除联锁”按钮之前，先打开Ch2和Ch3通道。点击“播放”开始扫描。</li>
	<li>对目标结构进行聚焦时，建议先以每秒½帧和高电压（HV）150开始，然后根据需要调整参数，直至获得理想的图像质量。RFP信号通常比其他颜色更亮，因此需相应调整HV值。改变Z轴位置以找到YFP和RFP双阳性细胞。</li>
	<li>参数设定完成后，采集胚胎图像。将图像以共聚焦成像软件格式和TIFF格式保存，用于各分通道的图像处理。</li>
	<li>接下来进行CFP成像时，关闭Ch2和Ch3通道，打开Ch1通道。在不改变聚焦区域的前提下，参照步骤5重新调整参数。 
	注意：由于蓝色通道存在背景信号，CFP检测可能较为困难，可通过调整针孔大小来克服。较大的针孔尺寸有助于降低信号/背景噪声比，从而提高荧光检测效率。然而，较大的针孔会减弱共聚焦效果，影响图像质量。因此，必须仔细调整参数，以获得理想的图像质量和信号强度。</li>
	<li>采集图像后，以两种格式（共聚焦软件格式和TIFF格式）保存，用于后续图像处理。随后可使用常见的图像处理软件对图像进行图层合并及色彩设置优化，具体方法可参考Pan及其同事的描述8。</li>
</ol>

<ol><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li>
<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10%3A+kaede+zebrafish+transgenic+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+craniofacial+surgery%22%5BJournal%5D)">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li>
<li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10%3A+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).</li>
<li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research%5BTitle%5D)+AND+%22Part+C%2C+Embryo+today+%3A+reviews%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li>
<li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+education+and+CPD%3A+are+you+being+served%5BTitle%5D)+AND+%22British+dental+journal%22%5BJournal%5D)">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li>
<li>Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li>
<li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726(2014).</li>
<li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia%3A+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Teratology%22%5BJournal%5D)">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li>
<li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

如上所述，阿利新蓝染色与光转换转基因品系相互补充，可明确定义软骨和骨骼发育的复杂过程。然而，器官发生过程中活细胞的迁移与排列长期以来仅被假说推测并间接证实，从未实现直接可视化。通过将Zebrabow-M转基因品系与软骨特异性Cre工具联用，可同时实时观察骨骼和软骨形成过程中所有这些不同的生物学事件。该技术使得在诸如小颌畸形为显著特征之一的罗宾序列征等条件下，能够在细胞和器官水平上研究下颌生长缺陷。在软骨细胞生长过程中，细胞增殖、延伸或嵌入过程的任何失败均可被有效可视化。
颜色多样性优化
通过滴定4-羟基他莫昔芬的浓度来优化Cre表达水平，可在不导致胚胎致死的情况下控制重组程度和颜色多样性。雌激素对正常视网膜发育至关重要，因此较高剂量的他莫昔芬（&#62;25µM）可引起视网膜退化、高死亡率（约60%至80%）、颅面畸形及发育迟缓。此外，4-羟基他莫昔芬以乙醇稀释，而乙醇本身在胚胎发育过程中具有毒性13。因此，确定最佳浓度和暴露时间以获得良好的重组效率同时限制胚胎毒性至关重要。
<p class="...

