Name: Sulfidogenic污泥海洋沉积物和三氯乙烯减少在上流式厌氧污泥床反应器开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: 了解如何利用上流式厌氧污泥床反应器从海洋沉积物中培养产硫污泥，并评估其在硫酸盐还原条件下对三氯乙烯的降解性能。该方法为有机污染物生物修复提供了高效解决方案。

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作者感谢墨西哥国立理工学院（Instituto Politécnico Nacional）提供的经费支持，项目编号为 20120110、20130399 和 20140239 SIP，同时也感谢墨西哥联邦区科学与技术研究所（Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito Federal México）提供的资助（项目编号 PICS 08-79，ICYT-DF，2009–2012）。此外，感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT – México）为 Selene Montserrat García-Solares 提供的研究生奖学金（编号 225806）以及项目编号 82627 的经费支持。

<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig1highres.jpg" width="450" /> 
图1. 实验方案步骤示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 收集海洋沉积物以制备污泥
<ol>
	<li>选择一个易于接近的海底区域，该区域应靠近海底热液喷口（由于存在硫化物，可能表明硫酸盐还原活性较高），或靠近可检测到有机物碎屑的区域。</li>
	<li>本研究中，采集约 3 至 4 kg 的沉积物，并将样品中的水分沥干。将样品放入不透光的塑料袋中，无需冷藏。</li>
	<li>样品运回实验室后，若不立即使用，应将装有样品的袋子置于冰箱中保存。本研究中，样品可在冰箱中保存数周至数月后再使用。</li>
	<li>取大量沉积物样品（即，1 或 2 kg），使用适当的筛网（0.2 cm）去除沉积物中可能存在的大块碳质碎屑或岩石等杂质。 
	注：本实验采用直径为 0.20 cm（0.0767 in）的筛网，但可根据样品中颗粒的大小选用不同尺寸的筛网。
	<ol>
		<li>将沉积物过筛后，充分混合所选部分，以确保样品均匀。</li>
		<li>另取若干小份样品（即，每份 2 至 3 g），按照标准方法11测定挥发性悬浮固体（VSS）含量。 
		注：有关步骤 1.2 至 1.4 的示意图，请参见 图 2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig2.jpg" /> 
图2. 沉积物样品的照片。（A） 刚采集后的沉积物样品。（B） 通过筛网后的沉积物样品。（C） 用于称重的样品，以进行挥发性悬浮固体（VSS）测定。培养皿无需灭菌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 生物反应器设置
<ol>
	<li>为本研究之目的，使用总工作体积为3 L的UASB玻璃反应器。或者，可使用1 L或2 L体积的玻璃反应器。</li>
	<li>根据沉积物中的挥发性悬浮固体（VSS）含量，计算作为接种物所需的沉积物量，以在1 L中获得5 g VSS。</li>
	<li>需注意，如果计算后的沉积物量过大，则沉积物应占据生物反应器约25%至30%的体积。
	<ol>
		<li>记录VSS含量，因为其在生物反应器中微生物群落富集过程中会发生变化。VSS含量是计算生物反应器中硫酸盐还原活性所必需的参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保生物反应器中基础培养基和缓冲溶液的最终浓度与Guerrero-Barajas报道的相近 等. (2014)12.
	<ol>
		<li>确保沉淀物、基础培养基、缓冲溶液和挥发性脂肪酸的最终体积之和等于反应器的最终工作体积。基础培养基配方12 含有适量的微量元素和维生素溶液。</li>
		<li>配制适合所用反应器工作体积的适量浓度的基础培养基和缓冲液储备液（即， 比步骤2.4中报告的浓度高2、3或4倍，以确保稀释后达到Guerrero-Barajas报告的浓度 等. (2014)12). 
		注意：基础培养基的储备液是必需的，但缓冲液仅在启动时需要。此后无需再添加缓冲液。</li>
		<li>配制挥发性脂肪酸储备液：按化学需氧量（COD）比例2.5:1:1配制乙酸、丙酸和丁酸的混合溶液。计算时需考虑基础培养基中已含的乙酸钠。反应器中最终COD浓度必须为2.7 g/L。 
		注意：请在通风橱中配制此溶液。配制过程中需佩戴腈类手套和护目镜。配制时需考虑硫酸根与挥发性脂肪酸反应的化学计量关系，如所示 图3.</li>
		<li>制备硫酸钠（Na₂SO₄）的储备溶液2SO4)以适当浓度加入，使反应器中硫酸根离子（SO₄²⁻）的最终浓度达到4,000 mg/L42-）。或者，只要最终硫酸盐（SO₄²⁻）浓度满足需求，可将所需硫酸盐的量直接加入基础培养基中，而不必从储备液添加。42-浓度是正确的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将沉积物与部分基础培养基混合后放入反应器中，以确保其沉降至反应器底部。
	<ol>
		<li>加入剩余的基础培养基以及与挥发性脂肪酸溶液和硫酸盐溶液混合的缓冲液。确保将挥发性脂肪酸溶液倒入液体中。注意：此步骤应在通风橱中进行。</li>
		<li>将反应器的连接管路与循环泵相连。设定循环流速为60 ml/min。将生物反应器置于温度控制箱中，温度设为34 &#176;C. 定期检查温度波动是否较小（即， 34 &#177; 1.7 &#176;C)</li>
		<li>连接气体置换柱的管路。 
