Name: 对于DNA折纸分析和实验准备云母和硅衬底 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学习DNA折纸实验中云母和硅衬底的可重复清洁方法，包括胶带剥离、RCA清洗和表面功能化步骤。掌握这些技术可提高纳米结构制备质量，为DNA纳米技术研究提供可靠实验基础。

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作者感谢 Gary Bernstein 博士提供原子力显微镜的使用。

1. 实验设计与材料准备
<ol>
	<li>确定实验中所用DNA折纸的结构设计、浓度和功能特性。14-16 本实验采用在1x TAE/Mg2+溶液（40 mM Tris碱，20 mM乙酸，2 mM EDTA和12 mM乙酸镁，pH 8.0）中制备的DNA折纸矩形结构。17</li>
	<li>对所有将使用的枪头、离心管和容器进行高压灭菌。这些材料必须均可耐受高压灭菌处理。</li>
	<li>准备用于冲洗的无菌水。取约500 ml的18 MΩ·cm水加入无菌广口瓶中，置于加热板上，打开瓶盖煮沸5分钟，随后将瓶体移离加热板，在瓶盖盖上但不旋紧的条件下冷却。冷却后置于冰箱中保存，并每月或在必要时重新制备新鲜溶液。</li>
</ol>
2. 准备云母基底
<ol>
	<li>用剪刀将基底材料切割成适当尺寸（1 cm × 1 cm 的正方形）。云母薄而脆。或者，可直接购买无需切割的圆片状云母。</li>
	<li>使用双面胶带剥离云母。云母由层状矿物构成，各层之间通过插入的离子分隔，当双面胶带粘附其上时，可逐层剥离。18
	<ol>
		<li>将云母片置于仍保留在胶带座中的双面胶带上，确保其牢固粘附。用镊子小心地插入云母片与胶带之间，最上层云母将被剥离并留在胶带上。剥离后，云母片的洁净面会朝下。在将云母片存入容器前，务必将其翻转。</li>
		<li>重复此操作三到四次，以确保完全去除最上层并充分清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，也可先用一块双面胶带将云母固定在容器或台面上，再用另一块胶带粘住并剥离最上层云母。两种方法均可有效清洁云母，但替代方法因云母需二次粘附于支撑物上，使得后续DNA沉积以及样品的冲洗和干燥操作较为困难。</li>
</ol>
3. 将DNA折纸沉积在云母上
<ol>
	<li>简而言之，使用涡旋混合器短暂混匀DNA折纸试剂管，以确保纳米结构在溶液中均匀分散。</li>
	<li>用移液器将4 µl溶液滴加到云母表面，注意移液枪头不要接触基底。让DNA折纸在云母上静置约10分钟，以确保充分覆盖。沉积时间将根据所用DNA折纸的浓度以及所需的覆盖密度而有所变化（图2和图3）。
	<ol>
		<li>在水槽或其他液体容器上方，用100 µl无菌水冲洗云母基底上的DNA折纸溶液。使用镊子夹起云母片，将水滴加到基底表面，并使液流方向朝向镊子尖端。通过快速向下甩动的方式震落多余水分。保持镊子竖直，使残留水分流向镊子方向，以避免样品污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用稳定的氮气（N2）气流吹干基底1分钟，确保去除所有多余水分。再用额外的100 µl无菌水重复冲洗一次。再用N2吹干基底额外3分钟。完全干燥的基底是成功进行原子力显微镜（AFM）分析的必要条件（图4）。</li>
	<li>使用AFM分析基底，或将其存放在密闭容器中。</li>
</ol>
4. CMOS/硅片清洗装置
<ol>
	<li>警告：使用 CMOS 装置时，必须始终佩戴个人防护装备。所用试剂包括强酸、强碱、氢氟酸（HF）和强氧化剂，若未妥善处理，这些试剂可能与废溶剂发生反应。请遵守以下安全预防措施：
	<ol>
		<li>将 CMOS 实验台置于专用化学通风橱内，不得与其他实验过程或装置共用。</li>
		<li>使用 CMOS 实验台时，必须始终佩戴腈手套、实验服、护目镜、大型工业用腈手套、防溅围裙和面罩。</li>
		<li>配制溶液时，使用塑料托盘作为二级防漏容器。</li>
		<li>处理浓氢氟酸时，应使用惰性氟化聚合物材质的量杯。</li>
		<li>备有葡萄糖酸钙软膏，以应对皮肤接触事故作为急救措施。</li>
		<li>仅允许经过适当培训的人员操作该流程。</li>
		<li>实验过程中应确保实验室其他成员在场，以应对紧急情况。</li>
		<li>将所有化学品的材料安全数据表（MSDS）放置在通风橱附近。</li>
		<li>熟悉所在机构或公司的化学品泄漏和暴露处理规程。 
