Name: 一个体外模型在HIV合并感染的背景下测量免疫应答疟疾 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解在HIV合并感染背景下疟疾的先天免疫应答研究方法。通过共培养恶性疟原虫与外周血单个核细胞，利用流式细胞术分析细胞因子活性，为HIV与疟疾共感染机制研究提供重要实验模型。

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C.A.M.F. 和 L.S. 参与了实验方案的设计、数据的获取与分析，以及文章的撰写。
作者谨此感谢 Kain 博士、Loutfy 博士、Wasmuth 博士和 Ayi 博士所做出的贡献。
C.F. 获得了加拿大治疗网络/安大略省艾滋病治疗网络（OHTN）博士后奖学金的支持。L.S. 获得了安大略省艾滋病治疗网络（OHTN）青年研究者发展奖的支持。本研究工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）运营基金（MOP-13721 和 115160）以及 CIHR 新研究者催化剂基金的资助。

本方案需要招募用于寄生虫培养的血清和红细胞供体，以及用于外周血单个核细胞（PBMC）分离的HIV阳性及未感染供体。所有研究必须经过机构审查委员会批准，所有供体在采血前须签署知情同意书。
警告：处理人类血液样本和人类疟原虫需采取预防措施。始终穿着实验服、佩戴手套，并在二级生物安全柜中操作。若发生意外经皮暴露于人类疟原虫的情况，应立即向健康与安全部门报告，以接受预防性治疗。处理 HIV 阳性血液时还需采取额外的安全防护措施：穿着背后系扣的实验服，戴双层手套（外层应为乳胶手套），所有操作均须在二级生物安全柜中进行。禁止使用任何玻璃器皿或尖锐物品，禁止使用抽吸装置。所有被污染的物品在丢弃前须置于 Virox 溶液或漂白剂中至少浸泡 1 小时。使用后，所有工作表面须用 Virox 擦拭并进行 1 小时紫外线照射消毒。请注意，各机构均有其特定的生物安全规定，必须严格遵守。若发生意外暴露于 HIV 感染血液的情况，应立即向健康与安全部门报告，以便评估是否需要采取暴露后预防措施。
注意：P. falciparum 疟原虫存在不同的株系。本实验使用了ITG株系，但也可使用其他不同株系。有关冻存和复苏Plasmodium falciparum寄生虫的详细操作指南可参见MR4网站13。
1. 制备疟原虫培养用RPMI-A培养基
<ol>
	<li>通过混合950 ml的ddH2O、1包RPMI-1640粉末、6 g HEPES、2 g碳酸氢钠和1.35 mg次黄嘌呤，配制RPMI-0培养基。</li>
	<li>解冻来自两位不同供体的热灭活人血清。若使用O型红细胞（RBC）培养寄生虫，则AB型供体血清最佳，但也可使用其他类型。轻轻颠倒混匀。若血清含有颗粒物或黏稠，可在2,000 rpm离心后，使用0.45 µm滤器过滤液体部分。</li>
	<li>使用0.2 µm滤器过滤180 ml RPMI-0、20 ml人血清（每位供体各10 ml）以及0.5 ml 10 mg/ml的庆大霉素。 
	注意：人血清可能堵塞滤器，因此可能需要使用多个滤器单元。</li>
	<li>在培养基瓶上标记为RPMI-A，并注明日期及血清来源。冷藏备用。RPMI-A在冷藏时可能变浑浊，此现象正常；但若浑浊度持续增加，则提示可能存在污染。 
	注意：不同供体血清中寄生虫的生长情况可能存在差异。建议在使用前先测试所有人血清批次是否支持良好的寄生虫生长。</li>
</ol>
2. 准备用于寄生虫培养的人类红细胞
注意：献血者应为 O 型血。
<ol>
	<li>将7-10 ml血液收集到含酸性枸橼酸葡萄糖（ACD）的试管中。在标签上注明供体编号和采集日期。</li>
	<li>将血液储存于4 oC，待用。用于寄生虫培养的血液应在1个月内使用。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭试管顶部。小心移除塞子并丢弃。将血液转移至15 ml离心管中，以1,000 × g离心3分钟。通过抽吸去除血浆。</li>
	<li>用等体积的预温RPMI-0重悬红细胞，以1,000 × g离心5分钟。抽吸去除白膜层，用5 ml RPMI-0重悬，再重复洗涤2次。</li>
	<li>去除上清液，加入足量的RPMI-A，制备成体积分数为50%红细胞的混合液。</li>
	<li>储存于4 oC，待用。</li>
</ol>
3. 维持寄生虫培养
<ol>
	<li>将RPMI-A预热至37 oC。</li>
	<li>将解冻的寄生虫（解冻步骤参见MR4操作规程）放入T25培养瓶中，加入5 ml RPMI-A和75 μl洗涤后的人红细胞，使血细胞比容约为3%。注意：血细胞比容是指红细胞体积占总体积的比例。计算方法为：将压积红细胞体积除以培养基与红细胞总体积。假设解冻后的寄生虫相当于提供75 μl压积红细胞。通过向培养瓶中加入150 μl红细胞储备液（相当于75 μl压积红细胞），使总红细胞体积达到150 μl，加入5 ml培养基后，血细胞比容为3%（150 μl / 5,000 μl × 100% = 3%）。</li>
	<li>用寄生虫气体混合物（1% O2、3% CO2，余量为N2）对培养瓶充气30秒。密封后将培养瓶平放于37 oC培养箱中，以提供最大的气体交换表面积。</li>
	<li>更换培养基并检测寄生率时（需每日进行），小心移动培养瓶，避免扰动红细胞层。使用无菌未插塞的巴斯德吸管，吸取培养液，注意不要搅动血细胞层。</li>
	<li>为检测寄生率，从血细胞层中取出10 μl样品，置于载玻片上，并用另一张载玻片制备薄血膜。让玻片自然干燥。</li>
	<li>向培养瓶中加入4 ml新鲜RPMI-A，轻轻混匀，充气30秒，然后置于37 °C培养箱中。</li>
	<li>按照Hema3染色试剂盒的生产商操作说明对玻片进行染色。
	<ol>
		<li>为获得最佳染色效果，将玻片依次浸入固定液10秒、溶液I 10秒、溶液II 30秒。水洗后让玻片自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计数感染疟原虫的红细胞（染成深紫色）与总红细胞（染成粉红色）的数量来计算寄生率。总计数300个细胞以确保准确性。</li>
	<li>当寄生率达到5%时，将培养物扩增至T75培养瓶中，加入40 ml RPMI-A和500 μl红细胞。</li>
</ol>
4. 寄生虫同步化
注意：实验前一天，通过添加丙氨酸处理使寄生虫培养物同步化。只有环状体阶段的寄生虫和未感染的红细胞能够在此处理中存活。丙氨酸同步化处理可在次日获得纯化的滋养体期培养物，可用于共培养实验。务必从含有大多数环状体阶段寄生虫的培养物开始。
<ol>