		注意：参见 图4 适用于步骤 2.1 至 2.5。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig3highres.jpg" width="600" /> 
图3. 硫酸盐还原与挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的化学计量关系。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig4highres.jpg" width="400" /> 
图4. UASB反应器。&#160;(A) 初始时间。(B) 运行300天后的连续运行状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52956/52956fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 运行反应器以促进硫化作用及微生物生长
注意：需使接种物充分消耗挥发性脂肪酸和硫酸盐。为此，需等待一周后进行首次硫酸盐、硫化物和化学需氧量（COD）消耗的分析。
<ol>
	<li>孵育一周后，取5至7 ml液体样品，按照标准方法检测化学需氧量（COD）、硫酸盐和硫化物含量以及pH值。 11, 13.
	<ol>
		<li>分光光度法测定液体中的硫化物（在波长&#955;（670 nm 处的吸光度）通过亚甲蓝法测定 13.
		<ol>
			<li>在25 ml容量瓶中加入5 ml乙酸锌溶液（2% w/w），迅速加入200 &#181;将样品的 l 加入乙酸锌溶液中。</li>
			<li>加入2.5 ml的 N,N-二甲基-p草酸二氨基苯胺（DMP）溶液（0.2% w/w，溶于20% H2SO4）和125 &#181;l 的硫酸铁铵溶液（10% w/w，溶于 2% H2SO4）并用蒸馏水定容至25 mL。反应30分钟，待蓝色稳定。 13. 
			注意：将样品在分光光度计中检测前，需等待至少15分钟，但不超过60分钟。在分光光度计中测定蓝色终溶液的吸光度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据标准方法分析硫酸盐 11此处采用浊度法通过硫酸钡沉淀定量硫酸根。
		<ol>
			<li>将5 ml的活化溶液（盐酸HCl 1:1）加入25 ml容量瓶中，再加入1 ml先前已离心处理的样品（11,320 &#215; g) 用蒸馏水定容至25 ml刻度线，加入1 g氯化钡。</li>
			<li>将溶液在涡旋振荡器中混合1分钟。静置4分钟，使硫酸钡形成，然后在分光光度计中于特定波长下读取样品。&#955;420 nm 11.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据标准方法分析化学需氧量（COD） 11或者，使用COD测定试剂盒。
		<ol>
			<li>在进行化学需氧量（COD）测定之前，需将样品充分离心（11,320 × g）以去除可能干扰测定的残留硫化物。如有必要，可进行两次离心：第一次在取样后立即进行，第二次在等待6或8小时后进行，随后开展COD分析。</li>
			<li>向COD测定试剂盒的反应小瓶中加入2 ml样品，密封小瓶，并通过轻轻振荡使混合物均匀。另取一个反应小瓶，加入2 ml蒸馏水作为空白样，并振荡使混合均匀。</li>
			<li>将小瓶放入消化反应器中，于150 &#176;在 2 小时内将样品冷却至室温，避光放置。使用分光光度计在 620 nm 波长处测定各试管的吸光度值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从气体置换柱中获取气体体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等待另外5到7天，直至硫酸盐被消耗完毕。在开始下一轮补料分批培养前，硫酸盐和化学需氧量（COD）的消耗率必须达到约85%至90%。</li>
	<li>一旦硫酸盐（和COD）被消耗完，完全重复步骤2.4。每批次均需提供新鲜培养基和新的营养物质。</li>
	<li>重复步骤 3.1 和 3.2。此时每批培养物的持续时间应为 7 至 10 天。</li>
	<li>当完成3到4个批次后，重复步骤2.4，但将COD浓度提高至4 g/L。</li>
	<li>重复步骤 3.1 和步骤 3.2。
	<ol>
		<li>重复步骤 3.3，但将 COD 浓度提高至 6 g/L。</li>
		<li>重复步骤3.6和3.6.1，逐步增加COD浓度，直至达到10 g/L。 
		注意：绘制硫酸盐浓度（mg/L）随时间（d）变化的曲线图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当硫酸盐消耗量在24小时内超过80%，且此情况持续超过一周时，将反应器运行模式切换至连续模式。在连续模式下，设定水力停留时间（HRT）为24小时，并维持硫酸盐浓度为4 g/L，化学需氧量（COD）为10 g/L。 
	注意：随着时间推移，硫酸盐的消耗 应为 更快.</li>
</ol>
4. 硫酸盐还原活性测试
<ol>
	<li>在进行本测试之前，需确保生物反应器在连续运行模式下，残留硫酸盐浓度的变化小于10%。</li>
	<li>在任意一天，于完成一个水力停留时间（HRT）周期后停止反应器，并执行步骤2.4。在步骤2.4.3中，使用10 g/L的COD浓度。</li>
	<li>在生物反应器进料后，每隔一小时采集5至7 mL液体样品，测定COD、硫酸盐、硫化物（步骤3.1）和pH值，并记录产生的气体体积。</li>
	<li>根据文献14计算硫酸盐还原活性。 
	&#160; 
	<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq1.jpg" /></li>
</ol>
SRA = 硫酸盐还原活性（mg COD-H2S）/gVSS*d
m H2S = 以 mg COD-H2S 表示的硫化物浓度
VSS = 挥发性悬浮物浓度
t = 时间（d 或 hr）
<ol start="5">