		注意：氢氟酸可迅速穿透皮肤，并具有螯合钙离子的特性，一旦接触可能影响骨骼并损伤神经。皮肤接触数毫升浓氢氟酸即可能造成严重甚至致命伤害。必须采取必要预防措施，杜绝暴露风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在两个独立的 250 ml 玻璃烧杯中，分别置于两个加热磁力搅拌器上进行 RCA1 和 RCA2 步骤。每个烧杯中均应放入一个搅拌子。使用固定好的温度计监测溶液温度，确保搅拌子不会撞击温度计感温泡。用表面皿盖住烧杯，以减少蒸发影响。</li>
	<li>RCA1 溶液配制
	<ol>
		<li>使用量杯向指定的 RCA1 烧杯中加入 50 ml 18 MΩ·cm 水。</li>
		<li>向烧杯中加入 15 ml 浓氨水（NH4OH）。用 25 ml 水冲洗量杯，并将冲洗液倒入 RCA1 烧杯中。</li>
		<li>开启加热磁力搅拌器的加热和搅拌功能，将 RCA1 溶液加热至 70 °C。</li>
		<li>向 RCA1 烧杯中加入 15 ml 30% 过氧化氢（H2O2）。H2O2 加入后应在 1 小时内使用该溶液。若每次使用前补充 15 ml 过氧化氢，该溶液可在三天内重复使用多次。</li>
		<li>用大量水彻底冲洗量杯，并将冲洗液倒入指定的 RCA1 废液瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RCA2 溶液配制
	<ol>
		<li>使用已彻底冲洗干净的量杯，向指定的 RCA2 烧杯中加入 70 ml 18 MΩ·cm 水。</li>
		<li>加入 15 ml 浓盐酸（HCl）。用 20 ml 水冲洗量杯，并将冲洗液加入 RCA2 烧杯中。</li>
		<li>提高加热磁力搅拌器的加热功率和搅拌速度，使溶液升温至 70 °C。</li>
		<li>加入 15 ml 30% H2O2。与 RCA1 溶液相同，H2O2 加入后应在 1 小时内使用；此外，若每次使用前补充 15 ml H2O2，该溶液可在三天内重复使用多次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HF 溶液配制
	<ol>
		<li>在惰性氟化聚合物烧杯中加入 50 ml 水。</li>
		<li>用塑料量杯量取 4 ml 浓氢氟酸（49%），并将其加入惰性氟化聚合物烧杯中。</li>
		<li>用总共 50 ml 水冲洗塑料量杯，并将冲洗液加入 HF 烧杯中。随后用大量水彻底清洗量杯，并将清洗液倒入指定的 HF 废液容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 准备和清洗硅基底
<ol>
	<li>将硅晶圆切割成芯片
	<ol>
		<li>在硅晶圆的平整抛光表面上识别出垂直和平行的晶格方向。这些方向有助于更轻松地进行解理以形成方形。以下说明适用于解理硅 &#60;110&#62;，可能不适用于其他晶体取向。</li>
		<li>将硅晶圆抛光面朝上放置在柔软的表面（如纸巾）上。使用带金刚石尖端的划片笔，在晶圆底部沿主平边轻轻划出小缺口。在缺口下方放置一根细金属丝（例如回形针），然后用手指或镊子在缺口两侧轻轻向下施加压力。这样可使晶圆沿晶格线在自然解理方向上裂开为两半。</li>
		<li>在另一张纸巾上，用铅笔和直尺测量所需方块的宽度，并在纸巾的顶部和底部标记出对应点，再用直线连接这些点，作为切割均匀方形的参考线。</li>
		<li>将其中一半晶圆的边缘对准纸巾上已画好的测量线，并紧贴线条放置，然后重复步骤 5.1.2。新断裂的垂直部分即为所需解理方块的宽度。接着将晶圆在纸巾上水平旋转，将其置于垂直标记线之间，再次重复步骤 5.1.2 的操作。</li>
		<li>将新解理的硅片芯片存放在装有去离子水的洁净小瓶中，以防刮伤。硅芯片可长期保存，但在开始实验前应重新清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硅的 CMOS 清洗
	<ol>
		<li>当 RCA1 溶液达到适当温度后，使用直径为 2&#34; 的惰性氟化聚合物篮，将 8 至 10 片 1 cm × 1 cm 的硅芯片浸入溶液中。芯片表面和烧杯壁上会形成氧气气泡。若无气泡产生，则表明 H2O2 已降解。将芯片在溶液中浸泡 10 至 20 分钟，每隔几分钟上下轻轻晃动篮子，防止芯片粘连。</li>
		<li>提起装有硅芯片的篮子，充分沥干。将篮子移至废液烧杯上方，用 18 MΩ × cm 水彻底冲洗。将篮子浸入清洗烧杯中，并上下晃动 20 秒。沥干篮子后，在废液烧杯上方再次用大量水彻底冲洗。将废液烧杯中的液体倒入指定的 RCA1 废液瓶中，并重新加满水。</li>
		<li>RCA1 清洗完成后，将篮子放入 1:50 的 HF 烧杯中处理 10 至 20 秒。轻轻上下晃动以混合芯片与 HF 溶液。提起浸渍桶，使 HF 完全流尽。 
		注意：芯片表面应呈疏水性；水无法润湿芯片表面，而是形成具有高接触角的水滴。这表明二氧化硅层已被蚀刻去除，芯片表面现由 Si-H 键终止。</li>
