Name: 生物膜荧光探针力:受体 - 配体动力学并行和定量结合诱导细胞内信号作用于单细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 了解生物膜荧光探针技术，用于单细胞水平同时测量受体-配体结合动力学与钙信号传导。该方法利用生物素化红细胞作为力传感器，结合功能化微珠，为研究T细胞机械转导机制提供强大工具。

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本论文相关研究及朱实验室中fBFP技术的开发得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI044902、AI077343、AI038282、HL093723、HL091020、GM096187和TW008753的支持。我们感谢Evan Evans发明了这一强大的实验工具，并感谢Evans实验室成员Andrew Leung、Koji Kinoshita、Wesley Wong和Ken Halvorsen在构建BFP过程中的帮助。同时感谢朱实验室其他成员Fang Kong、Chenghao Ge和Kaitao Li在仪器开发方面的协助。

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
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<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突可披露。

一次成功的fBFP实验需要考虑几个关键因素。首先，为了确保力的计算可靠，微移液管、红细胞（RBC）和探针小球应尽可能接近同轴对齐。红细胞在移液管内的投影长度应约为一个探针移液管的直径，以使红细胞与移液管之间的摩擦可忽略不计。对于典型的人类红细胞，最佳移液管直径为2.0–2.4 µm，此条件下方程117,30的拟合效果最佳。其次，为了确保在力钳实验和热波动实验中的测量主要针对单个分子键，必须将黏附频率维持在20%以下10,13,30。在此过程中，应严格控制非特异性黏附（通常通过BSA充分封闭将非特异性黏附控制在&#60;5%）。此外，仅应从具有单一力下降事件的黏附记录中收集数据——这是单分子行为的典型特征（类似于单分子FRET中荧光的单步消失现象）。第三，荧光染料的加载浓度应根据具体情况优化，以获得最佳成像质量。第四，在每次实验前，必须仔细评估染料加载对T细胞或其他目标细胞的毒性。例如，应测量并比较染料加载前后受体-配体相互作用的结合亲和力。如果染料加载导致结合亲和力发生显著变化，则需考虑更换染料或调整加载浓度。第五，建议使用末端生物素标记的蛋白质，以便实现方便、特异且牢固的偶联，同时保持蛋白质...

细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的黏附由细胞表面受体、ECM蛋白和/或脂质之间的结合介导1结合使细胞能够形成功能性结构1，以及识别、交流和响应环境1-3. 与可溶性蛋白质不同（例如，细胞因子和生长因子）从三维（3D）液相结合到细胞表面受体，而细胞黏附受体则通过狭窄的连接间隙与其配体结合，连接两个相对的表面，从而在二维（2D）界面上限制分子扩散4-7与传统结合实验通常测量的三维动力学相比（例如，表面等离子共振（SPR），二维动力学必须通过原子力显微镜（AFM）等专门技术进行定量分析8-10，流室11,12，微量移液器13,14，光镊15 和生物膜力探针（BFP）16-21.
不仅仅是为细胞凝聚提供物理连接，黏附分子还是细胞与其周围环境进行通讯的信号机制的重要组成部分。目前，人们越来越关注配体与黏附分子结合如何启动细胞内信号传导，以及初始信号如何在细胞内传递。直观来看，受体-配体结合的特性可能会影响其所诱导的信号。然而，由于传统生化检测方法存在诸多局限性，难以通过这些基于群体反应的实验手段解析细胞外相互作用与细胞内信号事件之间的机制性关系。 例如，时间分辨率较差，且完全缺乏空间分辨率。现有的可在活细胞上同时实现生物物理（二维受体-配体结合动力学）和生化（信号转导）观测的方法，包括可调节刚度的基底22弹性体微柱阵列23 并整合了荧光检测功能的流室/微流控装置24-26然而，信号传导和受体-配体结合的读数通常需要通过不同方法分别获取，这使得解析结合特性与信号事件之间的时间和空间关系变得困难。
传统的BFP是一种具有高时空分辨率的超灵敏力谱技术17使用一种可变形的红细胞（RBC）作为力传感器，可实现对单分子二维动力学、力学特性及构象变化的测量14,16,19-21,27-29基于荧光成像的蓝光荧光蛋白（fBFP）可在单分子水平上将受体-配体结合动力学与结合触发的细胞信号传导相关联。通过该实验装置， 原位 在T细胞中观察到表面机械刺激条件下的细胞信号转导活动27fBFP 具有广泛的应用性，可用于研究其他分子在其他细胞中介导的细胞黏附和信号传导。