	<li>绘制相应的图表，显示随时间变化的硫酸盐消耗百分比与硫化物浓度（mg/L）之间的关系。绘制化学需氧量（COD）消耗百分比随时间变化的图表。绘制pH值随时间变化的图表。</li>
</ol>
5. 三氯乙烯（TCE）还原试验
<ol start="1">
	<li>在进行本测试之前，确保生物反应器处于连续运行状态，且剩余硫酸盐浓度的变化小于10%。若生物反应器中硫酸盐还原率低于90%，则不得开始本测试。</li>
	<li>配制三氯乙烯（TCE）储备液时需注意，该化合物在生物反应器液相中的最终浓度必须为300 &#956;M. 通过使用三氯乙烯（TCE）在34℃下的亨利定律无量纲常数（H´），考虑该化合物在顶空中的分配 &#176;C. H´at 34 &#176;TCE 的 C 值为 0.4722。 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq2.jpg" /> 
	注意：在通风橱中配制此溶液，并佩戴手套和护目镜。
	<ol>
		<li>例如，对于5,000 &#956;M 储备液，按如下方法计算： 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/52956/52956eq3.jpg" /> 
		TCE 气相浓度 = (0.4722) × (5,000) = 2,139 &#956;M. 由于该量的三氯乙烯将存在于顶空中，因此在配制储备液时需包含此浓度。 
		然后，在储备液的液体（水）中，实际的TCE浓度为：5,000 + 2,139 = 7,139 &#956;M. TCE 密度 = 1.43 g/ml。将 7139 &#956;将摩尔浓度（M）转换为毫克（mg），然后利用三氯乙烯（TCE）的密度计算储备溶液所需TCE的体积。 
		注意：TCE 储备液的浓度可能低于 5,000 &#956;M, 即3,000 或 1,000 &#956;M，这取决于根据生物反应器的液相体积可向其中加入的该溶液的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在气相色谱仪中制备三氯乙烯（TCE）的标准曲线， 顺式-1,2-二氯乙烯， 转-1,2-二氯乙烯、氯乙烯和乙烯。制备 顺式-1,2-二氯乙烯和 转-1,2-二氯乙烯的标准曲线，通过按照5.2节中所述三氯乙烯（TCE）储备液的相同步骤，由这些化合物的储备溶液制备。通过将标准气体（气瓶）中每种气体的浓度进行稀释，制备氯乙烯和乙烯的标准曲线。
	<ol>
		<li>在20至300范围内制备这些化合物的标准曲线 &#956;M. 采用Guerrero-Barajas报道的方法 等. (2011)15 用于这些化合物的气相色谱分析。 
		注意：在通风橱中配制这些标准溶液，并佩戴手套和护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在任意一天，一个水力停留时间（HRT）周期结束后停止反应器，并进行步骤2.4。在步骤2.4.3中，使用化学需氧量（COD）浓度为10 g/L。</li>
	<li>生物反应器进料后，将5.2步骤中配制的储备液中的TCE直接加入生物反应器液体中，生物反应器液相中TCE的最终浓度必须为300 &#956;M. 将水力停留时间（HRT）设定为12小时。
	<ol>
		<li>一个HRT周期结束时，取液体样品（500至1,000 &#956;l）并进行 COD、硫酸盐和硫化物的分析（步骤 3.1.1、3.1.2 和 3.1.3）。采集顶空样品（100 至 250 &#956;l）并对三氯乙烯（TCE）进行分析， 顺式-1,2-二氯乙烯， 转-1,2-二氯乙烯、氯乙烯和乙烯在气相色谱仪中的分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 2.4。在步骤 2.4.3 中，使用 10 g/L 的 COD 浓度。</li>
	<li>在生物反应器的硫酸盐还原率超过90%且硫酸盐还原率与反应器内残余硫酸盐浓度的变化均小于10%之前，不得重复任何TCE还原试验。</li>
	<li>重复步骤 5.4、5.5 和 5.6 两到三次。</li>
	<li>在完成一次TCE降解试验后立即采集沉积物样品（0.5 g）用于微生物鉴定。此操作应在进行2次或3次TCE降解试验之后进行。</li>
</ol>
6. 三氯乙烯还原实验后的硫酸盐还原活性测试
<ol start="1">
	<li>完全重复步骤 4。</li>
</ol>
7. 微生物的鉴定
<ol>
	<li>取约 0.5 g 污泥样品，按照标准方法12进行总 RNA 提取。</li>
	<li>通过逆转录扩增 16S rRNA 基因，并进行一步法聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增12。</li>
	<li>设计引物用于扩增，或作为初步方法采用文献中建议的引物11。遵循文献中建议的扩增程序12。</li>
	<li>构建 16S rRNA 文库。可通过克隆试剂盒对 PCR 扩增产物进行克隆11。通常，从每块平板中选取 10 个菌落（每个菌落代表一个 PCR 产物）进行克隆。按照文献建议的方法12制备质粒 DNA 用于测序。</li>
	<li>进行片段测序。使用先前描述的 PCR 扩增方案（步骤 7.4）对约 1,400 bp 的 PCR 外部产物重新扩增，并按照文献建议的方法进行克隆12。按照文献建议的方法12从 E. coli 菌落中分离重组质粒。使用 M13 通用引物进行部分测序操作12。</li>
	<li>进行序列分析。使用 Clustal X 对核苷酸序列进行比对，并在文本编辑器中手动调整。在 NCBI 数据库中进行 BLAST 搜索。（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）12。</li>
	<li>获取核苷酸序列登录号。将鉴定出的克隆核苷酸序列提交至 EMBL 核苷酸序列数据库（GenBank/EMBL/DDBJ），并获得相应的登录号（例如，扩增子序列的登录号为 JQ713915–JQ713925）12。</li>
</ol>