		<li>将清洗烧杯和漂洗烧杯放入塑料托盘中，将篮子移至漂洗烧杯上方，用 18 MΩ × cm 水冲洗。随后将篮子浸入清洗烧杯中，搅动 20 秒。</li>
		<li>使用 18 MΩ × cm 水完成第二次沥干和漂洗循环。将清洗水倒入漂洗烧杯中，重新向清洗烧杯加满水。将所有废液倒入指定的塑料 HF 废液瓶中。</li>
		<li>当 RCA2 溶液达到适当温度后，用篮子将硅芯片浸入溶液中。浸泡 10 至 20 分钟。此时芯片表面将变为亲水性，因其表面已生长出一层薄（1–2 nm）的氧化膜。</li>
		<li>在适当时间后取出芯片，按照与 RCA1 相同的漂洗程序进行操作。将废液倒入指定的 RCA2 废液容器中。用塑料镊子逐个取出芯片，用水冲洗后用氮气吹干。</li>
		<li>将芯片存放在塑料晶圆盒中或装有 18 MΩ × cm 水的小瓶中。清洗后的硅芯片在水中可保持清洁约三天。确保工作区域已妥善清理，并清洗 CMOS 手套外部。将 CMOS 手套留在通风橱内晾干。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 在APTES功能化的硅表面沉积DNA折纸结构
<ol>
	<li>硅表面自组装单分子层的形成
	<ol>
		<li>在打开试剂瓶前，将 APTES 恢复至室温。若瓶体温度过低，可能产生冷凝水，导致 APTES 在储存过程中发生水解。取 1,980 µl 的 18 MΩ·cm 水和 20 µl APTES，加入洁净的闪烁瓶中，轻轻旋转混匀。该溶液需立即使用。</li>
		<li>将清洗后的硅片反光面朝上放入闪烁瓶中，盖上瓶盖，静置20分钟。用镊子取出硅片，用200 µl水冲洗，并用氮气流吹干1分钟。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在APTES功能化硅表面沉积DNA折纸结构 
	注意：DNA折纸在功能化硅表面的沉积步骤与在云母表面的沉积步骤类似。
	<ol>
		<li>轻轻混匀DNA折纸溶液，取4 µl滴加到硅基底上。如有需要，可增加DNA折纸溶液的用量，以完全覆盖基底，因为功能化硅基底比云母基底更具疏水性。使用玻璃盖玻片压平沉积液，防止长时间沉积过程中溶液蒸发。</li>
		<li>让溶液静置所需时间，以达到所用浓度和期望覆盖度的要求（参见 图2 和 3 （用于研究时间和浓度对表面覆盖率的影响）。用100 µl无菌18 MΩ·cm水冲洗基底，并用N₂吹干2 1 分钟。</li>
		<li>用额外的 100 µl 无菌水重复清洗，并用 N 干燥基底2 3 分钟</li>
		<li>将样品存放在洁净的容器中，直至进行后续实验或成像。样品在储存约一至两周后开始出现颗粒物聚集，具体时间取决于样品的处理频率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. DNA折纸样品的原子力显微镜成像与图像分析
<ol>
	<li>使用原子力显微镜（AFM）在空气中轻敲模式下进行成像。与接触模式相比，轻敲模式可确保对脆弱的纳米结构施加最小的作用力。 
	注意：成像参数将取决于所用仪器。所有展示的图像均使用MultiMode Nanoscope IIIa采集。</li>
	<li>选择适用于空气中非接触/轻敲模式的AFM探针，探针应具有金反射涂层，标称共振频率约为300 kHz，力常数为40 N/m，针尖半径&#60;10 nm。</li>
	<li>使用NanoScope Analysis软件处理和分析AFM图像。使用ImageJ进行覆盖率计算。19</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为获得稳定且理想的结果，有几个步骤需要特别强调。对于云母样品，严格按照步骤3.3和3.4所述进行彻底的清洗和干燥，可确保利用原子力显微镜（AFM）获得单个DNA折纸结构的高质量图像，避免出现代表性结果部分所述的各种问题。对于硅样品，基底的清洁度至关重要。严格且细致地执行步骤5.2中所述的清洗程序，可确保获得适当清洁的二氧化硅表面。此外，监测化学品（如过氧化氢、氢氟酸和APTES）的质量和有效性，将有助于确保实验过程顺利进行。
所描述的技术不仅限于APTES的水溶液。可通过使用APTES与三甲基氨基丙基三甲氧基硅烷氯化物（TMAC）的混合单层来调节硅表面电荷，从而促进DNA折纸结构的可变性黏附11。TMAC含有永久带正电的末端季胺基团–N(CH3)3+，而APTES的电荷则依赖于pH值。由于溶液环境不影响TMAC的质子化状态或电荷，因此通过改变TMAC在溶液中的浓度，可调节混合单层的表面电荷，进而影响基底与DNA折纸结构之间的相互作用。实验观察到，当单层表面电荷在0.75–1.5 电荷/nm<su...

