为评估细胞Mechanosensing和Durotaxis简化系统体外
2015年8月27日
许多哺乳动物细胞优先通过硬性向更坚硬的基质或基质迁移。该方案的目标是提供一个简单的体外系统，该系统可用于通过掺入具有确定刚度的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 底物来研究和纵细胞双向性行为，并与玻璃盖玻片连接。
该程序的总体目标是为细胞 durex 分析提供一个简化的系统，通过该系统，许多哺乳动物细胞优先迁移到更坚硬的底物。这是通过首先制备具有规定刚度的聚甲基 suboxane 或 PDMS 基材来实现的。接下来，将制备好的 PDMS 倒入六孔板的每个孔中，并去除任何气泡。
然后，在每个孔的 PDMS 顶部放置消毒盖玻片以形成覆盖层，从而完成杜蕾斯腔室。最后一步是将细胞接种到 Duro 税室中，其密度使细胞有足够的空间迁移，而不会与其他细胞发生重大相互作用。最终，活细胞显微镜用于研究迁移细胞中的 axxis。
与聚丙烯酰胺等现有方法相比，该技术的主要优点是软质 PDMS 和刚性玻璃之间只有一个步骤，而不是梯度凝胶替代品。此外，用细胞外基质包被 PDMS 纤连蛋白等组分不需要化学交联，而聚丙烯酰胺凝胶则需要化学交联。要首先准备一个 6 孔组织培养板，请用 50 毫升锥形管撕碎天平。
在 50 毫升试管中称取约 10 克聚二甲基 suboxane 或 PDMS 碱溶液。对于 90 比 1 的基材，将 PDMS 基础溶液的测量重量除以 90。为了确定所需的交联剂溶液的正确量，将计算量的 PDMS 交联剂溶液添加到剧烈混合的管中 A-P-D-M-S 碱交联剂混合物中，在室温下放置 5 分钟。
在这个阶段使用小刮刀，混合物将包含少量气泡。在台式离心机中以 50 次离心 PDMS 底物 5 分钟。G.如果仍有气泡，请加温以去除气泡。
离心 5 分钟后，再次将 90 比 1 PDMS 底物中的 1 毫升移液到处理过的组织培养物的每个孔中。六孔板。在此阶段，可以通过用 21 号针头戳破 PDMS 中存在的任何剩余气泡来消除它们。
让 PDMS 在孔中扩散 30 分钟。接下来将 12 毫米玻璃杯煮沸 1 号，盖上盖子，在蒸馏水中放置 5 分钟，共 3 次。轻轻触摸盖子的一侧，将一张干燥的盖玻片放入组织培养板的每个孔中。
滑入 PDMS 溶液中，然后将盖玻片放到 PDMS 上。随着盖玻片稳定下来，PDMS 将开始侵占盖玻片的边缘，但不会完全覆盖它。这将在固化后在 PDMS 和玻璃之间生成一个界面。
将板在 70 摄氏度的烘箱中孵育 16 小时以固化 PDMS。最后，将板置于细胞培养罩中，进行紫外线消毒 10 分钟。在每个 Durox 腔室中涂上 1 毫升纤连蛋白，溶于不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水中，在 30 摄氏度下喷涂 1 小时。
确保整个表面浸没在 PBS 溶液中的纤连蛋白中。称取 0.5 克 BSA 并将其溶解在 50 毫升 PBS 过滤器中，制备热性质的 1% 牛血清白蛋白或 BSA。通过 22 微米点过滤器对溶液进行消毒，然后在 80 摄氏度下加热 12 分钟。
接下来，吸出纤连蛋白溶液并用 PBS 洗涤腔室 3 次。向每个孔中加入 1 毫升热变性 BSA 的 PBS 溶液，在室温下孵育 30 分钟，用胰蛋白酶观察，并在 durex 腔室被热量阻塞时对所选细胞进行计数。变性 BSA 在接种细胞之前从腔室中吸出 BSA 溶液。
将 10， 000 个体积为 2 毫升的细胞接种到 doax 室的每个孔中。使用所选特定细胞类型所需的培养基，让细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 的加湿培养箱中粘附并铺展在基质上 4 小时，在倒置显微镜上使用 10 倍物镜的相差进行活细胞成像。显微镜应配备封闭的环境加湿室，以便在长期成像过程中将温度控制在 37 摄氏度和 5% CO2。
成像，细胞扩散约 3.5 小时后，将板组装在显微镜室中。让样品在腔室中平衡 30 分钟。在显微镜上设置自动多点访问（如果可用）。
专注于 PDMS 和玻璃盖玻片之间的界面，并选择在界面周围成像的点。每个杜蕾斯腔室图像平均 40 个点，细胞每 10 分钟一次，持续长达 16 小时，感兴趣区域将显示为两条线，外线对应于盖玻片的边缘，内线对应于 PDMS 和盖玻片之间的实际界面。要分析数据，请生成一个电子表格，如文本协议中所示的电子表格。
计算从 PDMS 到玻璃表面的交叉事件数，反之亦然，从生成的每个视频中。交叉事件定义为细胞核在任一方向上越过 PDMS 和玻璃之间的边界。在 Excel 电子表格的相应列中记录交叉事件的数量，以量化多次交叉。
计算 cell 遍历界面的次数。该数字应记录在与影片结尾时单元格所在的基板相对应的 Excel 列中。对影片中穿过界面的每个单元格重复分析。
排除移出视野的细胞 成像期间。计算从 PDMS 迁移到玻璃表面并因此经历 Duro Texas 的细胞百分比。要这样做。
将从软到硬的交叉事件数和以硬结束的多个交叉事件相加，然后除以交叉事件的总数。通过将多次交叉的总数除以交叉总数来计算多次交叉的百分比，以开始了解细胞与其环境中的机械线索相对应的分子机制。可以使用 IRNA 敲低特异性蛋白质，如下所示。
大约 70% 的对照 irna 处理的细胞表现出 axxis。与此形成鲜明对比的是，当使用 RNAi 敲除 CD 间隙时，细胞对它们是迁移到硬底还是软底上没有偏好。此外，CD 间隙敲低细胞穿过边界倍数。
而对照 irna 处理的细胞通常只越过边界一次代表对照轨迹。Irna 细胞表明，与 CD 间隙相比，细胞通常迁移一次边界，并优先停留在更坚硬的表面上。Irna 处理了未表现出对任一刚性偏好并多次越过边界的细胞。
观看此视频后，您应该对如何准备 PDMS 基板、组装 duris 腔室和量化 DUR 税有很好的了解。
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概述
本协议概述了一个简化的体外系统，用于研究细胞硬性趋化，即哺乳动物细胞优先向刚性基质迁移。通过利用具有确定刚性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基质，研究人员可以操纵和观察细胞迁移行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 材料科学
背景
- 硬性趋化是细胞向更刚硬的基质移动的现象。
- 了解细胞迁移对于获得组织工程和癌症转移的洞见至关重要。
- PDMS是一种用于创建具有不同硬度的基质的多功能材料。
- 本研究旨在提供一种可重复的方法，用于分析细胞对基质刚性的响应。
研究目的
- 开发一种简单的方法来研究细胞硬性趋化。
- 研究基质刚性如何影响细胞迁移。
- 促进迁移细胞的活细胞成像。
使用的方法
- 准备具有确定刚性的PDMS基质。
- 将PDMS倒入六孔板中并移除气泡。
- 在PDMS上方放置灭菌的盖玻片。
- 将细胞接种到Durotax凹室中进行观察。
主要结果
- 细胞优先向更刚硬的PDMS基质迁移。
- 活细胞显微镜提供了关于迁移动态的洞见。
- 该系统允许对基质刚性进行受控操作。
- 研究结果有助于理解各种生物学背景下的细胞行为。
结论
- 本协议提供了一种可靠的方法来研究细胞硬性趋化。
- 获得的洞见可以为细胞迁移和组织工程的未来研究提供信息。
- 使用PDMS基质有效地操纵细胞行为。
常见问题
Executive Industry Relevance