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<li>Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfate+reduction+and+trichloroethylene+biodegradation+by+a+marine+microbial+community+from+hydrothermal+vents+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+and+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments.</a> International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).</li>
</ol>

作者 Selene Montserrat García-Solares、Claudio Garibay-Orijel 和 Claudia Guerrero Barajas 于 2012 年作为发明人提交了名为“一种用于处理高硫酸盐和含氯化合物工业废水的厌氧处理工艺”的专利申请。该申请已通过形式审查阶段。该专利申请的权利人为墨西哥国立理工学院（Instituto Politécnico Nacional）。

硫化作用在环境生物技术中有多种应用，其中最常用的应用之一是硫酸盐还原菌与发酵菌共培养代谢，用于废水处理。上流式厌氧污泥床（UASB）反应器是处理高硫酸盐浓度工业废水的主要工程化方法之一。本文介绍了一种从海洋沉积物中在UASB反应器内获取硫化产泥的实验方案。从海洋沉积物中获得硫化产泥的关键步骤包括：（1）促进待装入反应器的沉积物样品的均质化；（2）提供适宜浓度的硫酸盐和挥发性脂肪酸（COD/SO42-）比例；（3）定期检测硫酸盐、硫化物、化学需氧量（COD）和pH值；（4）每次启动新批次时更换含有微量元素和维生素的基础培养基。需要注意的是，污泥的发育在很大程度上依赖于原始样品中的微生物群落结构以及准确的物料平衡（硫酸盐和COD）。尽管硫酸盐还原活性的建立需要一定时间，但生物反应器需持续监控，以避免泄漏、事故或临时断电导致循环泵停止运行或温度控制失效。在进行硫化物、硫酸盐和COD分析时必须格外注意操作的准确性。
海洋沉积物通常是多种微生物的天然来源；从不同深度采集的海洋沉积物可能形成污泥。本方案选择使用海底热液沉积物，主要有两个原因：（1）这...