DNA折纸技术于2006年首次提出，利用DNA寡核苷酸的自组装特性，可构建出可设计且高度有序的纳米结构。1 已有大量结构被报道，从笑脸图案到带锁扣的三维盒子不等。2 DNA折纸可通过与多种生物分子和纳米结构功能化，从而在纳米电子学、医学和量子计算等领域产生研究应用。3 然而，其分析及许多未来应用不仅依赖于结构设计，还依赖于DNA折纸纳米结构在表面的吸附。本文所述方法涉及在两种基底上制备DNA折纸样品：云母和功能化二氧化硅。
云母是DNA折纸研究中首选的基底材料，因为它具有原子级平整的表面，层高为0.37 nm ± 0.02 nm4。云母还易于清洗，使样品制备和原子力显微镜（AFM）研究变得简便。多硅白云母的每个解理面上均含有高密度的钾离子，但当其处于水中时，这些离子会从云母表面扩散离去。为了介导DNA折纸结构与云母基底的结合，使用Mg2+来中和云母表面的负电荷，并通过静电作用将DNA的磷酸骨架与基底结合（图1A）5。在退火DNA中加入大量过量的短链（staple strands），可在云母表面获得高覆盖率和高质量的图像，这是因为DNA折纸结构在Mg2+修饰的表面上的吸附力远强于单链寡核苷酸（短链）的吸附力。其他带正电荷的离子，如Ni2+和Co2+，也可用于调控DNA在云母上的吸附行为6,7。调节溶液中单价和二价阳离子的浓度，可调控DNA折纸结构的吸附行为及表面扩散速率8。然而，在已发表的文献中，云母基底的制备以及折纸结构的沉积与冲洗步骤往往未被明确描述9。若缺乏清晰的实验方案，将难以获得可重复的实验结果。
云母是一种绝缘体，因此不适合作为纳米电子学中某些应用的基底材料。经薄原生氧化层钝化的硅具有理想的电子特性，可与先前的互补金属氧化物半导体（CMOS）工艺兼容，用于构建输入/输出结构和形貌特征。在空气中储存的硅片表面通常被较厚的热氧化层或较薄但污染较重的原生氧化膜所钝化，颗粒物含量较高。与云母相比，二氧化硅的表面电荷密度低得多，且其电荷密度高度依赖于氧化层的制备方法和历史。当镁离子浓度高于150 mM时，可在经氧等离子体处理的硅基底上实现矩形DNA折纸结构的良好覆盖（最高达4/µm2）；然而，该浓度和覆盖度可能随所用纳米结构的尺寸和设计而变化。10 调控表面电荷的另一种方法是在氧化层上修饰一层带正电的自组装单分子层——3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（图1B）。APTES上的伯胺基团在pH值低于9时可发生质子化，从而改变基底的电荷性质和疏水性。11 为成功沉积完整的APTES单分子层，必须采用美国无线电公司（RCA）标准清洗流程对硅片进行适当清洗。该流程包括使用氢氧化铵与过氧化氢溶液处理（RCA1），以去除有机残留物和颗粒污染物；随后用稀氢氟酸水溶液短暂刻蚀，以去除原生氧化层及附着于其上的离子污染物；最后，样品经盐酸与过氧化氢溶液处理（RCA2），以去除金属和离子污染物，并形成一层薄而均匀的氧化层。12 大多数洁净室都设有专用于CMOS清洗流程的通风橱，并对这些区域内的使用物品有严格规定。常见的问题是钠等离子，它们可在能带中间引入陷阱态，从而破坏CMOS结构的电子性能。13 DNA折纸制备和沉积缓冲液中常用的离子可能污染CMOS清洗液，给其他使用洁净室的研究人员带来问题。因此，我们课题组使用一个专门设置的“非洁净级”CMOS清洗台，专用于DNA折纸研究中的小尺寸样品处理。该方法是传统洁净室配置的良好替代方案，可能适用于不具备洁净室CMOS工作台的实验室。

<table><tbody><tr><td>Eppendorf epT.I.P.S. 补充装，容量 2-200&amp;nbsp;&amp;mu;l</td><td>VWR International, LLC</td><td>22491733</td><td>每盒 96 个吸头，共 10 盒补充装</td></tr><tr><td>微量离心管，聚丙烯材质</td><td>VWR International, LLC</td><td>87003-290</td><td>0.65 ml，透明色</td></tr><tr><td>Research Plus 单通道移液器 - 20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l</td><td>A. Daigger &amp;amp; Company, Inc.</td><td>EF8960F-3120000054 EACH</td><td>可调体积</td></tr><tr><td>Research Plus 单通道移液器 - 2-20&amp;nbsp;&amp;mu;l</td><td>A. Daigger &amp;amp; Company, Inc.</td><td>EF8960D-3120000038 EACH</td><td>可调体积</td></tr><tr><td>Scotch 237 永久性双面胶带</td><td>Office Depot, Inc.