<table><tbody><tr><td>磷酸二氢钠一水合物（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>磷酸盐缓冲液的制备</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>磷酸盐缓冲液的制备</td></tr><tr><td>碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液的配制</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% 缓冲液配制</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% 缓冲液配制</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% 缓冲液配制</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5% 缓冲液配制</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>珠粒功能化</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>红细胞生物素化</td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>红细胞渗透压调节</td></tr><tr><td>氢氧化铵（NH₄OH）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>玻璃珠硅烷化</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>玻璃珠硅烷化</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢（H₂O₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J. T. Barker</td><td>1986年1月</td><td>玻璃珠硅烷化</td></tr><tr><td>乙酸（冰醋酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>玻璃珠硅烷化</td></tr><tr><td>3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>玻璃珠功能化</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃珠</td><td>Distrilab 颗粒技术</td><td>9002</td><td>玻璃珠功能化</td></tr><tr><td>链霉亲和素&amp;minus;马来酰亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>玻璃珠功能化</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>配体功能化</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>细胞内钙荧光染料加载</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>细胞内钙荧光染料负载</td></tr><tr><td>Quantibrite PE 珠</td><td>BD 生物科学</td><td>340495</td><td>密度定量</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>BD LSR II</td><td>密度定量</td></tr><tr><td>毛细管 0.7-1.0 mm x 30 英寸</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>微移液管制作</td></tr><tr><td>弗拉明/布朗微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>微量移液器制作</td></tr><tr><td>移液管微力器</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>玻璃微量移液管制作</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>显微注射器</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309602</td><td>腔室组件</td></tr><tr><td>微量移液器支架</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>腔室组装</td></tr><tr><td>使用数控加工自制机械部件和适配器&amp;nbsp;</td><td>生物物理仪器</td><td>所有部件均根据 CAD 设计进行定制。</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>显微镜（TiE 倒置）</td><td>尼康</td><td>MEA53100</td><td>BFP 系统</td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 40倍物镜（数值孔径0.75，工作距离0.72 mm，弹簧）</td><td>尼康</td><td>MRH00401</td><td>BFP 系统</td></tr><tr><td>相机，GE680，640 × 480，GigE，1/3&quot; CCD，单色</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445，1/3&quot;，C接口，1280 × 960，单色，CCD，12位ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>手动亚微米探头，配备高分辨率远程控制</td><td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>BFP 系统</td></tr><tr><td>防振台（5&amp;rsquo; × 3&amp;rsquo;)</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>三维手动平移台</td><td>纽波特</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD 软件</td><td>SOLIDWORKS 公司</td><td>版本 2012 SP5</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>LabVIEW 软件</td><td>国家仪器公司</td><td>版本 2009</td><td>BFP系统，BFP程序</td></tr><tr><td>三维压电平移台</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP 系统</td></tr><tr><td>线性压电驱动器</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP系统</td></tr><tr><td>Micromanager 软件</td><td></td><td>版本 1.4</td><td>fBFP系统，荧光成像程序</td></tr><tr><td>双卡（DC-2）</td><td>Photometrics</td><td>77054724</td><td>fBFP 系统</td></tr><tr><td>双通道Cam发射滤光片（T565LPXR）</td><td>Photometrics</td><td>77054725</td><td>fBFP系统</td></tr><tr><td>荧光相机</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP系统</td></tr><tr><td>塑料石蜡膜（Parafilm）</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>瓶口密封</td></tr><tr><td>碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（pH 8.5）</td><td></td><td></td><td>8.4 g/L 碳酸钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)，10.6 克/升碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（pH 6.5–6.8）</td><td></td><td></td><td>27.6 g/L 磷酸二氢钠 (NaH₂PO₄)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)，28.4 g/L 无水磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>N2-5% 缓冲液（pH 7.2）</td><td></td><td></td><td>20.77 g/L 氯化钾（KCl），2.38 g/L 氯化钠（NaCl），0.13 g/L 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)，0.71 克/升无水磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)，9.70 g/L 蔗糖</td></tr></tbody></table>