环境生物技术领域最重要的贡献之一是设计出能够在硫酸盐还原条件下运行的生物反应器，并利用污泥（接种物）实现这一过程。硫酸盐还原（SR）能够处理含有高浓度硫酸盐的废水，同时去除化学需氧量（COD）、重金属和有机污染物，这使得SR成为污泥的理想特性1。含有硫酸盐污染的出水实例来自制革、造纸、制药和化工制造等行业1。然而，大多数文献中所提及的产硫化物污泥，通常是指将产甲烷颗粒污泥适应于产硫化物过程而获得的污泥2。这种适应通常通过调节生物反应器中的COD/SO42-比值并添加化学物质抑制污泥中的产甲烷菌来实现2,3。除了产硫化物颗粒形成所需时间较长外，产甲烷菌与硫酸盐还原菌之间的竞争，以及污泥对高浓度硫化物的耐受性，都是当使用以产甲烷为主的污泥经适应获得产硫化物污泥时可能面临的主要问题。在本研究中，我们描述了从墨西哥纳亚里特州蓬塔米塔（Punta Mita, Nayarit, Mexico）热液喷口沉积物中，在上流式厌氧污泥床反应器（UASB）中获取以产硫化物为主的污泥的方法，随后评估其随时间变化的硫酸盐还原活性，并开展实验以评价其在还原性脱氯中的应用潜力。选择该沉积物采样地点的原因是已有报道指出，该区域由于栖息微生物群落表现出的硫酸盐还原活性，能够生成硫化物4。
与将产甲烷颗粒污泥驯化为产硫化物污泥相比，从沉积物中获取这种产硫化物污泥具有若干优势。这些优势包括：（1）反应器运行无需形成颗粒；（2）与其他使用驯化后产甲烷污泥运行的UASB反应器相比，该污泥对相对较高浓度的硫化物具有耐受性；（3）即使在培养基中添加的挥发性脂肪酸混合物中含有乙酸盐，也不会与产甲烷菌发生底物竞争。
采用本方案旨在促进硫化物生成，因为海洋沉积物是多种微生物的天然来源，例如硫酸盐还原菌、发酵菌和脱卤菌等5,6。通过本方案从海洋沉积物中富集形成的微生物群落，可能表现出高效的硫酸盐还原能力，从而在长时间内维持较高的硫酸盐还原活性，并对高于甲烷菌和硫酸盐还原菌毒害阈值浓度的硫化物具有更强的耐受性。另一方面，按照本方案操作，沉积物中也可能展现出脱卤能力，但这可能取决于原始的微生物群落结构。这一推断基于以下事实：还原性脱氯过程可通过呼吸作用或共代谢发生，而这两种条件均可能在海洋微生物群落中得以促进7。为获得污泥而对沉积物进行培养时，采用乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的混合物作为底物，因为这些挥发性脂肪酸可被多种硫酸盐还原菌菌株利用。此外，根据文献中关于海洋沉积物中碳质物质的多篇报道，这些酸类也是海洋沉积物中常见类型的碳化合物5,6。
最后，全球地下水及其他水体中发现的毒性最强的化合物之一是氯化溶剂，例如三氯乙烯（TCE）或四氯乙烯（PCE）。这些化合物不仅对人类有毒，而且对微生物也有毒性，尤其是TCE，至今仍被美国环境保护署列为优先控制污染物8。在本研究中，我们设计了一项实验，用于检测硫化盐还原污泥在甲烷生成条件下报道的氯化物生物降解浓度范围内还原TCE的能力9,10。需要指出的是，目前大多数关于氯化物生物降解的研究均在甲烷生成条件下进行9,10。我们认为，本方案中提出的TCE实验很好地展示了该污泥的潜在应用价值。本实验旨在评估污泥对TCE的耐受性以及TCE对硫酸盐还原活性的影响。鉴于大多数氯化物生物降解研究均在甲烷生成条件下开展，本方案提出所培养的污泥可能实现以下三种功能的同时去除：（1）去除硫酸盐，（2）去除化学需氧量（COD），（3）去除氯化物。下一步可进一步评估该污泥在同时去除TCE和重金属（以及硫酸盐和COD）方面的性能，而后者两种污染物的共存条件在甲烷生成条件下无法实现有效处理。