</td><td>602710</td><td>3/4&quot; x 300&quot;，每包 2 卷</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Thermo Scientific</td><td>M37610-33Q</td><td></td></tr><tr><td>单片晶圆容器，2&quot;（50 mm），60 mm x 11&amp;nbsp;mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64917-2</td><td>每包 6 个</td></tr><tr><td>6&quot; 晶圆，P 型，&amp;lt;100&gt; 取向，带主定位边</td><td>Nova Electronic Materials, Ltd.</td><td>GC49266</td><td></td></tr><tr><td>无粉丁腈检查手套</td><td>VWR International, LLC</td><td>82062-428</td><td>目录号对应大号尺寸</td></tr><tr><td>高精度非接触式探针，带金反射涂层</td><td>K-Tek Nanotechnology, Inc.</td><td>HA_NC/15</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌锅盘</td><td>A. Daigger &amp;amp; Company, Inc.</td><td>NAL692-5000 EF25341C</td><td></td></tr><tr><td>Sol-Vex II 耐腐蚀手套，尺寸：9-9.5；15 mil，13 英寸 - 1 打</td><td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>106-15055</td><td>使用前需用水冲洗并相互揉搓，直至手套表面无气泡产生。</td></tr><tr><td>PTFE 镊子，200 mm，方形头</td><td>Dynalon Corp.</td><td>316504-0002</td><td></td></tr><tr><td>云母片，V-5 级品质</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71850-01</td><td>每包 10 片</td></tr><tr><td>云母圆片，10 mm</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>50</td><td>云母圆片为可选配件</td></tr><tr><td>玻璃刻划笔，金刚石笔尖</td><td>VWR International, LLC</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶，硼硅酸盐玻璃材质，带螺口盖 - 20 ml</td><td>VWR International, LLC</td><td>66022-060</td><td>每箱 500 个，配有聚丙烯盖和纸浆箔衬垫</td></tr><tr><td>4 x 5 英寸顶部 PC-200 加热板，120 V/60 Hz</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>6759-200</td><td></td></tr><tr><td>直壁广口玻璃罐</td><td>VWR International, LLC</td><td>89043-554</td><td>每箱 254 个，瓶盖配有纸浆/乙烯基衬垫</td></tr><tr><td>标准级玻璃烧杯，250 ml 容量</td><td>VWR International, LLC</td><td>173506</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 烧杯</td><td>VWR International, LLC</td><td>89026-022</td><td>用于氢氟酸操作</td></tr><tr><td>浅型表面皿，3&quot;</td><td>VWR International, LLC</td><td>66112-107</td><td>每箱 12 个</td></tr><tr><td>塑料储存容器</td><td>VWR International, LLC</td><td>470195-354</td><td>用作二级容器</td></tr><tr><td>通用型液体玻璃温度计</td><td>VWR