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

膜受体与配体的相互作用介导了多种细胞功能。这些分子相互作用所引发的结合动力学及下游信号转导可能受到结合与信号发生所处力学环境的影响。最近一项研究表明，机械力可调控T细胞受体（TCR）对抗原的识别及其激活过程。这得益于我们开发并命名为荧光生物膜力探针（fBFP）的一项新技术，该技术结合了单分子力谱与荧光显微镜技术。fBFP利用超软的人类红细胞作为灵敏的力传感器，配合高速相机和实时成像追踪技术，在力、空间和时间分辨率上分别达到约1 pN（10-12 N）、约3 nm和约0.5毫秒。利用fBFP，可在施加力学调控的条件下精确测量单个受体-配体结合动力学，同时在单个活细胞上成像结合所触发的细胞内钙信号。该新技术可用于研究其他细胞中在力学调控下的膜受体-配体相互作用及其信号转导过程。

BFP 技术由 Evans 实验室于 1995 年首次建立17。这种皮牛顿力测量工具已被广泛用于检测固定在表面的蛋白质之间的相互作用，以分析黏附分子与其配体相互作用的二维动力学16,19,20,30，测量分子弹性21,29，以及确定蛋白质的构象变化21。对于荧光 BFP（fBFP），需额外配备一组与落射荧光相关的设备及其配套软件系统（表 1）（图 1A–C）。
fBFP 系统由硬件系统（光学、机械和电气组件）和软件系统（表1 和 图1A、B）组成。该系统的主体是一台倒置显微镜（图1A，中间），配备可实现明场和落射荧光显微成像的光学组件，实验载台和移液器操纵器安装于其上。荧光光源控制器（图1A，左上角）用于提供交替激发光。双相机系统“DC2”将光束分为两路，分别传...