	<li>通过将8.01 g丙氨酸（300 mM）和0.365 g Tris（10 mM）溶于300 ml&#160;ddH2O中来配制丙氨酸溶液。调节pH至7.4。使用0.2 μm滤器进行过滤除菌。</li>
	<li>将丙氨酸溶液预热至37 oC。</li>
	<li>离心寄生虫培养物（5 min × 1,000 × g），弃去上清液。</li>
	<li>用19倍体积的丙氨酸溶液重悬沉淀（1 ml压积红细胞加19 ml丙氨酸溶液）。室温孵育15 min。</li>
	<li>以1,000 × g离心5 min。吸除上清液。用RPMI-0洗涤一次。吸除上清液后，重悬于RPMI-A中，并将血细胞比容调整至约3%。通入气体混合物后，放回37 oC培养。 
	注意：进行共培养实验时，需至少含有5%环状体，以达到10%寄生率为最佳。</li>
</ol>
5. 共培养实验用寄生虫和红细胞的制备
<ol>
	<li>在共培养实验中，使用每3个感染疟原虫的红细胞（PfRBC）对应1个外周血单个核细胞（PBMC）的比例，以诱导炎症反应。为计算PfRBC总数，需通过3.5节所述方法制备薄血涂片以定量寄生率，并使用血细胞计数板计数每毫升培养物中的红细胞（RBC）数量以确定血细胞比容。 
	感染疟原虫的红细胞数量 = 寄生率百分比 × 每毫升总红细胞数 × 培养液体积（毫升）。例如：10毫升培养液，红细胞密度为10 × 106 个/毫升，寄生率为10%，则PfRBC总数为 0.1 × 106/毫升 × 10 毫升 = 10 × 106 个PfRBC。</li>
	<li>将疟原虫培养物在室温下以1,000 × g离心5分钟。吸除上清液后，用RPMI-S+培养基重悬，使PfRBC浓度为每毫升6 × 106 个（RPMI-S+配方：500毫升RPMI-1640培养基，添加L-谷氨酰胺和HEPES，10%热灭活胎牛血清，1.5毫升庆大霉素，5毫升100 mM丙酮酸钠，5毫升10 mM MEM非必需氨基酸混合液，5毫升5 mM β-巯基乙醇）。</li>
	<li>取对照血液（即用于维持疟原虫培养的同一供体的未感染红细胞），计算其血细胞比容，并用RPMI-S+培养基重悬，使其红细胞浓度（个/毫升）与疟原虫培养物相同。</li>
</ol>
6. 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离
<ol>
	<li>从慢性 HIV(+) 供体和 HIV(-) 对照中采集静脉血至含肝素钠的试管（绿色盖）中。不要使用 EDTA 作为抗凝剂，因为 EDTA 的钙螯合作用会影响细胞功能。通常每 10 ml 血液可获得 5-10 × 106 个 PBMC。典型实验中，从每位供体采集 30 ml 血液。血量需根据实验需求进行调整。</li>
	<li>采血后应尽快操作，且必须在 1 小时内完成。将血液从试管中取出并转移至一个塑料 50 ml 离心管中。单核细胞特别容易被激活并黏附于玻璃表面，因此若使用玻璃采血管，必须尽快将细胞转移出来。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 15 分钟，收集血浆（如需可用于其他研究；若不需要，此步骤可省略）。用等体积的冷 DPBS 稀释血液。</li>
	<li>在 50 ml 管中加入 15 ml 室温 Ficoll。使用无菌塑料移液管缓慢地将血液/DPBS 混合液叠加在 Ficoll 上层，避免混合。每 15 ml Ficoll 上最多可叠加 25 ml 血液/DPBS 混合液。</li>
	<li>以 600 × g 在室温下离心 30 分钟。确保设置为“无刹车”模式。</li>
	<li>离心后，观察两相之间的界面，PBMC 即位于此界面处。使用无菌塑料移液管从界面处收集 PBMC（见图 1），尽量减少红细胞的污染。</li>
	<li>将收集的细胞置于 50 ml 管中，每管不超过 20 ml。用无菌冷 DPBS 加至 50 ml。</li>
	<li>以 300 × g 在 4 oC 下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用 5 ml 无菌冷 DPBS 重悬，并将同一供体的所有细胞合并至同一管中。用无菌 DPBS 加至 50 ml，重复洗涤步骤再进行两次。</li>
	<li>将细胞重悬于 10 ml RPMI-S+ 培养基中。</li>
	<li>取 20 μl 细胞悬液与 20 μl 台盼蓝混合。吸取 10 μl 加入血细胞计数板，计数活细胞（未摄取蓝色染料的细胞——所有蓝色细胞均为死细胞）。使用血细胞计数板按以下方法计算溶液中的细胞数量。 
	注意：血细胞计数板具有特定尺寸的网格，其线条覆盖的面积是已知的。
	<ol>
		<li>确保血细胞计数板清洁。将盖玻片覆盖在计数区域上。通过将移液管尖插入 V 形加样口之一，加入 10 μl 细胞悬液。盖玻片下方区域将通过毛细作用自动充满液体。</li>
		<li>将加样后的血细胞计数板置于显微镜下观察。血细胞计数板的完整网格包含 9 个 1 mm2 的大方格。计数每个大方格内的所有细胞。若细胞密度过高，需进一步稀释后重新计数。</li>
		<li>按以下公式计算细胞浓度：总细胞数/ml = （计数的总细胞数/计数的大方格数）× 稀释倍数 × 10,000 细胞/ml，例如，（500 个细胞/5 个大方格）× 稀释倍数 20 × 10,000 细胞/ml = 20 × 106 个细胞总数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 RPMI-S+ 培养基调节细胞浓度至最终浓度为 10 × 106 个/ml。</li>
</ol>
7. 疟疾/艾滋病共感染培养
<ol>
	<li>将100 μl分离的PBMCs和400 μl RPMI-S+培养基加入24孔板中（每孔含1 × 106个PBMC）。确保每个条件设置三个复孔：3孔加入未感染红细胞（RBC），3孔加入疟原虫感染的红细胞（PfRBC），3孔仅加入培养基，以及3孔加入PMA/离子霉素（PMA/Ionomycin）。HIV阳性（HIV(+)）和HIV阴性（HIV(-)）样本均需如此设置。</li>
	<li>对于PfRBC孔，每孔加入3 × 106个PfRBC（即5.2步骤中制备的500 μl寄生虫培养物）。</li>
	<li>对于未感染RBC孔，每孔加入5.3步骤中制备的500 μl未感染RBC培养物。</li>
	<li>对于培养基对照孔，每孔加入500 μl RPMI-S+培养基。</li>
	<li>对于PMA/离子霉素孔，配制PMA/离子霉素溶液（终浓度分别为2.5 pg/ml和250 pg/ml），每孔加入500 μl该溶液。 
	注意：PMA和离子霉素是T细胞细胞因子分泌的强效刺激剂，作为阳性对照以确认细胞功能正常。</li>