International, LLC</td><td>89095-564</td><td></td></tr><tr><td>高精度超细镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>78310-0</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯面罩</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>氯丁橡胶围裙</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>19-810-609</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙，Calgonate</td><td>W.W Grainger, Inc.</td><td>13W861</td><td>管装，25 g</td></tr><tr><td>过氧化氢 30%，CR ACS，500 ml</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>H325 500</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIA0610.0-25GM</td><td>使用前需升温至室温。</td></tr><tr><td>氢氧化铵，2.5 L</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A669-212</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A144-212</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>氢氟酸</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td>A147-1LB</td><td>有害，有毒</td></tr><tr><td>MultiMode Nanoscope IIIa</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td></td><td>任何具备轻敲模式功能的原子力显微镜均适用于分析</td></tr><tr><td>浸渍篮</td><td>实验室自制</td><td>实验室自制</td><td>浸渍篮由带钻孔的 PTFE 瓶底、PTFE 手柄及全部 PTFE 螺钉制成。</td></tr></tbody></table>

用于dna折纸分析与实验的云母和硅基底的制备

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

DNA折纸结构的设计特性及其可控的单釜合成方法为诸多领域（尤其是纳米电子学）提供了令人振奋的机遇。这些应用中的许多都需要DNA纳米结构与基底之间的相互作用和粘附。由于云母具有原子级平整且易于清洁的特性，它一直是DNA折纸实验中首选的基底材料。然而，与半导体基底相比，云母的实际应用相对有限。因此，本文介绍了一种在经修饰的二氧化硅表面实现DNA折纸结构粘附的简单、稳定且可重复的方法。为了促进DNA纳米结构在二氧化硅表面的粘附，采用从水溶液中沉积3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）自组装单分子层的方法，该溶液与多种光刻胶兼容。基底必须通过美国无线电公司（RCA）清洗工艺去除所有有机物和金属污染物，并蚀刻掉天然氧化层，以确保获得平整且可功能化的表面。洁净室虽配备有硅片清洗设施，但DNA折纸缓冲液和溶液中的许多组分常因污染风险而不被允许带入洁净室。本论文描述了适用于无法进入洁净室或希望避免污染洁净室CMOS工作台的研究人员在实验室内进行小规模硅片清洗的设备配置和操作流程。此外，还讨论了调控覆盖度的相关变量，并阐述了如何识别和避免样品制备过程中常见的问题。

决定DNA折纸在基底上覆盖程度的两个变量是溶液浓度和孵育时间。此前已有文献报道DNA折纸在云母和APTES功能化二氧化硅表面的吸附特性13。表1和图2总结了沉积溶液中DNA折纸浓度与其在云母表面最终覆盖程度之间的关系，显示浓度越高，覆盖程度越高。图3展示了结合过程的时间依赖性。此前已对表面覆盖程度开展研究，以量化DNA折纸在云母及修饰二氧化硅表面的结合行为。在12 mM镁离子存在下，将DNA折纸溶于1x TAE缓冲液中，经30分钟表面吸附后，在云母上的覆盖程度达到83.3% ± 3.1%。在经APTES自组装单分子层（SAMs）修饰的二氧化硅表面，最大覆盖程度出现在60分钟时，但其值低于云母表面的最大覆盖程度。若需在APTES功能化的二氧化硅表面实现较高的表面覆盖，则需要更长的沉积时间。
有多种变量可能导致样品制备效果不佳。其中最棘手的问题是冲洗和干燥不充分。如果缓冲液未彻底冲洗干净，基底上会形成较大的聚集体（图4A）。当纳米...