我们介绍一种技术，可同时在单个T淋巴细胞中测量受力调控的单受体-配体结合动力学，并实时成像钙信号传导。

膜受体-配体相互作用介导多种细胞功能。这些分子相互作用所引发的结合动力学及下游信号转导……

本实验的总体目标是同时测量受体样结合，并观察单个细胞上由结合诱导的钙信号传导。该目标首先通过分离生物素并调节人红细胞（RBCs）的渗透压，将其用作超灵敏的力传感器来实现。第二步是功能化微米级玻璃珠，包括清洗、扩张和配体包被。接下来，分离T细胞并与钙离子荧光染料Fluo-2 AM孵育，以观察细胞内钙离子浓度。最后一步是制备实验腔室中的微移液管，这是实验装置所必需的。最终，采用荧光生物膜力探针（BFP）技术，以展示细胞与配体包被微球之间的黏附作用，测量受体-配体结合动力学，同时监测细胞内钙离子水平。该技术有助于理解T细胞如何通过雄激素识别来感知机械力。与现有方法相比，该技术的主要优势在于FBIP能够同时测量受体-配体结合动力学和细胞内信号传导。本实验方案的难点包括手动制备直径合适的微管尖端、使用微管尖端捕获细胞和珠子以及组装力探针，这些步骤在初次操作时可能失败，尽管他未能亲临现场进行本视频的演示。共同作者 Arnold G 在我的实验室中最近完成了博士学位，对 FBAP 方案的初始制备验证做出了重要贡献。从指尖采血 8 到 10 微升，并加入到 1 毫升碳酸氢盐缓冲液中，涡旋混匀或用移液器吹打混合，然后在 900 ×g 条件下离心 1 分钟。弃去上清液后，用碳酸氢盐缓冲液再洗涤一次。接下来，取10 µL所得的红细胞压积，与171 µL碳酸氢盐缓冲液及1049 µL生物素-PEG-NHS交联剂溶液混合，室温孵育30分钟。采用与之前相同的洗涤步骤，先用碳酸氢盐缓冲液洗涤所得红细胞混合物一次，再用N2 5%缓冲液洗涤两次。接下来将制霉菌素稀释到 N2 5% 缓冲液中。为配制终浓度为每毫升 40 微升的溶液，取 5 微升生物素化红细胞与 71.4 微升制霉菌素溶液混合，并在 0 摄氏度下孵育 1 小时。最后，用 N2 5% 缓冲液洗涤样品两次，将生物素化红细胞重悬于含 0.5% BSA 的 N2 5% 缓冲液中，置于冰箱保存。将一段三英寸的微量移液管安装到微量移液管拉制仪上。点击拉制按钮，使毛细管中部被仪器加热，同时两端被拉伸，形成两根具有尖端的毛细管，即为原始移液管。随后将原始移液管安装到显微移液管拉制仪的移液管 holder 上，启动加热以熔化 forge 上的玻璃小球。将原始移液管的尖端插入玻璃小球内部。冷却玻璃球，然后从外部拉动毛细管使其断裂，将管尖留在球内。重复此操作，直至获得所需孔径的管尖。首先使用玻璃切割器将40毫米×22毫米×0.2毫米的盖玻片切割成两块40毫米×11毫米×0.2毫米的片状。细胞腔室构建在一个自制腔室支架的基础上，该支架由两个金属方块和连接它们的手柄组成。使用胶水将一片盖玻片粘在腔室支架的底面，使其跨越两个金属方块。同样，将另一片盖玻片粘在顶面，从而形成一个平行的盖玻片细胞腔室。接下来，用移液器在两片盖玻片之间注入 200 µL 实验缓冲液。确保缓冲液与两张盖玻片均接触。轻轻旋转并摇动样品室，使缓冲液接触样品室两端。然后小心地向样品室两侧注入矿物油，位于实验缓冲区的两侧，从而将缓冲液与空气隔绝密封。注入含有探针的悬浮液。微珠分别为缓冲区上部、中部和下部区域的条形码和靶标。开始BFP实验时，打开显微镜和光源。将腔室放置在显微镜主载物台上。下一步是安装BFP的全部三根微移液管。左侧的探针用于抓取一个红细胞。右侧的目标是捕获细胞，右下方的辅助工具用于抓取微珠进行安装。使用显微注射仪将实验缓冲液回填至显微移液管中。将显微移液管从移液管架上取下，并将其置于较低位置，使液体从尖端滴下。迅速将显微移液管插入持针器尖端，确保无气泡进入显微移液管内。插入过程中，拧紧固定夹螺丝，然后将每个移液器固定夹安装到相应的显微操作器上。推动微移液管朝向记录室，使其尖端进入记录室的缓冲液区域。调整微移液管的位置，并在显微镜视野下找到它们。移动培养室支架载物台，找到三种组分的克隆。逐一通过旋转操纵器旋钮调节相应微量移液管的位置，使微量移液管的尖端接近单个细胞或微珠，并吸取该细胞或微珠。通过调节相应微量移液管内的压力，使三根微量移液管分别捕获对应的组分。移动培养室支架载物台，找到一个远离已注射元素菌落的空旷区域，用于进行实验。切换显微镜的观察模式，以便在计算机程序中查看图像。将移液器尖端上的三个元素全部移入程序的视野范围内。接下来，对齐探针微珠与红细胞，小心地将探针微珠移动至红细胞的顶端。短暂地将微珠轻触红细胞表面，然后轻轻回撤，同时调节辅助微移液管的压力，轻柔地将微珠吹离，使其粘附在红细胞的顶端。移开辅助移液管，并在程序中对齐目标细胞与探针微珠。在视野窗口中，使用程序工具测量探针微移液管、红细胞以及红细胞与探针微珠之间圆形接触区域的相应半径。这些数值可用于根据文本方案中列出的公式估算红细胞的弹簧常数。将所需的红细胞弹簧常数输入程序后，在红细胞顶点处绘制一条水平线，这将在相邻窗口中生成一条曲线，显示每个像素的亮度。沿此方向，将阈值线拖动至曲线深度的大约一半位置。然后，选择所需的实验模式：热波动检测黏附频率实验、黏附频率检测实验或力钳实验。根据需要设置参数。单击“开始”，程序将控制目标移液器移动，并驱动目标与探针接触和分离，同时进行数据采集，并行记录微珠探针的实时位置。通过单击“停止实验”按钮来终止程序，此时将弹出一个窗口。若要保存采集的数据，请启用BFP系统的荧光功能，打开由独立程序控制的激发光源和荧光相机。然后选择荧光成像的参数，包括增益、曝光和激发通道。按照BFP实验方案中的所有准备步骤操作，包括对准探针与目标，以便观察到由340纳米或380纳米激发光激发的目标细胞的活体荧光图像。使用切片工具大致划分出细胞在整个记录期间将保持在内的区域。接下来，同时点击“记录”并开始点击。“记录”功能允许340纳米和380纳米的光交替激发细胞内荧光染料，每秒左右交替记录一对相应的荧光图像。单击“开始”将启动用于分析分子相互作用的BFP实验，以及用于监测细胞内钙信号的荧光成像实验，随后按照文本方案中所述步骤进行数据分析。在力-时间原始数据曲线中，力的数值是通过追踪探针微珠位置变化获得的。在无黏附事件中，当靶细胞从微珠表面回缩后，力-时间反向信号中的力将回到零值。相反，在断裂力事件中，黏附表现为在回缩过程中力迅速上升至正值，随后迅速下降回零。在寿命事件中，正向力会被钳制，形成一个平台期，该平台期的长度即为寿命。通过重复进行VFP实验循环，将获得一条力-时间曲线。图中显示了在340纳米和380纳米光通道激发下，一个或两个负载T细胞的荧光图像。两幅图像均显示出细胞清晰的轮廓，表明细胞染色良好。在从T细胞获得结合动力学数据和荧光数据后，累积寿命曲线和钙离子水平曲线将在同一图中呈现，以寻找二者之间的相关性。现在您应该已经充分了解如何进行A-F-B-I-P实验。在该实验过程中，务必检查力探针是否存在任何缺陷，例如微移液管的直径、橡胶细胞突起的长度以及微珠的位置。所有这些因素都将影响力测量的准确性。该技术为分子力学生物学领域的研究人员探索各种可能的生物系统中机械转导的机制铺平了道路。