颅面发育需要复杂的分子、细胞和组织相互作用，以驱动细胞增殖、迁移和分化1,2,3。这一受到严密调控的复杂过程易受遗传和环境因素的干扰，导致颅面畸形成为最常见的出生缺陷之一1-9。尽管目前颅面异常的主要治疗手段仍是外科手术，但深入了解其发育基础对于创新未来疗法至关重要。因此，研究形态发生过程中细胞汇聚与延伸以及细胞整合的机制，可为颅面骨骼的形成提供新的见解1。
颅神经嵴细胞迁移并定植于第一咽弓，随后形成成对的下颌突，延伸并发育为迈克尔软骨（Meckel’s cartilage），该结构预先构建了下颌骨的基本形态。迈克尔软骨的形态发生依赖于软骨细胞通过定向增殖、细胞极化和分化所实现的有序排列1,10。然而，软骨细胞在迈克尔软骨生长与延伸过程中如何精确组织的机制&#160;仍不明确。深入理解细胞动态行为&#160;对于认识影响下颌骨大小的先天性畸形（如下颌骨发育不全表型）至关重要11。
斑马鱼胚胎在详细研究麦克尔软骨形态发生方面具有诸多发育和遗传优势。其遗传可操作性强、胚胎透明， 离体 快速发育是其显著优势，使其非常适用于通过活体成像观察细胞运动与组织过程6使用谱系追踪工具，例如 sox10kaede 转基因系中，我们及其他研究者已阐明胚胎颅面骨骼的神经嵴起源1,5. 使用 sox10ERT2-Cre 与 ubi:Zebrabow-M 转基因品系使得探索颅面发育过程中细胞运动的细节成为可能。Zebrabow-M 是一种转基因品系，通过泛素启动子驱动多种荧光蛋白的表达，每种荧光蛋白两侧均带有 Lox 位点8斑马鱼Zebrabow-M系统的默认荧光蛋白为红色（RFP）。在诱导Cre表达后，Zebrabow-M构建体会发生重组，细胞将表达多种荧光蛋白（RFP、CFP和YFP）的组合，从而在胚胎中产生多光谱荧光标记。重组事件发生后，所有由标记细胞分裂产生的子代细胞均被克隆性地标记，使得源自相邻不同前体细胞的细胞群体均可被克隆性识别。通过此种克隆细胞标记方法，可实现对细胞增殖与迁移过程的克隆分辨率追踪。图1和图2).

<table><tbody><tr><td>蛋白酶</td><td>Roche Life Sciences</td><td>10165921001</td><td>配制 500 &amp;mu;l 储存液，浓度为 50 mg/ml</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0262</td><td></td></tr><tr><td>PTU（N-苯基硫脲）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7619</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T176</td><td></td></tr><tr><td>24 × 60 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>18 × 18 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>25 × 25 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540C</td><td></td></tr><tr><td>pENTR5'-TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Life technologies&amp;nbsp;</td><td>K591-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>pENTR3'-pA</td><td>Tol2Kit</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>pDEST</td><td></td><td></td><td>由 Geoffrey Burns 实验室惠赠</td></tr><tr><td>明场显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

脊椎动物颅面结构的发育需要细胞迁移、增殖、黏附和分化的精确协调。作为第一咽弓的衍生物，梅克尔软骨的模式形成涉及颅神经嵴（CNC）细胞的迁移以及分化软骨细胞的逐步分区、增殖和有序排列。已有多个研究描述了下颌发育过程中颅神经嵴细胞的迁移&#160;形态发生，但软骨细胞在梅克尔软骨生长与延伸过程中实现有序排列的具体机制仍不明确。 sox10 受限且由化学诱导的Cre重组酶介导的重组可产生不同荧光蛋白（RFP、YFP和CFP）的组合表达，从而实现对前体细胞及其子代的多光谱标记，反映不同的克隆群体。通过共聚焦时间推移成像，可观察斑马鱼麦氏软骨发育过程中软骨细胞的行为。
多光谱细胞标记技术使科学家能够展示麦克尔软骨细胞的延伸过程。&#160;在麦克尔软骨（下颌骨的前体结构）的延伸阶段，软骨细胞通过有序地堆叠成单层细胞列，进行嵌入式排列以实现结构延伸。这一有序嵌入过程若未能正常介导细胞延伸，将导致下颌发育不全，这正是我们在下颌畸形中所观察到的细胞机制解释。

通过整体 alcian blue 染色对软骨进行传统可视化，对于观察 Meckel 软骨的发育过程具有重要价值，并常用于显示最终的细胞排列结构12（图 1A）。为了进一步分析软骨细胞在发育过程中的动态变化，利用 sox10:Kaede 转基因品系进行谱系示踪，使我们能够在活体胚胎中研究细胞迁移、汇聚与延伸过程2,12（图 1B）。然而，颅面骨骼结构中软骨细胞的组织方式仍不清楚。通过活体成像，Zebrabow-M 转基因品系能够揭示介导 Meckel 软骨延伸与生长的软骨细胞嵌合与拉长过程（图 1C-G）。
在本实验方案中，ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre 胚胎在体节发育至10对时用他莫昔芬处理，并在发育过程中不同时间点（从3 dpf到5 dpf）观察下颌软骨细胞。为清晰显示Meckel软骨，避免额筛板和背侧神经颅的干扰，以下颌腹面观为最佳视角。稳定维持并遗传的...