本文描述了用于DNA折纸研究的基底可重复清洁流程，包括台式RCA清洁和二氧化硅的衍生化处理。同时图示了表面制备、DNA折纸沉积、干燥参数以及简单实验装置的操作方案。

用于DNA折纸分析与实验的云母和硅基底的制备

DNA折纸结构的设计特性及其可控的一锅法合成，为诸多领域特别是纳米电子学带来了广阔前景。许多……

以下实验的总体目标是为 DNA 纳米结构实验制备两种类型的基底：云母（MICA）和功能化的二氧化硅。这两种基底通过两种不同的方法进行处理。通过使用双面胶带快速简便地剥离云母表面的顶层来实现对 MICA 的处理。相反，硅基底必须使用RCA清洗法进行清洗，该方法包括蚀刻氧化层以及去除金属和有机污染物。这将形成一层洁净、光滑的二氧化硅层，可进一步进行功能化修饰。接下来，用镁离子处理云母表面，以形成带正电荷的表面。通过在二氧化硅基底上形成带正电荷的自组装单分子层（例如三氨基丙基三乙氧基硅烷），可构建出类似的表面。随后，将该基底暴露于DNA折纸结构溶液中，以促进带负电荷的DNA与带正电荷的基底之间的黏附。覆盖程度取决于基底类型、溶液浓度和沉积时间等因素，这些参数可根据具体实验需求进行调整。该技术的主要优势在于APT为单分子层，并通过共价键与硅表面结合。可通过电子束光刻和一种称为分子剥离的技术将其沉积成特定图案。通常，初次接触该方法的研究人员在操作微小基底所需的特殊操控技术，以及优化沉积和绘制过程的适当方案方面会遇到困难。该方法的可视化演示至关重要，因为基底操作、RCA清洗及安全操作步骤难以通过文字准确描述。直观展示这些必要的安全步骤对于促进实验室安全操作具有重要意义。首先，使用剪刀从云母基底上裁剪出一厘米见方的小片作为基底材料。使用双面胶带切割云母片。将云母片矩形置于胶带架中的双面胶带上。小心地将镊子插入云母片与胶带之间，取下云母片。最上层将被移除并留在胶带上。然后用移液枪吸取4 µL充分涡旋混匀的DNA折纸溶液，滴加到云母表面，注意移液枪枪头不要接触基底。让DNA折纸在云母上静置约10分钟。为确保充分覆盖，使用 100 微升无菌水在水槽或其他液体容器上方冲洗 MICA 基底上的 DNA 折纸溶液。操作时，用镊子夹住 MICA 基底，将水滴加到基底表面，并使液滴流向镊子尖端。用稳定的氮气流吹干基底一分钟。在用氮气进一步干燥基底三分钟之前，先加入额外的 100 微升无菌水重复进行 RINs 操作。对于美国无线电公司（RCA）溶液一的配制，使用量筒量取 50 毫升 18 兆欧·厘米水，加入指定的 RCA 溶液一烧杯中，然后向烧杯中加入 15 毫升浓氢氧化铵。用 25 毫升水冲洗量杯，并将冲洗液加入 RCA 溶液一烧杯中。打开加热装置，将烧杯置于加热磁力搅拌器上搅拌，使 RCA 溶液一加热至 70 摄氏度。然后向 RCA 溶液一烧杯中加入 15 毫升 30% 过氧化氢。务必在加入过氧化氢后一小时内使用 RCA 一溶液。用清水彻底冲洗量杯，并将冲洗液弃置于美国无线电公司（Radio Corporation of America）指定的 RCA 一废液瓶中。RCA 二溶液的配制。使用已准确标定的量筒，向指定的 RCA 2 号烧杯中加入 70 毫升 18 兆欧·厘米的水。接着，加入 15 毫升浓盐酸。用 20 毫升水冲洗量筒，并将冲洗液加入 RCA 2 号烧杯中。调高加热板的温度和搅拌速度，直至溶液达到 70 摄氏度。然后加入 15 毫升 30% 过氧化氢。操作与 RCA 一步法相同。在加入过氧化氢后一小时内使用该溶液。配制氢氟酸溶液时，将50毫升水加入惰性氟化聚合物烧杯中。用塑料量杯量取4毫升浓氢氟酸，然后将其加入惰性氟化聚合物烧杯中。用总共50毫升水冲洗塑料量杯，并将冲洗液加入氢氟酸烧杯中。