	<li>将培养板置于37 oC、5% CO2的培养箱中孵育。</li>
	<li>可选：将多余细胞用于流式细胞术进行表型分析，或保存于RNA稳定溶液中，用于后续mRNA表达分析。</li>
</ol>
8. 疟疾免疫应答的检测
注意：共培养实验最长可持续4天，此期间无需更换培养基。最佳时间点取决于所研究的细胞类型及具体科学问题。对于单核细胞对疟原虫感染红细胞（PfRBCs）的反应，12–48小时的孵育时间为最佳；而淋巴细胞反应则在72–96小时观察效果最佳。具体时间点需根据实验目的进行优化。若关注完整疟原虫感染红细胞与外周血单个核细胞（PBMCs）之间的相互作用，可采用较短时间（2–4小时）。
<ol>
	<li>以 300 × g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。从每个孔中收集 700 μl 培养上清液。</li>
	<li>将上清液以 1,000 × g 离心 5 分钟，以去除任何碎片。</li>
	<li>根据需要分装澄清后的上清液，标记后于 -20 °C 以下冷冻保存，直至进行分泌因子分析。</li>
	<li>通过 ELISA 或微球阵列法分析细胞因子/趋化因子反应（遵循制造商推荐的实验方案）。</li>
	<li>将平板中剩余的细胞收集至 RNA 稳定溶液中，并用于通过定量实时 PCR 进行 mRNA 表达分析14-16。</li>
</ol>
9. 利用与P. falciparum感染红细胞共培养的PBMC进行细胞内流式细胞术分析细胞特异性细胞因子反应
注意：如上所述，共培养的时间长度取决于所研究的细胞类型。若关注单核细胞对疟原虫感染红细胞（PfRBC）的反应，则需要较短的孵育时间；对于先天性淋巴细胞反应（如γδ T细胞、NK细胞、NKT细胞），所需时间较长；而对于CD4和CD8 T细胞，则需要更长的培养时间。具体条件需进行优化。
<ol>
	<li>分析前 6-8 小时，向所有孔中加入 1 μl 的 1,000 倍浓度的布雷菲德菌素 A（brefeldin A），将培养板放回 37 oC 培养箱。孵育 6-8 小时后，将培养板置于冰上 15 分钟。</li>
	<li>使用剧烈吹打将细胞从孔中取出，并转移至已标记的微量离心管中。必要时可进行刮取以去除单核细胞。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。用 500 μl 流式细胞术缓冲液（1× DPBS、2% 热灭活 FBS、0.02% 叠氮化钠）重悬细胞。</li>
	<li>将细胞分装，使每个样本包含：一个用于全抗体染色的管（240 μl）和一个用于荧光减一（FMO）对照抗体染色的管（240 μl）。将每个样本少量（20 μl）合并，用于未染色的流式细胞术对照（用于流式细胞仪的设置）。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>在 50 μl 流式细胞术缓冲液中加入未偶联的抗人 CD16/CD32 抗体（5 μg/ml），4 oC 孵育 15 分钟，以阻断 Fc 受体。</li>
	<li>向每管中加入 1 ml 流式细胞术缓冲液。以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>在 50 μl 流式细胞术缓冲液中重悬细胞，并加入已预滴定浓度的荧光素偶联抗体，针对目标细胞表面标志物。预先混合足量抗体溶液以供所有样本染色。4 oC 孵育 20 分钟，避光。注意：每种抗体的用量需优化。我们常规染色 CD56、CD3、γδ&#160;、CD4、CD8、CD14。这些抗体的滴定体积见表 1。</li>
	<li>向每管中加入 1 ml 流式细胞术缓冲液。以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入 100 μl 细胞固定/透化溶液（cytofix/cytoperm solution）。4 oC 孵育 20 分钟，避光。</li>
	<li>向每管中加入 1 ml 透化/洗涤缓冲液（以 10× 浓缩液提供，用 ddH2O 稀释至 1×）。以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>向 FMO 对照抗体染色管中加入 100 μl 透化/洗涤缓冲液，并混匀以重悬细胞。</li>
	<li>向全抗体染色管中加入 100 μl 含已预滴定浓度荧光素偶联抗体的透化/洗涤缓冲液，针对目标细胞内标志物（例如，细胞因子/趋化因子）。 
	注意：每种抗体的用量需优化。我们常规使用抗 TNF 和抗 IFNγ 抗体进行染色。这些抗体的滴定体积见表 1。</li>
	<li>所有管于 4 oC 孵育 30 分钟，避光。</li>
	<li>向每管中加入 1 ml 透化/洗涤缓冲液。以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用含 1% 多聚甲醛的 300 μl 流式细胞术缓冲液重悬细胞。静置至少 15 分钟以灭活 HIV。</li>
	<li>使用补偿微珠制备单抗体染色样本，用于流式细胞仪的补偿设置。所用补偿微珠类型取决于抗体种类（例如，抗小鼠 Ig、抗大鼠/仓鼠 Ig）。涡旋混匀微珠。每种抗体加入一滴微珠。加入与染色时等量的抗体。加入 200 μl 流式细胞术缓冲液。此即制备完成，可直接使用，无需洗涤微珠。</li>
	<li>应尽快在流式细胞仪上检测样本，最好在 24 小时内完成以获得最佳结果。串联染料在储存过程中易发生解离，因此建议尽可能立即检测。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的实验方案已优化，以更真实地研究HIV与疟疾共感染 体外首先，疟原虫培养需要新鲜的人类红细胞和血清。这是获得健康疟原虫群体的关键。不能使用疟原虫裂解物替代活体疟原虫，因为使用活体疟原虫时，细胞因子的产生更为迅速且强烈。 P. falciparum 感染的红细胞（PfRBC） 17,18此外，自然杀伤细胞等细胞类型的活化需要完整的恶性疟原虫感染红细胞（PfRBC），使用疟原虫裂解物则效率低下。这可能是由于PfRBC与白细胞之间需要直接接触，或由于与细胞表面受体相互作用的疟原虫来源配体本身不稳定所致。 18疟原虫感染红细胞（PfRBC）培养物在实验前也必须充分同步化（方案4）。同步化的PfRBC可提高实验数据的可重复性。尽管本方案描述的是使用滋养体阶段的PfRBC进行共培养，但该方法可轻松修改用于环状体阶段PfRBC的研究。
人类白细胞可被人工感染HIV，该方法已用于疟疾与HIV共感染的研究20。然而，这种方法无法模拟慢性HIV感染所导致的免疫失调。在本共培养体系中，我们使用从慢性...