颅面骨细胞的组织结构长期以来一直被假设，但从未被直接观察到。多光谱细胞标记和 体内 活体 成像技术可实现对斑马鱼下颌动态细胞行为的可视化观察。本文详细描述了操作Zebrabow转基因斑马鱼的实验方案，以直接观察Meckel软骨中软骨细胞的细胞嵌合行为及形态学变化。

通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

脊椎动物颅面结构的发育需要细胞迁移、增殖、黏附和分化的精确协调。

以下实验的总体目标是通过斑马鱼克隆细胞分析，观察软骨细胞间的相互关联与延伸。该目标通过构建 SOX10-ERT2-Cre 斑马鱼 M 系来实现，从而在颅面软骨组织及胚胎中实现组织特异性的重组，用于克隆分析。随后，在10体节阶段，将胚胎用他莫昔芬脉冲处理三小时，以诱导重组过程的发生。然后根据CRE活性以及强红色荧光或RFP表达情况筛选胚胎，并将胚胎固定以进行头面部软骨的成像。结果显示了基于共聚焦成像的头面部软骨细胞的多光谱细胞分析。该技术相较于现有方法（如S蓝染色或so与GFP、SOX与kde等转基因品系）的主要优势在于，斑马鱼bow系统使我们能够特异性地观察和追踪参与器官形成的克隆细胞群体。为了在第一天进行胚胎收集，需在下午5至6点之间，将多对雄性和雌性 sox10:ERT2-Cre zebrafish 转基因斑马鱼配对，放入分隔的交配缸中。次日，在体视荧光显微镜下使用RFP滤光片确认胚胎已发育至10细胞期后，分离出呈亮红色的胚胎，并将其转移至新的培养皿中，加入新鲜的E3培养基以诱导Cre重组。向培养皿中加入10 µM羟基他莫昔芬溶液，于28.5°C条件下孵育胚胎3小时。然后将他莫昔芬溶液倒入生物废弃物容器中，并使用 E3 溶液在胚胎于 28–29°C 孵育过夜至螨状期后，多次冲洗胚胎，再将胚胎转移至含 PTU 的 E3 溶液中，并放回培养箱。为观察完全发育的颅面结构，选择在 4 天后（DPF）视网膜中具有强烈红色信号和黄色 Cree 表达的胚胎。根据文本方案，用 Trica 麻醉一个胚胎后，将其转移至含有少量甲基纤维素液滴的洁净共聚焦载玻片上的培养皿中。取一滴新鲜的甲基纤维素，使用移液器吸头将胚胎背侧朝上固定，注意避免用25 mm × 25 mm的盖玻片直接接触胚胎。盖上盖玻片，必要时可用盖玻片轻轻调整胚胎位置。成像时，使用20倍干镜物镜观察胚胎。为了对焦样本，按下显微镜上的 L 100 按钮，然后选择共聚焦设置按钮。点击自动，并为通道一选择 CFP，通道二选择 GFP，通道三选择 RFP 或 mCherry。然后关闭窗口。打开二通道和三通道，然后点击解除联锁按钮。接着点击播放以开始扫描。调整参数后，采集所需图像，并以共聚焦软件格式及按通道的TIF格式保存，用于后续图像处理。进行CFP成像时，关闭第二和第三通道，打开第一通道，不改变焦平面区域。在采集图像前重新调整扫描参数，按前述方法保存图像，并按照Pan及其同事所述的方法进行图像处理，如图所示。传统的通过整体番红O染色进行软骨可视化方法，在观察发育中的梅克尔软骨方面具有重要价值，常用于观察最终的细胞排列结构，以便进一步分析软骨细胞随时间的谱系追踪。利用 SOX 10 kda 转基因品系已用于通过活体成像斑马鱼 M 转基因品系来研究活胚胎中的细胞迁移以及汇聚与延伸过程。为进一步研究软骨细胞在颅面骨骼结构中的排列，揭示了介导迈克尔软骨延伸与生长的软骨细胞相互排列与伸长过程。该图显示了 3 至 5 天受精后 UI 斑马鱼 M Sox 10 ERT2 CreERT 转基因胚胎的下颌结构。下颌骨以腹面观展示最佳，可清晰呈现此处梅克尔软骨中细胞的排列结构。稳定维持并遗传的颜色标记便于进行谱系追踪和颅神经嵴细胞命运图谱的绘制。单个蓝色细胞似乎发生迁移并与邻近细胞整合，随后沿前后轴方向伸长，形成形态均一的软骨区域，从而在向前延伸过程中保持梅克尔软骨的整体形态。该技术为猫发育领域的研究人员探索软骨在斑马鱼骨骼形成中的作用提供了途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过在胚胎梅克尔软骨Zebrabow克隆细胞分析软骨插层和定向扩散的可视化