<table><tbody><tr><td>三氯乙烯&amp;nbsp;</td><td>sigma Aldrich</td><td>251402</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;cis&lt;/em&gt;-1,2-二氯乙烯</td><td>sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;trans&lt;/em&gt;-1,2-二氯乙烯</td><td>sigma Aldrich</td><td>D-62209</td><td></td></tr><tr><td>氯乙烯scotty标准品</td><td>supelco</td><td></td><td>氮气中1,000 ppm v/v</td></tr><tr><td>乙烯scotty标准品</td><td>supelco</td><td></td><td>纯度99%</td></tr><tr><td>泵</td><td>Masterflex</td><td></td><td>型号 7553-75</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气密性注射器&amp;nbsp;</td><td>任意</td><td></td><td>100 和 200 微升</td></tr><tr><td>UASB玻璃反应器</td><td>任意</td><td></td><td>正在设计中</td></tr><tr><td>气相色谱仪&amp;nbsp;</td><td>任意</td><td></td><td>FID检测器</td></tr><tr><td>毛细管色谱柱 SPB-624</td><td>supelco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氟橡胶管</td><td>Masterflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基础培养基试剂</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素试剂</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维生素溶液试剂</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>挥发性脂肪酸</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学需氧量（COD）测定试剂盒</td><td>HACH</td><td></td><td>测定范围 0–15,000 mg/L</td></tr><tr><td>TOPO-TA克隆试剂盒 pCR&amp;reg;4.0&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S.N.A.P. TM Miniprep试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pure link TM Quick Plasmid Miniprep试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用海洋沉积物培养产硫化物污泥及其在上流式厌氧污泥床反应器中还原三氯乙烯

海洋沉积物，产硫化物污泥，三氯乙烯，上流式厌氧污泥床反应器，生物还原，含氯有机物，硫酸盐还原菌

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

微生物硫酸盐还原的重要性在于其在环境生物技术中的多种应用。工程化的硫酸盐还原被用于工业废水处理，以去除高浓度的硫酸盐，同时降低化学需氧量（COD）和重金属含量。该过程最常用的方法是采用厌氧生物反应器，通过将主要为产甲烷的颗粒污泥逐步适应为产硫化物污泥来获得硫化物生成污泥。这一过程可能耗时较长，且由于污泥中仍存在产甲烷菌，无法完全消除对底物的竞争。在本研究中，我们提出一种获取产硫化物污泥的新方法，以热液喷口沉积物作为微生物的原始来源。在硫酸盐和挥发性脂肪酸共存条件下发育形成的微生物群落具有足够的多样性，能够长期维持硫酸盐还原活性，且不会因硫化物积累而受到抑制。
本方案描述了在上流式厌氧污泥床（UASB）反应器中，利用沉积物生成污泥的方法。此外，本方案还介绍了利用该污泥通过还原脱氯作用去除高毒性有机污染物三氯乙烯（TCE）的实验方法。本方案分为三个阶段：（1）在UASB反应器中形成污泥并测定其硫酸盐还原活性；（2）利用污泥去除TCE的实验；（3）在TCE还原完成后对污泥中微生物的鉴定。尽管本例中沉积物采自墨西哥某地，但采用本方法生成产硫污泥时，也可使用其他来源的沉积物，因为海洋沉积物是微生物的天然储库，其中可能富集硫酸盐还原菌。

生物反应器中硫酸盐还原的典型行为如图5所示。需要注意的是，在运行的最初几周，硫酸盐还原速度较慢。尽管如此，随着时间推移，超过90%的硫酸盐被消耗，表明接种物正在形成能够还原硫酸盐的微生物群落，因而富集了硫酸盐还原菌。图中不同的阶段表明，硫酸盐还原速率随时间逐渐提高。在初期，批次反应需要20天才能完成硫酸盐的还原（阶段I）；随后还原速率加快，大约需要10天即可还原所投加的硫酸盐（阶段II）。阶段III中硫酸盐还原的波动较小，平均耗时约10天，如图5所示。在此之后，硫酸盐还原平均仅需4天（阶段IV）；而在阶段V中，4,000 mg/L的硫酸盐在不到24小时内即被完全消耗。在运行200天后，生物反应器在水力停留时间（HRT）为24小时的条件下转为连续运行模式。
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/52956/52956fig5.jpg" /> 
图5. 生物反应器中产硫化物污泥形成过程中随时间变化的硫酸盐（SO4<...