共感染，即同时感染多种病原体，在自然环境中是普遍现象。共感染可能对疾病病理学以及每种感染的临床管理产生重大影响。在共感染的情况下，疫苗和药物的有效性以及诊断检测结果均可能受到负面影响（详见文献1综述）。然而，尽管共感染具有重要意义，目前大多数病原体研究仍仅关注单一感染。
疟疾和人类免疫缺陷病毒1型（HIV）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。疟疾与HIV流行区域在地理分布上存在广泛重叠，使数百万人面临共感染的风险，进而增加罹患更严重临床疾病的可能性2–10。这两种疾病存在负面相互作用。在HIV感染者中，疟疾感染期间可观察到HIV病毒载量升高以及CD4+ T细胞计数暂时性下降；而在共感染个体中，疟原虫负荷以及临床疟疾和重症疟疾的风险均更高2,3,5,7,8,10。HIV加剧疟疾严重程度的机制尚未完全阐明，有待进一步研究。
在此，我们介绍一种可用于研究疟疾与艾滋病病毒共感染的方法 体外 具体而言，该方法可用于在 HIV 感染背景下检测疟疾特异性免疫应答。本方案描述了一种多功能共培养体系，使用从慢性 HIV 感染供体中新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMCs） 体外 培养的 P. falciparum 被寄生的红细胞（PfRBC）。还可利用前瞻性采集的HIV阳性供体在抗逆转录病毒治疗前后的外周血单个核细胞（PBMC），来研究该治疗对上述免疫应答的影响。
我们已利用该系统研究了HIV感染对疟疾特异性固有免疫应答的影响11,12，并确定在HIV阳性供体中，自然杀伤细胞、NKT细胞和γδ T细胞的疟疾特异性IFNγ和TNF应答在抗逆转录病毒治疗前后均受到损害。此外，我们还利用该系统发现HIV阳性供体的单核细胞功能也受到损害，但在接受抗逆转录病毒治疗后有所恢复。

