隔离和鼠标主动脉内皮细胞原代培养

该程序的总体目标是使用一种简单的方法从小鼠主动脉中分离和扩增内皮细胞，而无需使用任何特殊设备。用于分离内皮细胞的其他方法主要应用于心脏或肺，而不是主动脉。这种主动脉技术可提供相当高的产量、高细胞活力，并且不需要特殊设备或技术。

虽然这些适用于基因敲除或小鼠小鼠的原代内皮细胞的研究，但来自大多数疾病模型。这个协议非常有用且易于实践。在一天开始时开始此协议。

麻醉鼠标并确认没有反射后，将鼠标仰卧在手术垫上，并在其上放置加热灯以保持其体温。然后用 70% 乙醇喷洒腹部消毒。接下来，用解剖剪刀沿中线打开腹部，露出腹主动脉。

然后，打开胸腔，露出心脏和肺。现在，通过沿着主动脉中心线解剖来释放小鼠的血液。然后，注射到左心室中，注射 1000 单位的肝素和一毫升的 PBS，从而灌注主动脉。

灌注后，推开阻碍器官，迅速取出胸主动脉，将其转移到冰冷的 PBS 中。在层流罩下，用冰冷的 PBS 轻轻冲洗主动脉，以使用 25 号针头和注射器去除任何残留的血液。然后，使用显微解剖钳，尽可能多地去除附着的脂肪组织和侧血管。

心脏骤停和主动脉段接种到基质上的时间对于内皮细胞的活力至关重要。因此，在去除动脉周围脂肪组织和结缔组织的同时，避免拉伸主动脉，并限制此步骤所花费的时间。最多 15 分钟。

然后，将清理干净的主动脉转移到内皮生长培养基中，并用手术刀将主动脉切成一毫米的环。一个主动脉最多可产生 10 个环。然后，用显微解剖剪刀打开每个环。

首先，将六孔板放在冰上，涂上一毫升基质溶液，不要倒出任何气泡。然后，将板转移到培养箱中 20 分钟，使基质凝固。凝固后，可以将主动脉碎片放在基质上，管腔面朝下。

这样做时不要接触内皮。在每个孔中放置 3 到 4 个片段。然后，将足够的生长培养基倒在节段上以保持湿润。

接下来，将它们转移到含有 5% 二氧化碳的培养箱中约 4 到 6 小时。在一天结束时，添加更多媒体，以便覆盖区段。在接下来的几天里，主动脉段将周期性地发芽。

每天通过相差显微镜监测发芽。同时调整介质的级别。第四天，小心地去除培养基，并轻轻去除主动脉段。

不要干扰在基质上生长的细胞。然后，向基质上的内皮细胞中加入 2 mL 新鲜培养基，并继续培养 2 至 3 天。从基质中去除主动脉段的时机对于内皮细胞的纯度至关重要。

在管网发育之前必须去除该节段，否则细胞将被成纤维细胞或平滑肌细胞污染。首先，准备一个含 0.1% 明胶的 T12.5 培养瓶，并孵育 30 分钟。接下来，用温热的 PBS 仔细清洗基质板，然后向每个孔中加入 100 单位的中性蛋白酶，并在室温下将板放在平台摇杆上孵育，偶尔摇晃。

当细胞在相差下出现分离时，向每个孔中加入 2 mL d-Val 以结束反应。检查孔，然后将上清液收集在 15 毫升试管中。然后，将试管以 900 gs 离心 5 分钟，并将细胞沉淀重悬于 4 mL 培养基中。

将悬浮液接种在准备好的培养瓶中，并将细胞孵育 2 小时。然后，更换培养基，并继续孵育 3 到 4 天，直到细胞达到 85-90% 汇合。当细胞准备好后，再准备两个 T12.5 培养瓶，像以前一样传代细胞。

然后，用温热的 PBS 洗涤细胞，并使用约半毫升胰蛋白酶-EDTA 在孵育后一分钟内分离大部分细胞。接下来，用 2 毫升培养基结束该反应。现在，将悬浮液通过移液管数次，然后将其转移到 15 毫升试管中。

接下来，将细胞以 900 gs 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 4 mL 培养基中。然后，将悬浮液分装在两个准备好的培养瓶中，让它们孵育 2 小时。然后，更换培养基，并像以前一样继续培养细胞至汇合。

经过 2 到 3 次这样的传代后，表征细胞。使用所描述的方案，在培养 2 天后观察到小鼠主动脉段的自发性内皮细胞发芽。4 d后，许多内皮细胞从节段中移出，新形成的芽继续从节段和分支中延伸出来。

在培养这些细胞并传代一次后，细胞呈纺锤形，外观呈鹅卵石状。然后用 Dil-ac-LDL 和 Ulex 凝集素标记附着的细胞一小时。细胞核也被染色。

大多数细胞的 Dil-ac-LDL 摄取和 Ulex 结合呈双阳性。第二次传代后，超过 95% 的细胞血小板内皮细胞粘附分子 1 呈阳性。这些细胞的 VEGFR2 、 VE-Cadherin 和 eNOS 也呈阳性。

此外，这些细胞的平滑肌标志物钙调蛋白大多呈阴性。该方案为研究目标分子的内皮特异性活性提供了很好的机会，并且可以在敲除和转基因小鼠模型中完成，使其在心血管研究领域非常有用。