微生物硫酸盐还原是在环境生物技术中具有重要意义的过程。硫化反应器的成功运行在很大程度上取决于污泥的微生物组成。本文介绍了一种利用热液喷口沉积物在上流式厌氧污泥床（UASB）反应器中培养硫化污泥以实现还原性脱氯的实验方案。

微生物硫酸盐还原的重要性在于其在环境生物技术中的多种应用。经人工设计的硫酸盐……

本实验的总体目标是从中国台湾海洋沉积物中在A-U-A-S-B反应器内培养出具有产硫化物能力的污泥，并评估其对三氯乙烯（TCE）的还原性能。首先通过采集海洋沉积物，获得含有大量微生物的混合样品，这些微生物在含有适当矿物质、维生素培养基以及挥发性脂肪酸（作为电子供体）的环境中，可富集硫酸盐还原菌。第二步，将上述海洋沉积物作为接种物接入A-U-A-S-B反应器，在硫酸盐还原条件下运行并维持数周，直至反应器达到稳定的硫酸盐还原活性。接下来，在硫化物生成活性仍然存在的情况下，评估硫化物生成型UASB反应器中的微生物群落对三氯乙烯（TCE）的还原能力，以评价该污泥转化有机污染物的能力。结果表明，生物反应器中已成功建立硫化物生成过程，并且基于微生物群落分析，污泥能够在硫酸盐还原条件下还原TCE，提示TCE的还原是由硫酸盐还原菌与发酵细菌共同组成的微生物群落完成的。该方法相较于现有方法（如使产甲烷菌群适应TCE）的主要优势在于，所获得的菌群对较高浓度的硫酸盐具有耐受性，且不会与产甲烷菌发生底物竞争。通常，初次接触该方法的人员可能会遇到困难，因为他们期望槽道能够立即形成。他们可能会倾向于向生物反应器中添加营养物和硫化物，但添加频率可能低于或高于所需水平。这些做法只会导致系统失衡。定期分析化学需氧量（COD）、硫酸盐和硫酸根含量，有助于了解反应进程，并确定下一步操作的合适时机。我们最初提出该方法的设想，是希望获得一种高活性的光合硫酸盐还原体系，以实现有机物和污染物的同步去除，而这一目标在异养条件下难以实现，特别是当部分污染物与重金属共存时。我们采用了一种通用方法，并借助性能良好的设备对菌群中的细菌进行鉴定。以16S rRNA基因为分析靶标，我们发现了有趣的细菌类群。开始此操作前，按照文本方案所述采集海洋样品。进入实验室后，取大量沉积物样品，使用适当的筛网从沉积物中去除碳质大颗粒杂质。将沉积物通过筛网后，混合选定的部分以确保其均匀。本实验采用总工作体积为三升的上流式厌氧污泥床玻璃反应器。确保沉积物基础培养基缓冲液和挥发性脂肪酸的最终体积之和等于反应器的最终工作体积。根据反应器的工作体积，配制含有磷酸盐、氯化物、氮源、镁盐、微量元素和维生素的基礎培养基储备液，并加入碳酸氢盐缓冲溶液。接着，配制由乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐组成的挥发性脂肪酸储存液。按照2.5:1:1的化学需氧量（COD）比例，反应器中最终的COD浓度必须为2.7克/升。最后，配制适当浓度的硫酸钠储备液，使反应器中硫酸根离子的最终浓度达到每升4,000毫克。溶液配制完成后，将沉积物放入反应器中，并与部分基础培养基混合，以确保其沉入反应器底部。将剩余的基础培养基和缓冲液与挥发性脂肪酸溶液及硫酸盐溶液混合。确保将挥发性脂肪酸溶液倒入液体中，然后将混合溶液加入反应器。将反应器的连接管路与循环泵连接。然后将循环流速设定为60毫升每分钟。将生物反应器置于温度控制室中，并常规设定为34摄氏度。检查温度波动是否较小。最后，连接气体置换柱。经过一周的培养后，取5至7毫升液体样品，用于分析COD、硫酸盐和硫化物含量以及pH值。按照标准方法，采用亚甲蓝法测定液体中的硫化物。首先，在25毫升容量瓶中加入5毫升醋酸锌溶液。然后迅速将200微升样品加入醋酸锌溶液中。接着加入2.5毫升DMP溶液和125微升硫酸高铁铵溶液。用蒸馏水定容至 25 毫升容量瓶刻度。反应需等待 30 分钟，以使蓝色稳定。反应完成后，需再等待至少 15 分钟，但不得超过 60 分钟。在分光光度计中检测样品时，于670纳米波长下测定最终蓝色溶液的吸光度。采用浊度法将硫酸盐定量为硫酸钡。首先，取5毫升条件试剂溶液加入25毫升容量瓶中。