<table><tbody><tr><td>丙氨酸</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>抗体（见另一表格）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 与 BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>包含布雷菲德林 A、Cytofix/Cytoperm 缓冲液和 Perm/Wash 缓冲液</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD 溶液 A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 肝素钠</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS（无钙、无镁）</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>使用前需热灭活</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素（10 mg/ml）</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 染色试剂盒</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（10 mM）</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 粉末</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（粉末，细胞培养级）</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris（Trizma 碱）</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>取决于所用抗体</td></tr><tr><td>寄生虫气体混合物</td><td>特殊订购</td><td></td><td>3% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 平衡 N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;#956;m 滤器单元</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔培养板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>未封口巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封口巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪（三激光）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于流式细胞术的抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 TNF 抗体</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC（荧光染料） 
2 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 IFN&amp;#947; 抗体</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE（荧光染料） 
20 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 CD8 抗体</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7（荧光染料） 
1 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 CD14 抗体</td><td>Biolegend; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>生物素（荧光染料） 
0.5 &amp;#956;l 
链霉亲和素 PE-TR（荧光染料） 
0.1 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 CD56 抗体</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5（荧光染料） 
5 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 &amp;#947;&amp;#948; 抗体</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC（荧光染料） 
5 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7（荧光染料） 
5 &amp;#956;l</td></tr><tr><td>抗 CD4 抗体</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Pacific Blue（荧光染料） 
1 &amp;#956;l</td></tr></tbody></table>