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生物膜荧光探针力：受体 - 配体动力学并行和定量结合诱导细胞内信号作用于单细胞

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

本视频展示了利用荧光涨落光谱技术检测细胞间接触处细胞表面蛋白相互作用的方法。通过表达带有荧光蛋白标记的跨膜黏附受体，并混合携带两种光谱可区分荧光标记的不同细胞群体，可评估相邻细胞间不同颜色荧光标记受体之间的跨膜相互作用。 通过...

利用荧光涨落光谱研究细胞接触处的蛋白质相互作用

在本视频中，使用生物膜力探针（BFPs）来测量受体与配体之间的相互作用力。该技术通过监测破坏探针微球上偶联的pMHC与靶细胞上的TCR之间结合所需的压强，从而检测分子间的相互作用。...

生物膜力探针定量受体-配体相互作用

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。...

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本方案描述了一种基于荧光涨落光谱的方法，用于研究介导细胞间相互作用的蛋白质之间的相互作用。 即...

一种用于检测细胞间接触处蛋白质-蛋白质相互作用的荧光涨落光谱分析方法

我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&amp;B）分析。...

结合全内反射荧光显微镜与数目和亮度分析法研究活细胞中细胞表面受体的寡聚化动态

本方案介绍了一种在细胞环境中实时测量腺嘌呤核苷酸与受体结合的方法。该结合过程通过三硝基苯基核苷酸衍生物与标记了非天然荧光氨基酸的蛋白质之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。...

实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

我们介绍一种利用微图案阵列获取单细胞荧光报告信号时间序列的方法。本方案详细描述了单细胞阵列的制备、活细胞扫描式延时显微镜的设置与操作，以及一个开源图像分析工具，用于对每个黏附位点的细胞整合荧光时间序列进行自动预筛选、可视化质控和追踪分析。...

活细胞成像单细胞阵列（LISCA）——一种用于定量细胞动力学的多功能技术

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

本文介绍了一组用于表征蛋白质与细胞或微囊泡膜相互作用的方法。...

使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用

了解生物膜荧光探针技术，用于单细胞水平同时测量受体-配体结合动力学与钙信号传导。该方法利用生物素化红细胞作为力传感器，结合功能化微珠，为研究T细胞机械转导机制提供强大工具。

荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析

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