然后加入1 mL已预先在11,320 ×g条件下离心的样品。用蒸馏水定容至25 mL刻度试管，并加入1 g氯化钡。在涡旋振荡器中混合溶液1分钟。静置4分钟，使硫酸钡沉淀形成，随后在分光光度计中于420 nm波长处读取样品吸光度。为进行化学需氧量（COD）测定，需先将样品充分离心，以去除可能干扰COD测定的残留硫化物。离心后，取2毫升样品加入COD测定试剂盒的反应小瓶中。密封小瓶，并通过轻轻振荡使混合物均匀。取另一反应小瓶，加入2毫升蒸馏水作为空白样，混匀。将小瓶放入消化反应器中，在150摄氏度下加热2小时。然后取出小瓶，避光冷却。在分光光度计中以 620 纳米的波长读取小瓶的吸光度值。接着，从气体置换柱中获取气体体积。当硫酸盐被消耗完后，为每一批次补充新鲜的培养基和新的营养物质。当硫酸盐消耗量在24小时内超过80%，且此情况持续超过一周时，应将反应器的运行模式切换至连续模式。通过调节泵的流速，将水力停留时间（HRT）设定为24小时，并确保每天硫酸盐浓度维持在4克/升，化学需氧量（COD）维持在10克/升。在一个HRT周期结束后停止反应器运行，并像之前一样，为每批次提供新鲜的培养基和新的营养物质，其中COD浓度为10克/升。进料后，取5至7毫升液体样品，每小时检测一次COD、硫酸盐、硫化物和pH值。同时，记录TCE测试过程中产生的气体体积。配制TCE储备液时需注意，该化合物在生物反应器液相中的最终浓度必须为300微摩尔（µM）。利用三氯乙烯（TCE）在34摄氏度下的亨利定律无量纲常数，考虑该化合物在顶空中的分配。随后，每天根据文中所述实验方案，在气相色谱仪上为待分析的每种化合物制备标准曲线。在一个水力停留时间（HRT）周期结束后停止反应器运行，并像之前一样，为每批反应补充新鲜培养基和新营养物质，化学需氧量（COD）浓度为10克/升。在向生物反应器投加培养基后，直接从储备液中将TCE加入生物反应器的液体中。生物反应器液相中TCE的终浓度必须为300 µmol。在一个HRT周期结束时，将水力停留时间（HRT）设定为12小时。采集液体样品，检测化学需氧量（COD）、硫酸盐和硫化物。同时采集顶空气体样品，并使用气相色谱仪进行分析。此处展示了生物反应器中硫酸盐还原的典型行为。需要注意的是，在运行的最初几周内，硫酸盐还原速率较慢。不同的阶段表明，硫酸盐还原速率随时间逐渐增加，直至在不到24小时内消耗4,000毫克/升的硫酸盐。此后，反应器进入连续运行状态。污泥的发育情况通过反应器中硫酸盐还原的代表性结果展示。此处显示了随时间变化的硫化物浓度、COD 消耗以及 pH 值的变化。这些结果来自生物反应器连续运行数周后进行的实验。在测试污泥还原三氯乙烯（TCE）能力的实验中，获得的结果如图所示。所测得的硫酸盐还原活性略低于添加TCE之前的水平。气相色谱分析表明，约80%的TCE被还原为乙烷。在通过本方案培养的污泥中，鉴定出硫酸盐还原菌、发酵菌和脱卤菌。某些细菌属，例如脱硫弧菌属（sulfa vibrio de sulfa）、脱硫杆菌（microbial des sulfide bacterium）、德哈克氏梭菌（clostridium deha backer）以及 SUL fossum，已被证实与硫酸盐还原及含氯化合物的生物降解相关。一旦掌握该技术，只要操作得当，便可采用不同的海洋沉积物以类似方式开展实验。该反应体系的形成时间可能取决于沉积物的来源。在进行该操作过程中，请务必定期检测化学需氧量（COD）、硫酸盐的质量平衡。获得的菌群活性越高，其用于还原TCE以及最终降解其他可在硫酸盐还原条件下被降解的有毒化合物的可能性就越大。观看本视频后，您应充分了解如何从海洋沉积物中在USB反应器内培养Genics菌群，并评估其对TC还原的性能。您应掌握如何接种反应器、如何随时间监测还原反应进程，以及如何按照本方案进行TCE还原测试。还可以进行其他方法，例如其他基因分析的周期性测序，以回答进一步的问题，例如每克样品中细菌的总数是多少，或该菌群如何在绝缘光化学环境中降解三氯乙烯（TCE）。

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