一个 体外 hiv共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

疟疾与艾滋病共同感染已成为日益重要的公共卫生问题。然而，目前大多数关于疟疾或艾滋病的研究主要分别针对每一种感染。尽管独立研究每种病原体的疾病动态至关重要，但同时也有必要对这些病原体之间的相互作用进行探究和理解。
我们开发了一种多功能的 体外 HIV-疟疾共感染模型用于研究HIV感染背景下宿主对疟疾的免疫应答。该模型可用于检测细胞上清液中的分泌因子、细胞表面及细胞内蛋白标志物，以及RNA表达水平。实验设计与所用方法可减少变异，提高数据的可靠性与可重复性。 
本模型中使用的所有病原体均为天然的人类病原体（恶性疟原虫 以及HIV-1），所有感染细胞均为自然感染并新鲜使用。我们使用被寄生的人类红细胞 P. falciparum 并保持连续培养 体外 培养。我们从慢性 HIV 感染的志愿者中获取新鲜分离的外周血单个核细胞。每种实验条件均设有适当的对照（P. falciparum 受感染红细胞与正常红细胞），且每位HIV感染者均有与其配对的HIV未感染对照供者，其细胞于同日采集。该模型为研究在HIV感染背景下疟原虫与人类免疫细胞之间的相互作用提供了接近真实的环境。