This simplified durotaxis assay enables biopharma R&D teams to evaluate cell mechanosensing and directional migration in response to substrate stiffness, a key factor in tumor invasion and stromal interactions. By providing a reproducible in vitro model with a defined rigidity interface between PDMS and glass, the system supports target validation and mechanistic de-risking of proteins involved in mechanotransduction pathways. The assay’s adaptability to various cell types and knockdown strategies enhances its utility in early discovery for identifying modulators of durotaxis as potential therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding mechanosensitive proteins like cdGAP in regulating durotaxis.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking protein knockdown to loss of directional migration preference.
- Predictive Value: Generates quantitative crossing event data to assess target influence on cell migration behavior.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized PDMS-glass interfaces suitable for high-resolution live cell imaging and migration tracking.
- Reproducibility: Eliminates need for chemical cross-linking or gradient gels, improving assay consistency across experiments.
- Scalability: Compatible with six-well plate format, enabling parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models durotaxis, a process implicated in cancer cell invasion and stromal-driven malignancy.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanosensing findings to preclinical models of metastasis and tissue remodeling.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights to prioritize targets based on their role in rigidity-sensing pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking extracellular matrix mechanics to cell migration phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mechanosensors and GTPase regulators in durotaxis using live cell imaging readouts.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating compound or genetic effects on migration bias toward rigid substrates.
- Analytics: Delivers quantifiable outputs such as crossing event counts and directional migration percentages for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro mechanosensing data to pathophysiological contexts like tumor invasion where durotaxis plays a role.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing mechanosensitive targets across oncology, fibrosis, and wound healing programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target roles within mechanotransduction networks by reducing ambiguity in migration phenotypes.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a simple, gradient-free substrate system.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic links between targets and durotaxis-driven pathological processes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on functional validation in a disease-relevant mechanosensing assay.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, live cell imaging, and RNAi or genetic perturbation techniques.
- Depends on access to inverted microscopes with environmental control for long-term phase contrast imaging.
- Necessitates standardization of PDMS preparation and coating protocols to ensure consistent substrate rigidity.
- Involves adaptation considerations when extending the assay to primary cells or 3D migration models.
- Limited to 2D surface durotaxis; does not capture complex 3D matrix remodeling or proteolytic invasion mechanisms.