最后，用水彻底清洗量杯，并将洗涤液倒入指定的氢氟酸废液容器中。将硅片抛光面朝上放置在柔软的表面（如纸巾）上，然后将硅片切割成芯片。使用金刚石尖刻划笔，沿着晶圆主平面边缘的底部轻轻划痕。在划痕下方放置一根细金属丝（如回形针），然后用手指或镊子在划痕两侧轻轻施加压力，同时用铅笔和直尺在另一张纸巾上向下按压，使晶圆断裂。通过在纸巾的顶部和底部标记点来测量所需方块的宽度。将晶圆的一半以边缘朝下对准纸巾上的测量线，紧贴线条放置，并重复切割操作。新断裂的垂直片状部分的宽度应与齿状方块的宽度一致。然后将晶圆在纸巾上水平旋转，将其置于垂直线之间，再次重复切割步骤。当 RCA 溶液达到适当温度后，使用直径为 2 英寸的倒置氟化聚合物篮子，将 8 到 10 片尺寸为 1 厘米 × 1 厘米的硅片浸入溶液中，处理 10 到 20 分钟，然后提起装有硅片的篮子并沥干。随后将篮子移至废液烧杯上方，用 18 兆欧·厘米的水充分冲洗。将冲洗烧杯浸入水中，并上下晃动 20 秒。将篮子取出并倒空，然后在废液烧杯上方用水彻底冲洗。RCA一次清洗完成后，将篮子放入盛有氢氟酸溶液的烧杯中浸泡10至20秒。用轻柔的上下移动方式使芯片与氢氟酸充分混合。然后提起浸入桶，使氢氟酸完全排净。将清洗烧杯放入塑料容器中并冲洗烧杯。将篮子移至冲洗烧杯上方，用18兆欧·厘米的水进行冲洗。将篮架浸入清洗液中，在烧杯内搅动20秒。接着，用18兆欧·厘米的水完成第二次沥干和冲洗循环。将清洗水倒入冲洗烧杯中，并重新用水注满清洗烧杯。当 RCA 双溶液达到适当温度后，使用篮子将硅片浸入溶液中。将硅片在溶液中放置 10 至 20 分钟。在适当时间后取出硅片，并按照相同的冲洗步骤进行操作。对于RCA处理，可将洁净的芯片置于洁净小瓶中的高纯度水中保存最多三天，以用于硅表面自组装单分子层的形成。向一个洁净的反应小瓶中加入1,980 µL的18兆欧·厘米水和20 µL的APTES，轻轻涡旋混合。配制好的溶液应立即使用。将一片洁净的硅芯片反光面朝上放入闪烁小瓶中，盖上盖子，静置20分钟。使用镊子取下芯片，用200微升水冲洗，然后用氮气流吹干一分钟。将DNA折纸结构沉积到APT测试功能化的硅基底上时，先短暂混匀DNA折纸小管，再用移液器吸取四微升溶液滴加到硅基底表面。静置一定时间，具体时长取决于所用浓度和期望的覆盖密度。然后用100 µL无菌18兆欧·厘米水冲洗基底，并用氮气流吹干。再加入100 µL无菌水，重复冲洗1分钟，随后用氮气吹干基底3分钟。以下展示了在基底覆盖率上改变DNA折纸浓度的代表性结果。浓度增加可提高MICA基底上的覆盖度，DNA折纸结构在MICA和硅基底上的覆盖表现出较高的初始吸附，约一小时后达到饱和。在相同浓度和时间条件下，MICA上的覆盖率始终高于功能化硅基底样品。冲洗和干燥步骤对于DNA折纸样品的成功制备至关重要。冲洗和干燥不充分可能导致 DNA 折纸结构中溶剂聚集岛的形成，或在高覆盖率样品上出现纳米结构桥接现象。一旦掌握，Micah 基底制备技术可在 20 分钟或更短时间内完成。若操作得当，硅片样品可在两小时以内完成制备。电子束光刻和分子剥离技术可与该工艺结合，用于创建新颖的图案和器件，以开展进一步的实验。请注意，使用氢氟酸具有极高的危险性，在进行此操作时，务必采取适当的预防措施，例如佩戴个人防护装备，并备有葡萄糖酸钙应急用品。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

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用于DNA折纸分析与实验的云母和硅基底的制备

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