图中显示了NKT细胞产生IFNγ的水平（图2），通过CD56+CD3+γδ-设门获取NKT细胞群体（数据未显示）。细胞在染色前培养72小时。染色后，在流式细胞仪上采集100,000个CD3+细胞，以获得足够数量的NK、NKT和γδ细胞（目标细胞）。每张图中至少显示5,600个NKT细胞。TNF的产生采用相同方法检测（数据未显示）。图中结果清楚表明，在暴露于PfRBC的情况下，HIV阳性个体来源细胞的IFNγ产生水平低于HIV阴性个体。
流式细胞术分析具有较强的主观性，因此为每个实验设置所有适当的对照至关重要（见图2）。背景水平通过FMO样本进行计算，从而能够真实反映细胞因子染色结果。使用PMA/离子霉素刺激的细胞作为阳性对照（数据未显示）。PMA和离子霉素是T细胞产生细胞因子的强效刺激剂。若这些样本中未检测到IFNγ的产生，则很可能是染色方案存在问题，但也可能与其他因素有关，例如细胞活力下降或试剂失活。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

人类共感染难以复制 体外然而，人类疟原虫可被轻易地进行体外培养 体外，新鲜分离的自然感染HIV的人类外周血单个核细胞亦可如此。这为研究HIV共感染背景下疟原虫的早期免疫应答提供了一个极佳的模型。

一个 体外 HIV共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

疟疾与艾滋病共感染是一个日益突出的公共卫生问题。然而，目前大多数关于疟疾或艾滋病的研究主要集中于单一感染。

以下实验的总体目标是在慢性 HIV 感染背景下观察对疟疾的先天免疫应答。该目标通过以下步骤实现：首先在人红细胞中培养活的 P. falciparum 寄生虫，随后将来自 HIV 阳性个体和未感染者的外周血单个核细胞与感染疟原虫的红细胞共培养。最终，通过流式细胞术分析，评估与未感染对照者相比，艾滋病病毒感染者先天免疫细胞的细胞因子活性。该方法有助于解答共感染领域的关键问题，例如，像艾滋病病毒这样的某种感染的存在，会对疟疾等其他感染的免疫应答产生何种影响？为同步寄生虫发育周期，离心收集寄生虫培养物，并在室温下用19体积的37摄氏度丙氨酸溶液裂解沉淀中的滋养体阶段寄生虫。15分钟后，用RPMI培养基将细胞离心洗涤两次。第二次洗涤后，将红细胞压积调整为RPMI-A中的3%。然后对培养瓶进行气体饱和处理，并将其放回37°C培养箱中，直至滋养体达到5%至10%的寄生率，以计算样品的寄生率。从血层中取10 µL样品滴加到载玻片上，待血液干燥后，用另一张载玻片制备血液薄层涂片。根据制造商的说明书，使用HEMA三步染色试剂盒对玻片进行染色。为计算感染红细胞的总数，在光学显微镜下计数300个细胞，并比较深紫色染色的寄生红细胞与浅粉色未感染细胞的数量，以确定血细胞比容。使用血细胞计数板确定每毫升寄生虫培养液中的红细胞数量。然后再次离心寄生虫培养液，并将细胞重悬于RPMI-S Plus中，使其浓度为每毫升含6×10⁶个感染红细胞，用于分离来自HIV阳性或HIV阴性供体的人外周血单个核细胞（PBMC）；将血液样本与等体积的冷DPBS稀释。接着，将15毫升室温的Fial加入每个50毫升离心管中。加入25毫升血液DPBS溶液，随后小心地将最多25毫升的血液与DPBS溶液进行分层。使用无菌塑料移液管通过离心分离细胞，然后使用无菌塑料移液管从界面处收集PBMC。将最多20毫升的PBMC分装至各个50毫升离心管中。然后用无菌冷 DPBS 将每管的总体积补至 50 毫升。再次离心沉淀细胞，最终洗涤后，用 50 毫升新鲜无菌 DPBS 重悬沉淀，再进行两次洗涤。将细胞重悬于 10 毫升 R-PMI-S plus 中用于计数，然后将 PBMC 调整至 R-PMI-S plus 中终浓度为 10 × 10⁶ 个细胞/毫升，以建立共感染体系。培养开始时，将1 × 10⁶个新分离的HIV阳性或HIV阴性外周血单个核细胞（PBMC）接种于24孔板中，每孔加入100 µL RPMI完全培养基。随后每孔加入400 µL RPMI完全培养基，使每孔总体积达到500 µL。然后，在每孔总体积为500 µL的条件下，分别向HIV感染和未感染细胞中加入3 × 10⁶个未感染红细胞或3 × 10⁶个寄生虫感染的红细胞，每个处理设三个重复。将共感染培养板置于细胞培养箱中培养。随后，在适当的实验时间结束后，离心收集细胞沉淀，并从每份样品中取出700 µL培养上清液。将上清液充分离心以去除任何残渣，然后根据需要对样品进行分装。标记试管，并于-20 °C或更低温度下冷冻保存，以备后续分析。在进行细胞特异性细胞因子产生分析前6至8小时，在孵育结束时，每孔加入一微升浓度为1000 D的felden。将培养板置于冰上15分钟。然后使用无菌移液器将细胞从培养板底部收集，并转移至已标记的微量离心管中。离心沉淀细胞后，用500 µL流式细胞术缓冲液重悬细胞沉淀。将细胞分装，使每个样本至少含有一管用于完整的抗体染色。一个用于荧光减一对照抗体染色的试管还需包含一个未染色的流式细胞术对照。随后，在50 µL流式细胞术缓冲液中，使用预先滴定浓度的荧光素标记四联抗体，针对目标细胞表面标志物，在4°C避光条件下对完整抗体染色组和荧光减一对照组细胞进行标记，孵育20分钟后完成。用一毫升流式细胞术缓冲液洗涤样本，并向每管中加入100微升胞内固定与透化溶液。在4摄氏度避光条件下孵育20分钟后，用一毫升透化洗涤缓冲液洗涤细胞，离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于100微升透化洗涤缓冲液中，随后向其中加入预先滴定浓度的荧光素4标记抗体，以针对目标胞内标志物进行全抗体染色。将所有试管在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。然后每管加入一毫升通透洗涤缓冲液洗涤样本。最后将沉淀重悬于 300 微升流式细胞术固定缓冲液中，加入 1% 多聚甲醛固定 15 分钟，以在流式细胞术分析前中和 HIV。在这些图中，展示了 HIV 阳性与 HIV 阴性个体的自然杀伤 T 细胞在暴露于疟原虫感染的红细胞或对照未感染红细胞后，干扰素 γ 的产生水平。需要注意的是，与 HIV 阴性个体的外周血单个核细胞（PBMC）在寄生红细胞存在时表现出强烈的细胞因子产生相比，HIV 阳性 PBMC 对疟原虫感染的先天免疫反应受到抑制，表现为缺乏干扰素γ的产生。因此，请务必牢记，操作 HIV 时具有极高危险性，在进行这些实验方案时，必须采取相应预防措施，例如在二级生物安全柜中完成所有操作步骤、穿戴适当的防护装备，并避免使用玻璃锐器和抽吸装置。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