软骨修复是一项尚未满足的医学挑战，而基于细胞的人关节软骨组织工程技术是一种有前景的解决方案。本文中，我们描述了三维（3D）仿生水凝胶作为扩增和成熟人关节软骨细胞的理想工具。...

用于关节软骨细胞培养与软骨生成的三维水凝胶支架

我们介绍一种分离和培养小鼠胚胎第15天（E15）跖骨的实验方案。该方法具有高度的生理相关性 离体 软骨内成骨模型提供了更接近的条件 体内 比单层或三维培养中的细胞更接近真实生理环境，是研究骨骼生长与发育的关键工具。...

小鼠胚胎跖骨培养：一种生理性软骨内成骨模型

我们在Rosa26tdtomato（在所有细胞中普遍表达）/Cre（在软骨细胞中特异性表达）小鼠中建立了两组示踪组合：一组联合2.3Col1a1-GFP（成骨细胞特异性标记），另一组联合免疫荧光染色（骨细胞特异性标记）。实验结果表明软骨细胞可直接转化为骨细胞。...

细胞谱系标记物与番茄信号的共定位

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

本方法介绍了使用R26R-Confetti（Confetti）小鼠模型研究矿化组织的全过程，涵盖从育种策略到图像采集的各个步骤。文中包含一个适用于所有软组织的通用方案，以及一个适用于矿化组织的改良方案。...

使用Confetti小鼠进行克隆遗传示踪以研究矿化组织

我们介绍一种利用光学切片方法研究椎间盘纤维环中软骨细胞空间排列的方法。...

从胚胎发育到退变的椎间盘光学切片与可视化

本方案详细描述了从人关节软骨中分离软骨细胞、纤维连接蛋白黏附实验衍生的软骨祖细胞（FAA-CPs）以及迁移性软骨祖细胞（MCPs）的方法。内容涵盖用于分离和鉴定这些细胞的酶消化、纤维连接蛋白黏附以及基于迁移的实验方法。...

利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

为了更好地理解软骨细胞对机械性软骨超负荷的损伤反应，本方案描述了一种ex...

体外冲击模型用于在牛软骨组织外植体中诱导亚致死性软骨细胞损伤

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

我们介绍一种基于5-甲基胞嘧啶（5-mC）点印迹法的DNA甲基化定量方法。我们测定了软骨细胞去分化过程中的5-mC水平。这种简单技术可用于快速确定自体软骨细胞移植（ACI）治疗中软骨细胞的表型。...

一种用于定量软骨细胞去分化过程中DNA甲基化水平的5-甲C点斑杂交检测方法 体外

了解利用Zebrabow转基因斑马鱼可视化软骨细胞插层和定向扩散的方法。该技术通过他莫昔芬诱导重组和共聚焦成像，实现颅面软骨克隆细胞群体的多光谱分析，为发育生物学研究提供直接观察细胞动态行为的强大工具。

通过Zebrafish克隆细胞分析可视化胚胎下颌软骨细胞的嵌合与定向增殖

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