一个<em&gt;体外</em&gt;模型在HIV合并感染的背景下测量免疫应答疟疾

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疟疾-HIV共感染体外细胞培养模型的建立

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体外检测免疫调节通路对HIV特异性CD4 T细胞效应功能影响的实验方法

结核病和疟疾是人类中最常见的两种感染性疾病，也是热带地区贫困人群中发病和死亡的主要原因。我们建立了一个实验模型系统，用于研究小鼠经自然感染途径同时感染疟原虫和结核分枝杆菌后，疟疾-结核共感染的结果。...

一种用于研究结核病与疟疾共感染的实验模型——基于自然传播途径 结核分枝杆菌 和 疟原虫伯氏疟原虫

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基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

本方案的总体目标是指导如何测定自然暴露于恶性疟原虫（Plasmodium...

测量自然获得性诱导吞噬作用的抗体 恶性疟原虫 基于流式细胞术的寄生虫检测方法

在此，我们介绍一种新方法，以帮助阐明细胞免疫的机制 疟原虫 感染的血液阶段。这是一个 体外...

体外检测细胞毒性淋巴细胞杀伤疟原虫感染红细胞的实验

了解在HIV合并感染背景下疟疾的先天免疫应答研究方法。通过共培养恶性疟原虫与外周血单个核细胞，利用流式细胞术分析细胞因子活性，为HIV与疟疾共感染机制研究提供重要实验模型。

一个体外 HIV共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

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一个 体外 HIV共感染背景下测量疟疾免疫反应的模型

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